基于礦物元素指紋差異的榴蓮產地甄別

周秀雯，吳 浩，陳海泉，顏 治，靳保輝，謝麗琪，趙 燕，趙超敏，陳 輝，潘家榮,

（1.中國計量大學生命科學學院，浙江省海洋食品品質及危害物控制技術重點實驗室，海洋食品加工質量控制技術與儀器國家地方聯(lián)合工程實驗室，浙江 杭州 310018；2.深圳海關食品檢驗檢疫技術中心，廣東 深圳 518054；3.中國農業(yè)科學院農業(yè)質量標準與檢測技術研究所，北京 100081；4.上海海關動植物與食品檢驗檢疫技術中心，上海 200135；5.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176）

榴蓮（Durio zibethinusMurray）是東南亞及臨近島嶼最重要的熱帶季節(jié)性水果之一，最早起源于馬來半島[1]，現多種植于泰國、馬來西亞、柬埔寨等東南亞國家。作為熱帶水果的典型代表，榴蓮有較強的抗氧化特性和生物活性[2-3]，還能有效降低血清膽固醇水平，減少冠心病的發(fā)病率[4]，深受我國消費者的喜愛。然而由于地形氣候等環(huán)境條件限制，榴蓮果樹在中國存活率較低，暫無作為商業(yè)用途的榴蓮引種，因此我國榴蓮主要依賴于進口。據海關總署數據發(fā)布[5]，2019年我國鮮榴蓮進口金額為16.0億 美元，同比增長47%，占整個水果進口市場的16.84%。目前，榴蓮市場判斷榴蓮產地及品種的方法主要依靠專業(yè)人士的感官鑒別[6]，主觀性強，且受外部環(huán)境干擾較大，而我國暫無相關的鑒別標準。市場上不同產地榴蓮的價格差異較大，相比其他產地的榴蓮，馬來西亞榴蓮在色澤、肉質與口感上優(yōu)勢較大，由于運輸成本較高，因而在價格上顯著高于其他產區(qū)，導致某些不良進口商家以假亂真，混淆榴蓮產地以獲得高額利潤。目前馬來西亞商務部門與我國開展了基于電子標簽的溯源研究[7]。泰國、越南等榴蓮出口國暫未報道榴蓮的產地溯源研究和方案，因此，我國進口管理部門亟需開展榴蓮產地溯源的方法，有利于解決我國榴蓮產地造假的現象。

DNA指紋技術、氣相色譜-質譜聯(lián)用技術、近紅外/拉曼光譜分析技術、穩(wěn)定同位素技術以及元素指紋分析等都可用于產地溯源[8]。隨著電感耦合等離子體質譜（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICPMS）技術的發(fā)展，元素指紋作為食品地理來源的判別指標顯示出了較大的優(yōu)勢。其原理是環(huán)境中的水、地質和土壤環(huán)境中礦物元素經過溶解、沉淀、凝聚、絡合、吸附等過程，形成具有不同遷移轉化能力的礦物質，因而在不同地域生長的生物體有其各自的礦物元素指紋特征[9-12]。目前基于ICP-MS的元素指紋分析技術已在葡萄酒[13-17]、茶葉[9,18-21]、大米[22-23]中廣泛應用。而在水果的產地溯源方面，已有文獻報道了菠蘿蜜[24]、柑橘[25]、檸檬[26]、蘋果[27]和香蕉[28]的產地溯源。但目前的研究多針對單品種和小尺度的產地區(qū)分，元素指紋是否適用于多品種以及大尺度的榴蓮產地溯源值得研究。除分析技術外，化學計量學也是食品產地溯源的必要手段。常見主要有基于非監(jiān)督的主成分分析（principal component analysis，PCA）、聚類分析技術以及基于監(jiān)督的判別分析等方法[29]，隨著機器學習算法的興起，決策樹、支持向量機、隨機森林和BP人工神經網絡的應用越來越普遍，且顯示出巨大的優(yōu)勢[20]。

目前對榴蓮產地真實性的研究較少，Siew等[30]從DNA指紋圖譜角度利用簡單重復序列技術區(qū)分馬來西亞榴蓮，但該方法也無法實現國際間產地區(qū)分，國內也未見對進口榴蓮產地甄別的報道。因此，本研究旨在探討基于元素指紋和化學計量學分析（PCA、Fisher逐步判別分析及BP人工神經網絡）實現對主要榴蓮出口國（馬來西亞、泰國、柬埔寨和越南）的產地區(qū)分，以期幫助我國海關部門對進口榴蓮真實性進行監(jiān)管。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

依托深圳海關食品檢驗檢疫技術中心平臺，采集原產地為泰國、馬來西亞、柬埔寨和越南4 個產區(qū)的新鮮帶殼榴蓮樣品共計73 份，以上4 個產區(qū)均為出口榴蓮的主要產區(qū)。具體采樣信息如表1所示。

表1 4 個榴蓮產區(qū)采樣信息Table 1 Information about durian samples from four producing areas

65%濃硝酸（分析純） 德國默克公司；超純水（電阻率＞18.2 MΩ·cm，20 ℃）；含有28 種元素的多元素貯備液（1 000 μg/mL）、Rh內標元素儲備液（1 000 μg/mL）和含有Ba、Be、Ce、Co、Li、Mg、Rh、U的調諧液（10 μg/mL） 美國珀金埃爾默儀器公司；氬氣（Ar，純度99.995%） 美國Air Products公司。

1.2 儀器與設備

8800系列ICP-MS儀 美國安捷倫公司；AG204型電子天平 美國梅特勒-托利多公司；MARSXPress微波消解儀 美國CEM公司；DEENAII系列全自動石墨消解儀美國Thomas Cain公司；Million-Q Integral型超純水系統(tǒng)德國默克公司；JYL-C022E勻漿機 中國九陽集團。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

選取完整的新鮮榴蓮，取榴蓮果肉用高速粉碎機打勻均質，榴蓮果核用超純水洗凈后晾干，用高速粉碎機打勻均質，待測。

1.3.2 樣品消解及元素含量測定

參考GB 5009.268—2016《食品中多元素檢測》[31]方法，準確稱取1.0 g鮮樣（精確至0.001 g）于泡過10%硝酸溶液[13]（避免交叉污染）的聚四氟乙烯消解管中，加入6 mL濃硝酸，置通風櫥過夜；次日放入微波消解儀中消解；消解完畢后用超純水沖洗內蓋；然后置于135 ℃的全自動石墨消解儀中趕酸約0.5 h，冷卻至室溫后轉移定容至25 mL，定容后的樣液過孔徑為0.45 μm水相濾膜后待用。同時做空白實驗。

利用ICP-MS測定樣品中的Li、Be、Na、Mg、Al、Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、As、Se、Rb、Sr、Ag、Cd、In、Cs、Ba、Tl、Pb、Bi和U 28 種礦物質元素含量。

1.4 數據處理

采用SPSS 23.0軟件對不同產地榴蓮的礦物元素進行方差分析、Fisher逐步判別分析及BP人工神經網絡分析，采用MATLAB R2 018a軟件進行PCA，采用OriginPro 2018（Originlab，美國）軟件圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 不同產區(qū)榴蓮果核與果肉礦物元素含量差異分析

如表2所示，所有榴蓮樣品中Mg、Rb、Ca、Fe含量均較高，果核及果肉平均值分別為1 283.959、14.852、100.179、10.878 mg/kg和251.820、13.736、10.606、3.997 mg/kg，Li、Be、V含量較低，果核及果肉平均值分別為4.057、0.793、1.381 μg/kg和1.657、0.523、1.15 μg/kg。In、Ga、Bi、U和Be部分未檢出。通過對泰國、馬來西亞、柬埔寨和越南榴蓮中果肉與果核的28 種元素含量進行方差分析，結果表明榴蓮果核中Li、Be、Na、Mg、Al、V、Mn、Co、Ni、Cu、Zn、As、Rb、Ag、Cd和Tl 16 種礦物元素在4 個產地間存在顯著差異（P＜0.05）（表2），榴蓮果肉中Li、Be、Na、Mg、Al、Mn、Zn、Rb、Sr、Ag、Cd、Ba和Tl 13 種礦物元素在4 個產地間存在顯著差異（P＜0.05）（表2），其余元素含量差異不顯著。馬來西亞榴蓮果核中Li、Al、V、Co和果肉中Mg、Al、Zn、Sr含量高于其他3 個產區(qū)，果核和果肉中的Ag含量顯著低于其他3 個產區(qū)；泰國榴蓮果核中Mg、Mn和果肉中Cd含量顯著高于其他3 個產區(qū)，果核中Co、As、Tl和果肉中As、Se、Tl含量較低；柬埔寨榴蓮果核和果肉中Ag含量高于其他3 個產區(qū)，果核中Be、Al、As和果肉中Mg、Al、Mn、Sr含量較低；越南榴蓮果核中Be、As、Rb和果肉中Rb、Ag、Ba含量高于其他3 個產區(qū)，果核中Li、Na、V、Ni、Cd和果肉中Li、Be、Mg、Zn、Cd含量較低。綜上，不同產區(qū)的榴蓮果核及果肉元素組成及含量都有各自組成特征，適用于榴蓮產地的判別，但數據冗雜，還需進行化學計量學分析。

表2 馬來西亞、泰國、柬埔寨和越南榴蓮礦物元素含量差異分析Table 2 Mineral element contents in durian from Malaysia, Thailand, Cambodia and Vietnam μg/kg

2.2 不同產區(qū)榴蓮果核與果肉礦物元素含量PCA

PCA可通過線性轉換對大量數據進行壓縮，以便進行數據降維[32]。將榴蓮果核中存在顯著差異的16 種礦物元素含量和及果肉中存在顯著差異的13 種礦物元素含量進行PCA，結果如表3所示。PC1方差貢獻率為27.447%，PC2方差貢獻率為18.874%，PC3方差貢獻率為12.580%，PC4方差貢獻率為10.475%，PC5方差貢獻率為8.055%，PC6方差貢獻率為7.775%，前6 個PC的累計方差貢獻率為85.207%，涵蓋了榴蓮中礦物元素的主要信息，減少數據分析復雜性。結合PC得分圖分析，果核的Cu、Ni、Mg、Rb和Zn對PC1貢獻最大，果肉的Ag、Zn、Tl和果核的Tl對PC2貢獻最大，果肉的Ag、Zn和果核的As、Rb對PC3貢獻最大，將PC1、PC2、PC3繪制三維散點圖（圖1），結果顯示PCA可將馬來西亞、泰國、柬埔寨和越南進行較好區(qū)分。由于前3 個PC的累計方差貢獻率僅為58.901%，且地理上看泰國和柬埔寨產區(qū)較為接近，土壤環(huán)境較為類似，導致元素差異較小，因此圖1顯示泰國和柬埔寨有一定重疊。

圖1 4 個產地榴蓮中果核和果肉礦物元素的前3 個PC散點圖Fig.1 Three-dimensional scattering plots of first three principal components for mineral elements in durian stone and flesh from four growing areas

表3 4 個產地果核與果肉中礦物元素PC的方差貢獻率及載荷矩陣Table 3 Variance contribution rates and loading matrixes of principal components for mineral elements in durian stone and flesh from four growing areas

續(xù)表3

2.3 Fisher逐步判別分析和BP人工神經網絡用于榴蓮產地判別

為了進一步了解榴蓮果核和果肉中礦物元素含量指標對4 個產地榴蓮的產地判別作用效果，分別采用Fisher逐步判別分析和BP人工神經網絡構建產地判別模型。將果核中16 種礦物元素（Li、Be、Na、Mg、Al、V、Mn、Co、Ni、Cu、Zn、As、Rb、Ag、Cd和Tl）和果肉中13 種礦物元素（Li、Be、Na、Mg、Al、Mn、Zn、Rb、Sr、Ag、Cd、Ba和Tl）引入判別模型中，篩選重要的建模變量。Fisher逐步判別分析結果顯示29 種礦物元素含量指標中果核Li、Be、Mg、Mn、Rb元素和果肉Be、Ag、Ba元素對產地判別效果顯著，先后被引入到判別方程中，且引入順序為Li果核、Be果核、Ag果肉、Mg果核、Be果肉、Ba果肉、Rb果核、Mn果核，代表這8 項指標對判別函數貢獻率大小，建立的榴蓮產地判別函數如下：

Y馬來西亞=1.049Li果核－0.618Be果核+0.000 005 47Mg果核+0.001Mn果核+0.784Be果肉+0.217Ag果肉+0.007Ba果肉－15.983

Y泰國=－0.533Li果核+3.974Be果核+0.000 015 2Mg果核+0.001Mn果核－0.000 010 5Rb果核－1.431Be果肉+0.791Ag果肉－23.036

Y柬埔寨=－0.46Li果核+3.245Be果核+0.000 014 7Mg果核－0.000 016 4Rb果核－0.302Be果肉+1.015Ag果肉－0.001Ba果肉－21.476

Y越南=－1.319Li果核+13.185Be果核+0.000 020 5Mg果核+0.000 062 4Mn果核－5.043Be果肉+1.373Ag果肉－50.372

式中：Li果核、Be果核、Mg果核、Mn果核、Rb果核、Be果肉、Ag果肉、Ba果肉分別為果核Li、Be、Mg、Mn、Rb和果肉Be、Ag、Ba的礦物元素含量/（μg/kg）；Y馬來西亞、Y泰國、Y柬埔寨、Y越南分別為馬來西亞、泰國、柬埔寨、越南的礦物元素含量/（μg/kg）。

在實際應用中，依據所建立的判別模型，可對上述4 個產地的榴蓮盲樣進行判別分類，將實驗測得的各樣品Li果核、Be果核、Mg果核、Mn果核、Rb果核、Be果肉、Ag果肉、Ba果肉代入上述4 個模型，而盲樣則歸屬于Y值最大的地區(qū)。

將此判別模型對榴蓮樣品進行產地歸類并結合留一交叉檢驗法對模型的有效性進行驗證，結果如表4所示，在初始驗證結果中，柬埔寨和越南榴蓮全部被正確歸類，初始判別準確率為100%；1 個馬來西亞榴蓮被誤判到柬埔寨榴蓮中，初始判別準確率為95.8%；泰國榴蓮5 個被誤判至柬埔寨，初始判別準確率為80%。在交叉驗證結果中，泰國、馬來西亞和越南驗證結果與初始驗證結果一致，1 個柬埔寨榴蓮被誤判至泰國榴蓮中。綜上，基于Fisher逐步判別分析的榴蓮產地初始判別準確率為91.8%，交叉驗證判別準確率為90.4%，可以實現大部分榴蓮的產地甄別。將榴蓮樣品的前3 個判別函數得分作散點圖（圖2），可以直觀地看出不同產地來源的榴蓮有各自的空間分布特征，泰國和柬埔寨有部分交叉。將榴蓮果核中16 種礦物元素（Li、Be、Na、Mg、Al、V、Mn、Co、Ni、Cu、Zn、As、Rb、Ag、Cd和Tl）代入判別模型中，判別方程的初始驗證準確率為84.9%，交叉驗證準確率為80.8%；將榴蓮果肉中13 種礦物元素（Li、Be、Na、Mg、Al、Mn、Zn、Rb、Sr、Ag、Cd、Ba和Tl）代入判別模型中，判別方程的初始驗證準確率為80.8%，交叉驗證準確率為75.3%，由此可見，榴蓮果肉和果核耦合指標大大增加了榴蓮產地判別準確率。

表4 4 個產地榴蓮Fisher逐步判別分析和BP人工神經網絡結果Table 4 Results of Fisher stepwise discrimination and artificial neural network for mineral elements in durian from four different countries%

圖2 4 個產地榴蓮樣品前3 個判別函數得分圖Fig.2 Scattering plots of top three discriminant functions for durian samples from four growing areas

BP人工神經網絡模型已經應用于多種食品的產地判別應用中[17]。本研究采用70%的樣本進行建模，30%的樣本進行驗證，結果如表4所示。在訓練驗證結果中，馬來西亞、柬埔寨和越南榴蓮全部被正確歸類，訓練驗證準確率為100%，2 個泰國榴蓮被誤判到柬埔寨榴蓮中，訓練驗證準確率為86.7%；在檢驗驗證結果中，馬來西亞、柬埔寨和越南驗證結果與訓練驗證結果一致，1 個泰國榴蓮被誤判至柬埔寨榴蓮中，檢驗驗證準確率為90%。綜上，基于BP人工神經網絡模型的榴蓮產地訓練驗證準確率為96.1%，檢驗驗證準確率為95.5%。

3 討 論

礦物元素是生物體內的基本組成成分，也是參與生物代謝的重要物質。生物自身不能合成礦物元素而必須從環(huán)境中攝取，不同生長環(huán)境中的土壤、大氣和水成分的差異會導致不同地域的植物礦物元素組成成分與含量差異，因此可利用特征性差異分析農產品產地溯源研究[33]。本研究采用ICP-MS法得到4 個榴蓮主產區(qū)的果核及果肉礦物元素指紋圖譜信息，結果顯示結合化學計量學方法能夠較好的表征產地特征。不同產地及品種的榴蓮礦物元素種類基本一致，但是含量存在顯著差異。總結前人實驗發(fā)現，Ca、Mn、Cu、Co、Rb、Sr、Zn、Ba等元素在產地上存在明顯分布特征，Fragni等[34]發(fā)現Ca、Mn、Co和Sr元素可以顯著區(qū)分意大利、西班牙的番茄樣品，Li、Ca、Cu和Pb元素可以顯著區(qū)分意大利和非意大利（中國、美國和西班牙）的番茄。Mahne等[35]發(fā)現Ca、Mn、Fe、Zn、Br、Rb、Sr元素對萵苣、甜椒和番茄在產地上（斯洛文尼亞、奧地利、西班牙、摩洛哥、意大利、希臘）存在顯著差異。此外，不同元素對產地、品種、土壤類型的貢獻效果也有區(qū)別。Garcia等[36]發(fā)現Sr、Ba、Ni、Cu對葡萄酒產地貢獻率大，而Sr、Ca、Mg、Mn對品種的區(qū)分效果更好。本研究發(fā)現As、Ag、Al、Rb、Be、Sr是指示榴蓮產地正態(tài)化重要性中高于60%的元素（圖3），同時可知榴蓮果核元素含量在榴蓮的產地判別上貢獻較果肉大，未來可著重分析果核中的指紋特征分布對榴蓮產地判別的影響。

圖3 人工網絡模型榴蓮果核和果肉元素含量重要性柱狀圖Fig.3 Normalized importance of mineral elements in durian stone and pulp predicted by artificial network model

不同產地的榴蓮元素含量的差異可能是由多種因素引起，首先是植物吸收土壤元素的有效性，植物吸收的利用效率主要與土壤陽離子交換能力有關，而土壤陽離子交換能力由土壤類型、pH值和礦物基質組成[37]決定。馬來西亞、泰國、柬埔寨和越南雖然都是東南亞國家，但是習慣上把熱帶雨林氣候的馬來西亞稱為“海洋國家”，把熱帶季風氣候的泰國、柬埔寨和越南稱為“半島國家”[38]。泰國、柬埔寨和越南形成的中南半島地形較高，出露巖石以花崗巖、片麻巖和石灰?guī)r為主，土壤主要組成為強淋溶土，肥力較低，土壤呈酸性[39]；馬來群島沿海有狹窄平原，且地殼活動不穩(wěn)定，火山地震活動強烈，噴出的火山灰致使馬來半島土壤肥沃，土壤類型主要以火成巖和黏土為主。氣候與地形條件的差異可能導致馬來西亞榴蓮多個元素（果核中Li、Na、Al、V、Co、Ni、Cu、Zn、Tl和果肉中Li、Be、Mg、Al、Mn、Zn、Sr、Ba）含量顯著高于其他3 個產區(qū)。此外，農業(yè)類型、施肥、人工灌溉、采摘年份與季節(jié)、果實成熟階段均會影響微量元素的濃度。Tanabe等[40]比較了美國不同商業(yè)葡萄園中2015年及2017年生產的葡萄酒中62 種元素含量，發(fā)現元素含量在不同產區(qū)及采集年份均存在顯著差異。Lim等[41]通過3 a的監(jiān)測，發(fā)現榴蓮葉片和土壤養(yǎng)分元素水平的波動與作物物候學的季節(jié)變化密切相關，榴蓮葉片的Zn、Mn、Cu、Fe元素含量和土壤的K、Ca、Mg元素含量隨榴蓮果實的成熟而降低。因此元素含量指紋可從氣候，土壤以及種植模式等多方面提供溯源能力。

本實驗使用的Fisher逐步判別分析與BP人工神經網絡分析中，發(fā)現交叉驗證與檢驗驗證中泰國榴蓮誤判率較高（準確率分別為80%和90%），且均誤判為柬埔寨榴蓮?？赡茉蚴翘﹪鴺悠份^為分散，且2 個產區(qū)地理位置相鄰有關?；谠刂讣y特征，結合Fisher逐步判別分析與BP人工神經網絡，本研究對4 個產區(qū)榴蓮產地判別的總體準確率可達91.8%和96.1%，為東南亞榴蓮的產地溯源提供了初步參考。為了大規(guī)模實現東南亞榴蓮產地的準確甄別，未來實驗應增加實驗樣本，著重從品種、成熟度、種植條件等多方面考慮，結合多種溯源指標進行耦合（光譜指紋特征、同位素指紋、DNA指紋等），構建多層次的榴蓮產地溯源，為我國榴蓮進口的產地甄別提供理論依據與技術支持。

4 結 論

本研究通過分析馬來西亞、泰國、柬埔寨和越南4 個產地中不同品種的榴蓮中果核和果肉的28 種礦物元素含量，提取了榴蓮果核中存在顯著差異的16 種元素（Li、Be、Na、Mg、Al、V、Mn、Co、Ni、Cu、Zn、As、Rb、Ag、Cd和Tl）和榴蓮果肉中存在顯著差異的13 種元素（Li、Be、Na、Mg、Al、Mn、Zn、Rb、Sr、Ag、Cd、Ba和Tl），對上述指標進行PCA，結果發(fā)現4 個產區(qū)的榴蓮各自分布，泰國和柬埔寨榴蓮有部分重疊。通過Fisher逐步判別分析實現了對榴蓮產地的有效甄別，特征溯源指標為榴蓮果核中的Li、Be、Mg、Mn、Rb 5 種元素與榴蓮果肉中的Be、Ag、Ba 3 種元素，構建出的判別模型對榴蓮產地判別的初始驗證準確率為91.8%，交叉驗證準確率為90.4%。利用BP人工神經網絡技術，70%樣本為訓練集，30%樣本為驗證集，實現了榴蓮產地的有效區(qū)分，榴蓮果核As、Ag、Al、Rb和果肉中Ag元素為BP人工神經網絡前5重要性元素，模型訓練驗證準確率為96.1%，檢驗驗證準確率為95.5%。不同判別模型得出較為一致的結果，表明該方法穩(wěn)定可靠。通過以上技術基本實現了馬來西亞、泰國、柬埔寨和越南榴蓮的區(qū)分，表明礦物元素指紋分析結合多元統(tǒng)計分析方法對甄別榴蓮產地溯源的可行性，為進一步分析榴蓮產地溯源提供有利條件。