槲皮素對H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的 保護(hù)作用及機(jī)制研究

易鵬吉 張哲宇 彭偉軍

〔摘要〕 目的 探討槲皮素對H2O2損傷的大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤（PC12）細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制。方法 先選取不同濃度H2O2（100、200、300、400、500 μmol/L）干預(yù)PC12細(xì)胞，確定氧化損傷模型的條件，然后將PC12細(xì)胞分為對照組、模型組和槲皮素（6.25、12.5、25 μmol/L）組。通過MTS法、Hoechst染色法檢測細(xì)胞存活和凋亡;鏡下觀察細(xì)胞形態(tài);免疫熒光檢測8-羥脫氧鳥苷（8-OHdG）;ELISA法檢測丙二醛（MDA）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH）;Western blot法檢測B淋巴細(xì)胞瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、蛋白激酶B（Akt）和磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）表達(dá)水平。結(jié)果 與對照組相比，模型組用500 μmol/L H2O2干預(yù)6 h后，細(xì)胞存活率下降至50%（P<0.01），凋亡率上升為38%（P<0.01）;鏡下可見細(xì)胞萎縮變圓;8-OHdG表達(dá)增加（P<0.05）;GSH活性降低，MDA含量升高（P<0.05）;Bcl-2、Akt、p-Akt表達(dá)減少，Bax表達(dá)增加（P<0.05）。與模型組相比，槲皮素各濃度組細(xì)胞存活率均上升（P<0.05），凋亡率下降（P<0.01）;細(xì)胞突觸再現(xiàn);8-OHdG表達(dá)降低（P<0.05）;GSH活性升高，MDA含量下降（P<0.05）;Bcl-2、Akt、p-Akt蛋白上調(diào)，Bax蛋白下調(diào)（P<0.05）。結(jié)論 槲皮素能拮抗H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷，其作用機(jī)制可能與Akt調(diào)控的通路以及抗氧化酶的相關(guān)作用有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 槲皮素;PC12細(xì)胞;氧化應(yīng)激;凋亡;蛋白激酶B

〔中圖分類號〕R277.7? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.06.001

Protective Effect and Mechanism of Quercetin on H2O2-induced PC12 Cell Injury

YI Pengji， ZHANG Zheyu， PENG Weijun*

（Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， The Second Xiangya Hospital，

Central South University， Changsha， Hunan 410011， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the protective effect and its mechanisms of quercetin in rat pheochromocytoma （PC12 cell） cell injury stimulated by H2O2. Methods Different concentrations of H2O2 （100， 200， 300， 400， 500 μmol/L） were used to interfere with PC12 cells to construct oxidative stress model， then the experiments were divided into control group， model group and quercetin group （6.25， 12.5， 25 μmol/L）. The cell survival and apoptosis were detected by MTS and Hoechst， respectively. Morphology was observed by microscope， and 8-hydroxydeoxyguanosine （8-OHdG） expression was measured by immunofluorescence. Furthermore， the levels of malondialdehyde （MDA） and glutathione （GSH） were assayed by ELISA and the expression levels of B-cell lymphoma-2 （Bcl-2）， Bcl-2 associated X protein （Bax）， protein kinase B （Akt）and phosphorylated protein kinase B （p-Akt） were evaluated by Western blot. Results After constructed via 500 μmol/L H2O2 for 6 h， compared with the control group， cell survival rate in model group was decreased to 50% （P<0.01）， apoptosis rate was increased to 38% （P<0.01）; microscopically， the cells became round and atrophic; 8-OHdG expression increased （P<0.05）; GSH activity was reduced， and the content of MDA was increased （P<0.05）; Bcl-2， Akt and p-Akt expression levels were decreased， and Bax expression was increased （P<0.05）. Compared with the model group， the cell survival rate of quercetin groups increased （P<0.05） and apoptosis rate decreased （P<0.01）; cell synapse reappeared; the expression of 8-OHdG decreased （P<0.05）; the level of GSH increased and the level of MDA decreased （P<0.05）; the expression levels of Bcl-2， Akt and p-Akt were up-regulated， and the expression of Bax was down-regulated （P<0.05）. Conclusion Quercetin could relieve oxidative damage of PC12 cells induced by H2O2. Its mechanism may be related to Akt regulated pathway and the related effects of antioxidant enzymes.

〔Keywords〕 quercetin; PC12 cell; oxidative stress; apoptosis; Akt

在過去的100年里，人類預(yù)期壽命的增加使得與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病發(fā)病率也隨之增加，給社會和公共健康帶來巨大的挑戰(zhàn)[1]。研究者們發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激是神經(jīng)病變中的重要參與者[2]。中樞神經(jīng)細(xì)胞耗氧量大，但本身清除自由基能力較弱[3];當(dāng)體內(nèi)的氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)失衡時，過多的活性氧（reactive oxygen species， ROS）以及相關(guān)的自由基會直接損傷中樞系統(tǒng)，導(dǎo)致DNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等的氧化損傷，從而引起細(xì)胞功能異常甚至凋亡[4-5]。而天然植物的研究發(fā)現(xiàn)三七、姜黃素等中藥及復(fù)方具有抗氧化作用[6]。因此，尋找天然的抗氧化藥物并探索其機(jī)制成為神經(jīng)退行性疾病治療的研究熱點(diǎn)。

槲皮素（quercetin），又名櫟精。大量研究[7-8]表明槲皮素可以通過減少氧化應(yīng)激、干擾腎素-血管緊張素系統(tǒng)、下調(diào)活性氧信號通路等方式發(fā)揮抗氧化、抗炎、抗腫瘤等藥理作用。Ben Salem等[9]發(fā)現(xiàn)槲皮素可以保護(hù)HCT116細(xì)胞免受敵敵畏的氧化損傷;Natsumel等[10]細(xì)胞實驗證實槲皮素可以減少ROS的產(chǎn)生;李陽等[11]證明槲皮素可以拮抗糖尿病大鼠的氧化損傷。雖然大量研究資料已證實槲皮素的抗氧化作用，但其在神經(jīng)系統(tǒng)的抗氧化作用有待進(jìn)一步闡釋。因此，本研究擬通過復(fù)制H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷模型，探索槲皮素的抗氧化作用及其可能機(jī)制。

1 材料

PC12細(xì)胞株（批號：GDC0006，中國科學(xué)院武漢細(xì)胞庫）;30% H2O2試劑（批號：20180611，國藥集團(tuán)有限公司）;槲皮素（批號：18112703，成都普菲德生物技術(shù)有限公司）;胎牛血清（批號：A3160802，美國Gibco公司）;MTS試劑[批號：G3580，普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司];凋亡染色試劑（批號：C1022，上海碧云天生物技術(shù)公司）;丙二醛（MDA）試劑盒（批號：FY8503-13）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH）試劑盒（批號：FY3477-13）均購于江蘇菲亞生物技術(shù)公司;8-OHdG（批號：ab62623，美國Abcam公司）;Bcl-2（批號：2772S）、Bax（批號：15071S）、Akt（批號：2920S）、p-Akt（批號：12694S）均購于美國CST公司。

2 方法

2.1? 細(xì)胞培養(yǎng)

PC12細(xì)胞株置于含完全培養(yǎng)基（90% DMEM培基+10%的胎牛血清+1%雙抗）的培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5% CO2環(huán)境培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時，傳代處理。

2.2? 建立H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷模型

將密度為5×104 mL的細(xì)胞接種于96孔板中培養(yǎng)。實驗設(shè)置對照組、模型組（100、200、300、400、500 μmol/L的H2O2）。按分組培養(yǎng)6、12、24 h，在設(shè)定的時間里，棄去原有的培基，每孔加入100 μL含20% MTS試劑的新鮮培基，在37 ℃孵育30 min后用酶標(biāo)儀測定490 nm處的吸光值（OD），計算細(xì)胞存活率。

2.3? 槲皮素對H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的影響

實驗設(shè)置對照組（無任何處理）、模型組（500 μmol/L H2O2）、槲皮素組（H2O2+槲皮素，其中槲皮素濃度分別為6.25、12.5、25、50 μmol/L），共6組。槲皮素組按設(shè)置的濃度預(yù)處理2 h;然后模型組加入500 μmol/L的H2O2，槲皮素組則加入用500 μmol/L H2O2配置的不同濃度槲皮素繼續(xù)培養(yǎng)6 h;棄去舊培基，加入MTS試劑孵育后測定OD，計算細(xì)胞存活率。

存活率=[（OD實驗組-OD空白組）/（OD對照組-OD空白組）]×100%

2.4? 細(xì)胞形態(tài)觀察

將生長期的PC12細(xì)胞以1×106 mL密度接種于6孔板，每孔2 mL。實驗設(shè)置對照組（無任何處理）、模型組（500 μmol/L H2O）、槲皮素組（H2O2+槲皮素，其中槲皮素濃度分別為6.25、12.5、25 μmol/L），共5個組。槲皮素組按濃度預(yù)處理2 h后，模型組加入500 μmol/L的H2O2，槲皮素組則加入500 μmol/L H2O2配置的不同濃度槲皮素培養(yǎng)6 h，用倒置生物顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并采集圖像。

2.5? Hoechst染色檢測細(xì)胞凋亡

按照“2.4”項方法處理后，使用PBS清洗3遍，加入800 μL的4%多聚甲醛，室溫下固定20 min，加入1 mL的Hoechst 33342試劑孵育（37 ℃，避光，20 min），清洗后采集圖像。

2.6? ELISA法檢測相關(guān)的氧化指標(biāo)

按照“2.4”項方法處理后，用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下，轉(zhuǎn)移至EP管，冷水浴中超聲波破碎10 min，隨后4 ℃，12 000 r/min，離心10 min（離心半徑134 mm），吸取上清備用，按照試劑盒說明書進(jìn)行GSH活性和MDA含量的測定。

2.7? 免疫熒光檢測8-OHdG表達(dá)

PC12細(xì)胞爬片后，設(shè)置3個組：對照組（無任何處理）、模型組（500 μmol/L H2O2）、槲皮素組（H2O2+槲皮素，其槲皮素濃度為25 μmol/L）;25 μmol/L槲皮素干預(yù)2 h后，模型組加入500 μmol/L的H2O2，槲皮素組則加入含500 μmol/L H2O2和25 μmol/L槲皮素培養(yǎng)6 h;棄去舊培基，清洗3次，室溫下使用4%多聚甲醛固定;隨后清洗3遍進(jìn)行通透（0.1% Triton X-100）;再次清洗，加入5%牛血清白蛋白封閉1 h（恒溫箱37 ℃）;封閉完成后在一抗（8-OHdG）液中4 ℃孵育過夜;熒光二抗孵育1 h（37 ℃，避光）;DAPI染核，最后采集圖像。

2.8? Western blot法檢測凋亡蛋白

按照“2.4”項方法處理后，預(yù)冷PBS清洗2遍，刮下細(xì)胞在冰盒上充分裂解，30 min后離心取上清液，取一部分上清液按照BCA法測試蛋白濃度，另一部分則變性后于-20 ℃保存。按照說明書配制10%的聚丙烯酰胺凝膠，電泳90 min、轉(zhuǎn)膜90 min，封閉1 h（5%脫脂奶粉），一抗稀釋液4 ℃搖床過夜，TBST液清洗3遍，二抗稀釋液室溫孵育1 h，TBST液清洗3遍后顯影成像。

2.9? 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用“x±s”描述，選用單因素方差分析，方差齊者，多重比較采用Bonferroni兩兩比較，方差不齊者，多重比較采用Dunnetts T3兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的適宜濃度和干預(yù)時間

干預(yù)6 h時，與對照組比較，100 μmol/L的H2O2對PC12細(xì)胞損傷不明顯，200～500 μmol/L時，細(xì)胞受到氧化損傷，存活率下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;在12、24 h時，相較于對照組，所有H2O2濃度組的細(xì)胞存活率均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），考慮藥物可能與H2O2反應(yīng)，故選取500 μmol/L H2O2干預(yù)6 h建立損傷模型。見圖1。

3.2? 槲皮素對H2O2損傷的PC12細(xì)胞活力的影響

與對照組比較，僅接受H2O2干預(yù)的模型組的細(xì)胞存活率降低至50%（P<0.01）;相較于模型組，加入槲皮素后細(xì)胞的存活率隨著槲皮素濃度的增加而逐漸升高，槲皮素25 μmol/L組存活率達(dá)到最高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），槲皮素50 μmol/L組存活率下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖2。

3.3? 槲皮素對H2O2損傷的PC12細(xì)胞的形態(tài)影響

對照組細(xì)胞貼壁牢固，細(xì)胞胞體飽滿，以梭形為主，少數(shù)呈圓形、三角形，突起光滑粗大;模型組則脫壁細(xì)胞增多，胞體萎縮變圓，突觸變短、斷裂，甚至消失。而在槲皮素各組，細(xì)胞形態(tài)得到明顯的改善，隨著藥物濃度的增加，脫壁、萎縮變圓的細(xì)胞減少，具有完整結(jié)構(gòu)的細(xì)胞增多，突觸重新長出。見圖3。

3.4? 槲皮素對H2O2損傷的PC12細(xì)胞的凋亡影響

對照組的細(xì)胞呈現(xiàn)暗藍(lán)色;模型組呈現(xiàn)藍(lán)白色，細(xì)胞核變形，呈現(xiàn)不規(guī)則化;槲皮素處理后，隨著濃度的增加，細(xì)胞的調(diào)亡得到不同程度的緩解。模型組細(xì)胞的凋亡率是對照組的7倍（P<0.01）。與模型組比較，槲皮素6.25、12.5、25 μmol/L組的細(xì)胞凋亡率明顯降低，分別為10.76%、9.67%、7.25%（P<0.01）。見圖4。

3.5? 槲皮素對H2O2損傷的PC12細(xì)胞8-OHdG表達(dá)的影響

相比對照組，8-OHdG在模型組整體展現(xiàn)出鮮艷的紅色熒光信號，有些細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)具有更強(qiáng)的熒光，量化后為32.39%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;槲皮素25 μmol/L組中，胞質(zhì)內(nèi)8-OHdG紅色熒光信號減弱（22.75%），趨向于對照組（22.04%），與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖5。

3.6? 槲皮素對H2O2損傷的PC12細(xì)胞的MDA含量及GSH活性的影響

相比對照組，模型組的GSH活性降低，MDA含量升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;而在槲皮素組中，不同濃度槲皮素均能改善損傷的PC12細(xì)胞中的GSH和 MDA表達(dá)，與模型組比較，除槲皮素6.25 μmol/L組的GSH表達(dá)差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義外，其余差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖6。

3.7? 槲皮素對H2O2損傷的PC12細(xì)胞Bcl-2、Bax的影響

與對照組相比，模型組的抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平下降（P<0.05），促凋亡Bax水平上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。而槲皮素干預(yù)后，Bax表達(dá)降低，其中槲皮素25 μmol/L組與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，Bcl-2表達(dá)增加，槲皮素12.5、25 μmol/L組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖7。

3.8? 槲皮素對H2O2損傷的PC12細(xì)胞Akt、p-Akt通路蛋白的影響

相比對照組，模型組Akt和p-Akt蛋白表達(dá)水平明顯下降（P<0.05）;與模型組相比，槲皮素各濃度組Akt、p-Akt蛋白表達(dá)水平增加，其中槲皮素25 μmol/L組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖8。

4 討論

氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷是神經(jīng)退行性疾病發(fā)生發(fā)展的重要原因之一。PC12細(xì)胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能與神經(jīng)細(xì)胞高度相似，常被用來進(jìn)行神經(jīng)退行性疾病的研究[12]。H2O2容易穿透細(xì)胞膜，形成的自由基會造成細(xì)胞損傷、凋亡，是常用的氧化損傷試劑[13]。本研究采用不同濃度的H2O2和不同干預(yù)時間誘導(dǎo)PC12細(xì)胞復(fù)制氧化損傷模型，MTS結(jié)果顯示500 μmol/L H2O2干預(yù)6 h時細(xì)胞存活率下降至對照組的50%左右，考慮到H2O2可能會與藥物存在相互作用，故以此條件開展進(jìn)一步實驗。不同濃度的槲皮素干預(yù)后，能夠顯著提高PC12細(xì)胞的存活率，改善PC12細(xì)胞損傷的形態(tài)，其中25 μmol/L達(dá)到最佳的保護(hù)效果。為了對槲皮素保護(hù)作用進(jìn)一步評估，本研究還檢測了氧化指標(biāo)（MDA、GSH、8-OHdG）和凋亡相關(guān)蛋白。

ROS是描述一類由氧的不完全還原而形成的化學(xué)物質(zhì)的總稱，它通過激活線粒體通道釋放細(xì)胞色素C，引起細(xì)胞內(nèi)蛋白和DNA等生物結(jié)構(gòu)的破壞[14]。氧化應(yīng)激指標(biāo)中8-OHdG是內(nèi)源性的DNA損傷的標(biāo)記物，MDA、GSH表達(dá)水平反應(yīng)機(jī)體氧化的損傷程度[15-17]。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞后，8-OHdG表達(dá)增加（P<0.05），MDA含量顯著升高（P<0.05），GSH的活性下降（P<0.05）。槲皮素干預(yù)后，降低了MDA含量和8-OhdG表達(dá)水平（P<0.05），提高了GSH的活性（P<0.05）。這與槲皮素在氧化損傷的MODE-K細(xì)胞、HUVEC細(xì)胞結(jié)果一致[18-19]，推斷槲皮素可以降低細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)、提高抗氧化酶的活性，從而發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用。

ROS引起的損傷最終激活凋亡相關(guān)通路，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。本文結(jié)果證實槲皮素預(yù)處理后能明顯提高PC12的存活率，同時Hoechst染色也進(jìn)一步驗證了其能有效緩解H2O2對PC12細(xì)胞的損傷?？沟蛲龌駼cl-2與促凋亡基因Bax形成異二聚體可以阻斷凋亡信號的傳遞，而Bax自身形成的二聚體可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20]。Akt是多條調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖、凋亡信號的關(guān)鍵環(huán)節(jié)（例如MAPK、PI3K/Akt、Jak/Stat信號通路），并且激活的Akt可以調(diào)控凋亡的級聯(lián)反應(yīng)，抑制Bax、Caspase-9表達(dá)[21-22]。與涂鄂文等[23]研究結(jié)果相符，本文結(jié)果表明不同濃度的槲皮素均可增加Akt、p-Akt、Bcl-2蛋白水平（P<0.05），減少Bax蛋白水平（P<0.05），從而抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

綜上，通過檢測氧化指標(biāo)和凋亡情況，發(fā)現(xiàn)槲皮素可以增加細(xì)胞存活率、GSH活性、Akt、p-Akt和Bcl-2蛋白表達(dá)，減少M(fèi)DA、8-OHdG和Bax的水平，500 μmol/L H2O2造成細(xì)胞的氧化損傷被逆轉(zhuǎn)，而其潛在的作用機(jī)制可能與抗氧化酶相關(guān)作用以及Akt調(diào)控的抑制凋亡通路有關(guān)，進(jìn)一步調(diào)控機(jī)制有待后續(xù)深入探索。

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