基于氮穩(wěn)定同位素比例質(zhì)譜和液相色譜-高分辨質(zhì)譜的有機番茄鑒別

王世成，李國琛，王 瑩，李 波，高凝軒，孫 辭，宋 陽，王顏紅

（中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所，遼寧省農(nóng)產(chǎn)品環(huán)境與質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心，遼寧 沈陽 110016）

近年來，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)從數(shù)量滿足型向質(zhì)量需求型轉(zhuǎn)變，環(huán)境友好型的循環(huán)農(nóng)業(yè)也日益凸顯優(yōu)勢。隨著生活水平的提高，消費者需求也逐漸從傳統(tǒng)食品升級為綠色食品、有機食品。有機食品在生產(chǎn)過程中拒絕使用化學(xué)性肥料和農(nóng)藥，因而具有較高的安全性和經(jīng)濟價值。受利益驅(qū)使，一些不法商家隨意標(biāo)注“有機”字樣，假冒“有機食品”坑害消費者。歐洲議會“公共衛(wèi)生和食品安全委員會”將有機食品列為10 個風(fēng)險較高的摻假食品的第3位[1]。因此，鑒別有機產(chǎn)品的真實性對于保障消費者安全和市場誠信，保護消費者和有機品牌的經(jīng)濟利益至關(guān)重要。

在對有機與非有機種植模式的農(nóng)產(chǎn)品鑒定研究中，有近紅外光譜[2]、高效液相色譜[3-4]和氮同位素比例質(zhì)譜[1,5]等技術(shù)得到應(yīng)用，但僅通過一種檢測手段或只對單一目標(biāo)物檢測的技術(shù)很難滿足鑒別需求，將光譜、色譜以及質(zhì)譜結(jié)合的組學(xué)及化學(xué)計量學(xué)分析技術(shù)已逐漸成為研究熱點[6]。

有機食品是指根據(jù)有機農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的規(guī)范生產(chǎn)加工并經(jīng)過認證的農(nóng)產(chǎn)品和加工品。有機食品禁用化肥，允許施用有機肥，土壤有機肥的施用是種植業(yè)有機產(chǎn)品生產(chǎn)的主要控制要素[7]。研究表明[8-10]，化學(xué)肥料中δ15N的豐度變化范圍小，平均值為0.2‰，而有機肥料中δ15N的豐度變化范圍大，平均值為8.5‰，有機肥中15N同位素豐度高于化肥中15N豐度。有機模式種植的農(nóng)產(chǎn)品主要施用有機肥，不施用化肥，因此致使農(nóng)產(chǎn)品中氮同位素比值（δ15N）存在差異，通常表現(xiàn)為有機產(chǎn)品中δ15N高于施用化肥的普通產(chǎn)品。農(nóng)產(chǎn)品中δ15N豐度依次為施用有機肥＞不施肥（土壤內(nèi)源氮）＞施用化學(xué)合成氮肥[11]。對有機番茄的化學(xué)成分研究表明[12-13]，有機番茄中山柰酚、槲皮素等類黃酮化合物高于普通番茄，且有機種植的番茄中的類黃酮含量隨種植時間延長而增加，而傳統(tǒng)種植的類黃酮含量并無顯著差異。因此，利用氮穩(wěn)定同位素結(jié)合化學(xué)成分的變化，可以甄別有機食品與普通食品。本實驗對有機和普通種植番茄的穩(wěn)定同位素比值特征與化學(xué)組成成分進行對比研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

番茄：番茄樣品共計94 個，包括寶石、大紅、3944、安哥拉等大果番茄品種，其中有機番茄樣品50 個，普通番茄樣品44 個。采集于2017年6月至10月期間。地點分別位于遼寧沈陽新民、沈陽法庫、江蘇南京、山東濰坊、四川西昌的有機番茄及附近的普通番茄生產(chǎn)基地，其中有機番茄采自當(dāng)?shù)匕从袡C種植方式生產(chǎn)的有機農(nóng)場或企業(yè)。每個產(chǎn)地樣品的采摘方式為隨機選擇10 個有機種植模式的番茄植株和普通種植模式的番茄植株，在植株的不同部位采摘成熟度一致的果實。為增大采集樣品數(shù)量，每株植株隨機摘取4～6 枚果實，所摘取的番茄大小均勻，具有代表性。每個植株的番茄為1 組。樣品的來源及相關(guān)信息見表1。

表1 有機與普通番茄樣品的產(chǎn)地來源Table 1 Geographical origins of organic and common tomato samples tested in this study

甲醇、乙腈（均為色譜級） 德國默克公司；乙醇、甲酸（均為色譜級） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；超純水經(jīng)Millipore超純水系統(tǒng)純化。

1.2 儀器與設(shè)備

HPLC-Q Exactive高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（high performance liquid chromatographyhigh resolution mass spectrometry，HPLC-HRMS）聯(lián)用儀美國Thermo Scientific公司；Deltaplus XP穩(wěn)定同位素比例質(zhì)譜（isotope ratio mass spectrometry，IRMS）儀、Flash EA1112元素分析儀、ConFlo III元素分析儀-IRMS連續(xù)流接口 美國Thermo-Finnigan公司；SQP電子天平賽多利科學(xué)儀器（北京）有限公司；KQ-250B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；TTL-DC氮吹儀II型 北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司；CT15RE冷凍離心機 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

采集獲得的番茄樣品洗凈切片，混勻后，用勻漿機打碎，冷凍干燥成粉末，過20 目篩放于－80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 HPLC-HRMS分析

凍干后的樣品，稱量約150 mg，加入3 mL水-乙醇（1∶4，V/V），超聲30 min后，4 000 r/min離心15 min，取2 mL上清液于氮氣流下?lián)]發(fā)（45 ℃）至近干。殘渣加水-甲醇（1∶4，V/V）2 mL進行復(fù)溶，超聲30 min，4 ℃、14 000 r/min離心15 min，過0.22 μm濾膜，分取1.5 mL上清液于液相進樣瓶中，進行分析。

1.3.3 氮同位素比值測定

凍干后的樣品，分別稱量約2 mg，并用錫杯包裹壓實，利用元素分析儀-同位素比值質(zhì)譜儀測定穩(wěn)定氮同位素比值。每份樣品重復(fù)3 次，并根據(jù)下式計算δ15N值[14-17]：

式中：（15N/14N）樣品為樣品穩(wěn)定氮同位素比值；（15N/14N）標(biāo)準為標(biāo)準物質(zhì)穩(wěn)定氮同位素比值。

1.3.4 液相色譜條件

采用Waters Atlantis T3色譜柱（2.1 mm×150 mm，3 μm）；流動相為0.1%甲酸-乙腈溶液（A）和0.1%甲酸溶液（B）；流速0.3 mL/min；柱溫45 ℃；梯度洗脫條件：0～0.5 min，5% A，95% B；0.5～5 min，5%～30% A，95%～70% B；5～9.5 min，30%～90% A，70%～10% B；9.5～9.75 min，90%～5% A，10%～95% B；9.75～12 min，5% A，95% B。進樣體積5 μL。

1.3.5 高分辨質(zhì)譜條件

電噴霧離子源；噴霧電壓3.2 kV；蒸汽溫度350 ℃；離子傳輸管溫度320 ℃；鞘氣流速35 arb；輔助氣流速15 arb；Full MS-ddMS2掃描模式，F(xiàn)ull MS質(zhì)量掃描范圍m/z100～900，一級分辨率70 000，二級分辨率17 500。

1.3.6 同位素比值測試條件

元素分析系統(tǒng)氧化柱填料Cr2O3/Co3O4，溫度為960 ℃，還原柱填料為高純Cu/CuO，溫度為640 ℃，載氣He流量為90～100 mL/min，氧噴條件為175 mL/min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

HPLC-HRMS數(shù)據(jù)采用Thermo Scientific公司的Xcalibur4.0數(shù)據(jù)軟件進行原始數(shù)據(jù)采集。Compound Discover軟件（version 3.0, Thermo Scientific）對總離子流圖中的色譜峰進行時間和峰對齊校正、濾噪，數(shù)據(jù)處理分析，與數(shù)據(jù)庫進行計算匹配。處理結(jié)果導(dǎo)出樣品名稱、保留時間、分子式、分子質(zhì)量、質(zhì)荷比以及對應(yīng)的離子峰面積強度組成的數(shù)據(jù)集。主要參數(shù)設(shè)置如下：保留時間范圍為1～12 min；質(zhì)荷比范圍為m/z100～900；偏差為5×10－6；信噪比為3；保留時間漂移值為0.2 min。得到的峰面積利用SIMCA-P 11.5軟件（Umetrics, Umea, Sweden）進行化學(xué)計量學(xué)分析。采用主成分分析（principal component analysis，PCA）非監(jiān)督分析方法進行探索性數(shù)據(jù)分析，實現(xiàn)樣本間分析聯(lián)系的可視化。使用SIMCA-P剔除異常值樣品，使用有監(jiān)督的偏最小二乘-判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）方法對樣本及已確定的類別進行建模[18-22]。采用多變量和單變量分析選擇法選定差異顯著的變量，篩選出統(tǒng)計學(xué)意義顯著的化合物[23-26]。化合物的初步鑒定是在準確的物質(zhì)組成基礎(chǔ)上進行，從精確質(zhì)量數(shù)、同位素組成及分布與預(yù)測分子式的吻合度、一級質(zhì)譜/二級質(zhì)譜碎片和數(shù)據(jù)庫匹配等方面進行推測。

IRMS數(shù)據(jù)利用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，并利用Excel和Origin 8.5軟件進行繪圖統(tǒng)計處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 穩(wěn)定同位素比值分析

2.1.1 有機與普通番茄穩(wěn)定氮同位素比值的差異分析

利用元素分析儀-IRMS測得不同地區(qū)50 種有機種植番茄樣品以及44 種普通種植番茄樣品，由圖1A可以看出，有機番茄δ15N值的中位值在8.68‰左右，而普通方式種植的番茄δ15N值的中位值則為3.61‰，有機番茄氮同位素比值明顯高于普通番茄。有機番茄的肥料主要為有機肥，普通番茄主要施用化肥。有機肥以畜禽糞便、動植物殘體等富含有機質(zhì)的副產(chǎn)品資源為主要原料，Peterson等[10]研究發(fā)現(xiàn)，植物氮源主要來自于土壤中動植物腐爛物質(zhì)及動物排泄物。由于15N與14N在生物體內(nèi)反應(yīng)所需能量不同，反應(yīng)速率存在差異，造成15N在生物體內(nèi)產(chǎn)生富集。因而有機肥15N豐度高于化肥，有機肥中高含量的15N使有機作物果實中15N比例增高[8,11]。

圖1 所有樣品（A）及不同產(chǎn)地來源（B）的有機與普通番茄穩(wěn)定氮同位素比值Fig.1 Stable nitrogen isotopic ratios of organic and common tomato samples (A) and samples from different geographical origins (B)

所有有機和普通番茄穩(wěn)定同位素比值在一定范圍內(nèi)互有重疊（圖1A），但按4 個地區(qū)分組比較發(fā)現(xiàn)，同一地區(qū)所產(chǎn)有機番茄的δ15N均高于普通番茄，并且存在顯著差異（P＜0.01），且無重疊（圖1B）。因此，可以通過比較同一地區(qū)番茄的δ15N初步判斷是否為有機番茄。進一步比較有機番茄和普通番茄種植土壤的同位素比值發(fā)現(xiàn)，除四川西昌外，其他4 個地區(qū)的有機番茄土壤的δ15N值也均高于普通土壤，多年有機種植模式下土壤中氮同位素比值有增加的趨勢。但統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)除四川土壤外，其他地區(qū)的有機和普通土壤二者無顯著差異（圖2）。

圖2 土壤及對應(yīng)番茄穩(wěn)定氮同位素比值Fig.2 Sable nitrogen isotope ratios of soil and corresponding tomatoes

2.1.2 番茄與對應(yīng)的土壤氮同位素變化特征

番茄與對應(yīng)土壤的δ15N值對比發(fā)現(xiàn)，除遼寧一個產(chǎn)地（法庫）外，其他4 個產(chǎn)地有機番茄的氮同位素比值均高于對應(yīng)的土壤同位素比值（圖2）；除山東外，普通番茄δ15N值均低于對應(yīng)的土壤（圖2），在土壤氮源中δ15N豐度差異不顯著的情況下，施用外源肥料后，有機番茄主要吸收有機肥中的高δ15N的有效氮，導(dǎo)致有機番茄中δ15N高于土壤的δ15N，普通番茄吸收無機肥的低δ15N有效氮，導(dǎo)致普通番茄的同位素比值低于土壤同位素比值[8]。

2.2 液相色譜高分辨質(zhì)譜分析番茄化學(xué)組成成分

2.2.1 液相色譜分析結(jié)果

分別采集番茄樣品的HPLC-HRMS正離子和負離子模式的總離子流色譜圖。圖3為具有代表性的有機番茄樣品正離子模式指紋圖譜。在正離子模式下共有約25 個明顯可見的色譜峰，而在負離子模式下，樣品出峰較少，在扣除試劑空白后，僅有5 個明顯的色譜峰存在。

圖3 番茄樣品的HPLC-HRMS總離子流色譜圖（正離子模式）Fig.3 HPLC-HRMS total ion current chromatogram of tomato samples (in the positive ion mode)

2.2.2 液相色譜-高分辨質(zhì)譜的多元統(tǒng)計判別分析

94 個樣品的色譜峰面積經(jīng)SIMCA-P軟件剔除異常值樣品，獲得符合要求的樣品91 個，隨機取56 個作為訓(xùn)練集，其中有機樣品28 個，普通樣品28 個，35 個作為驗證集樣品，其中有機樣品20 個，普通樣品15 個。

應(yīng)用Compound Discover軟件，對色譜峰進行峰對齊、保留時間校正和濾噪處理后，提取其中的所有質(zhì)譜信息。使用軟件的化合物篩查過濾模式，提取化合物峰面積大于105，且60%以上樣品都有響應(yīng)的化合物組成成分，提取其中的875 個化合物的峰面積數(shù)據(jù)。采用SIMCA-P軟件進行PCA和PLS-DA，PCA不能將樣品很好分開，采用PLS-DA提取3 個PC，模型解釋的訓(xùn)練集累計貢獻率（R2Y）達到0.915（通常R2越接近1，模型越良好），模型交叉驗證對訓(xùn)練集預(yù)測的累計貢獻率（Q2）為0.539（通常Q2＞0.5表明模型對新數(shù)據(jù)的預(yù)測能力良好）。采用Permutation校驗方法[21]驗證模型是否存在過擬合現(xiàn)象（圖4），通過200 次迭代的排列測試，模型結(jié)果顯示Q2點散射回歸線與垂直軸的截距小于零，說明PLS-DA模型驗證結(jié)果良好，數(shù)據(jù)模型擬合成功，模型可靠。建立的模型能夠?qū)崿F(xiàn)2 組樣本完全分離，模型的總預(yù)測正確率為92.3%（表2）。

圖4 PLS-DA模型的200 次permutation校驗結(jié)果Fig.4 Results of verification of PLS-DA model with 200 permutation tests

表2 模型對有機和普通番茄的判定結(jié)果Table 2 Results of the model for organic and common tomatoes

2.2.3 有機番茄和普通番茄組成成分的單變量差異性分析

采用Compound Discover軟件，同2.2.1節(jié)處理，對番茄樣品的HPLC-HRMS組間數(shù)據(jù)峰面積均值進行比對，形成單變量統(tǒng)計分析結(jié)果的火山圖（圖5）。圖中框圖標(biāo)注區(qū)域為有機番茄和普通番茄單變量統(tǒng)計差異顯著（P＜0.05），并且有機番茄相比于普通番茄（普通/有機），面積比值增加（log2fold change＜0.5）或降低（log2fold change＞2）的特征化合物，共有18 個，這些化合物成分在有機和普通番茄中存在較大差異，需進一步確證。

圖5 不同化合物的有機與普通番茄組間的火山圖Fig.5 Volcano plots showing differential compounds between organic and common tomatoes

2.2.4δ15N與HPLC-HRMS組合的化學(xué)計量學(xué)判別分析

為了提高模型的預(yù)測能力，將δ15N數(shù)據(jù)與875 個色譜峰數(shù)據(jù)合并形成新的數(shù)據(jù)集，采用SIMCA-P軟件進行PLS-DA，提取3 個PC，模型解釋的訓(xùn)練集累計貢獻率（R2Y）達到0.918，交叉驗證模型預(yù)測的訓(xùn)練集累計貢獻率（Q2）為0.559，模型預(yù)測的正確率為93.4%（表2）。與δ15N變量加入前相比，信息提取率、預(yù)測能力和準確率均有一定提高。前3 個PC的得分圖上，2 組樣本實現(xiàn)了完全分離（圖6a）。在前2 個PC的載荷圖（圖6b）中，距離原點最遠的變量為318.07和δ15N，說明這2 個指標(biāo)對判定有機番茄的貢獻最大，其次為分子質(zhì)量192.03、208.15、274.19、159.07、609.39、305.27、453.29 Da等變量，也有可能成為有機和普通番茄產(chǎn)生差異的主要標(biāo)志化合物。

圖6 有機和普通番茄的得分圖（a）及載荷圖（b）Fig.6 Score plot (a) and loading plot (b) for organic and common tomatoes

2.2.5 特征變量因子篩查與確證分析

將SIMCA-P軟件多變量處理結(jié)果與Compound Discover軟件單變量分析的結(jié)果相結(jié)合，進一步篩選特征化合物，以更全面闡明有機和普通樣品之間的差異化合物成分。單變量處理的組間存在顯著差異（P＜0.05）的219 個變量中，滿足多變量處理變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）大于1.0的變量153 個，其中VIP值大于1.5的變量53 個，這53 個化合物可能成為有機番茄和普通番茄具有顯著差異的特征化合物。這些化合物與采用Compound Discover處理的火山圖結(jié)果（圖5）中的18 個化合物中有14 個一致，這14 個成分中有9 個化合物在有機番茄中含量低于普通番茄，有5 個高于普通番茄，說明通過簡單的化合物峰面積比較可初步發(fā)現(xiàn)存在含量差異的化合物。

針對篩選出的除δ15N以外的152 個變量，通過精確分子質(zhì)量、二級質(zhì)譜分析，并檢索mzclound、chemspider、massbank、KEGG等數(shù)據(jù)庫，結(jié)合文獻[27-31]，初步確定mzclound數(shù)據(jù)庫匹配度大于70%，在有機與普通番茄中存在差異的13 個化合物，見表3。在這些化合物中，主要為有機酸、黃酮類化合物，這兩類化合物是番茄中的主要抗氧化成分。與普通番茄組相比較，有機番茄中的小分子有機酸含量降低，黃酮類化合物槲皮素-3-O-三糖苷的含量增加。這與已有研究結(jié)果基本一致，環(huán)境脅迫可激活番茄植株體內(nèi)苯丙醇類化合物的生物合成，有機處理的番茄中類黃酮含量隨種植年限增加而增加，而傳統(tǒng)處理的類黃酮含量并無顯著差異[5,12]。

表3 初步確定兩組間差異顯著的化合物信息Table 3 Information about significantly differential compounds between organic and common tomatoes

3 結(jié) 論

本實驗采用IRMS和HPLC-HRMS分析技術(shù)，借助PLS-DA技術(shù)建立一種有機番茄鑒別方法。有機和普通種植方式所生產(chǎn)的番茄，其果實中穩(wěn)定氮同位素比值差異顯著?？山Y(jié)合地區(qū)特征，通過穩(wěn)定氮同位素比值大小在一定程度上判定樣品是否為有機番茄。為進一步提高判別效果，將液相色譜高分辨質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)與穩(wěn)定碳同位素比值相結(jié)合，構(gòu)建了有機番茄判別模型，篩查出特征變量因子，包括穩(wěn)定氮同位素比值，50多個可能的化學(xué)成分，鑒定出其中的13 個化合物，可作為有機和普通番茄區(qū)別的特征成分。所建立的模型對有機番茄的判別正確率為93.4%，基本可以滿足有機番茄判別的需要。對有機產(chǎn)品的判定，穩(wěn)定氮同位素差異分析更為簡潔方便，但由于有機與普通產(chǎn)品的穩(wěn)定氮同位素比值界限時有重疊，給判定增加了不確定性，因此應(yīng)該進一步結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的組學(xué)技術(shù)，提高判別的可靠性。