CodY在單核細胞增生李斯特菌抗氧化脅迫中的作用

楊詩怡，林 巍，楊麗玉，左 成，羅 勤

（華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430079）

單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm）是一種食源性致病菌，在自然界中廣泛存在，對環(huán)境有極強的耐受能力，能在冷藏溫度（2～4 ℃）、酸性環(huán)境（pH 4.5）以及高鹽（10% NaCl）條件下生長，因此Lm能夠克服食品儲存過程中的各種不利因素影響，造成食品污染進而危害到人類健康，由Lm引起的李斯特菌病可導(dǎo)致孕婦流產(chǎn)，新生兒、老年人以及免疫缺陷或低下病人罹患腦膜炎、敗血癥等[1-2]。Lm黏附在器具表面所形成的生物被膜有助于其耐受惡劣環(huán)境以及抗菌處理手段[3-4]。合理的消毒方法對防控Lm污染至關(guān)重要，而所使用的消毒劑需要具有無毒、無害、無殘留等特性[5]。

食品加工過程中，常用到H2O2、NaClO等氧化類消毒劑，強氧化環(huán)境會導(dǎo)致細菌內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）大量積累，從而激發(fā)細菌氧化應(yīng)激反應(yīng)[6-7]。H2O2因其在使用后能分解成無毒產(chǎn)物（H2O和O2），不會造成有害物殘留，被越來越多地應(yīng)用于醫(yī)療、食品和工業(yè)生產(chǎn)中[6,8]。一定濃度的H2O2能激發(fā)細菌的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）等相關(guān)基因表達[9]。多種外部環(huán)境脅迫（如饑餓、氧化應(yīng)激、抗生素處理等）也會導(dǎo)致細菌DNA受到損傷，此時其內(nèi)部的DNA修復(fù)機制被激活，如DNA損傷誘導(dǎo)反應(yīng)（SOS反應(yīng)），以抵御外部環(huán)境脅迫引起的DNA損傷[10]。Lm中參與SOS反應(yīng)的基因主要有recA（SOS反應(yīng)誘導(dǎo)物）、lexA（SOS反應(yīng)阻礙物）、recR（SOS反應(yīng)激活因子）、lmo1302（LexA家族調(diào)節(jié)子）和lmo1975（DNA聚合酶IV）等[10-11]。

CodY是一種全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，普遍存在于低G+C含量的革蘭氏陽性菌中，參與多種代謝途徑以及生理過程的調(diào)控[12]。研究表明，在乳酸鏈球菌（Lactococcus lactis）[13]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[14]和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[15]中，CodY可以通過直接與靶基因啟動子區(qū)保守序列CodY-box（即AATTTTCWGAAAATT）結(jié)合，或通過其他方式直接或間接地調(diào)控基因表達，Lm中也存在類似的保守序列[16]。已有研究發(fā)現(xiàn)某些細菌中CodY參與了抗氧化應(yīng)激過程的調(diào)控，如：Wang Yue等[17]證明了在嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）中CodY能結(jié)合到GSH的編碼基因ghsF啟動子區(qū)域，調(diào)控GSH的合成，清除過量H2O2；Hajaj等[18]發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）中雖不存在常見的CAT，但卻有一種被稱為“硫醇過氧化物酶（TpxD）”的關(guān)鍵酶用以清除多余的過氧化物，其編碼基因tpxD具有CodY-box，當(dāng)細菌受到H2O2脅迫時，CodY能夠激活tpxD使其表達上調(diào)。Lm中CodY在細菌毒力、鞭毛運動等方面具有重要作用[19-21]，但CodY是否直接或間接參與Lm抗氧化應(yīng)激調(diào)控還鮮有研究。

本研究通過比較野生株EGDe和CodY（由codY編碼）缺失株EGDeΔcodY的抗氧化應(yīng)激能力以及SOS反應(yīng)等基因表達差異，探尋CodY在LmH2O2氧化脅迫中的調(diào)控作用及其機制，以期為醫(yī)療、食品和工業(yè)生產(chǎn)中H2O2的合理使用策略，以及預(yù)防和治療李斯特菌病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

實驗中所用菌株EGDe（血清型1/2a，全基因組序列已知[22]）為德國維爾茨堡大學(xué)Werner Goebel教授惠贈，EGDeΔcodY為本實驗室構(gòu)建和保存[19]。如無特殊說明，菌株均在腦心浸液（brain heart infusion，BHI）培養(yǎng)基中37 ℃過夜活化并200 r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)中期（OD600nm=0.65）。

1.1.2 試劑

BHI培養(yǎng)基 美國B&D公司；30% H2O2（分析純）國藥集團化學(xué)試劑有限公司；CAT、SOD及GSH檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所有限公司；十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB） 北京索萊寶生物科技有限公司；PrimeScriptTMRT reagent反轉(zhuǎn)錄試劑盒 寶生物工程（大連）有限公司；熒光定量SYBR Green Master Mix 中國US Everbright公司。

1.1.3 引物

根據(jù)NCBI中已公布的EGDe全基因組序列，利用Primer5設(shè)計基因引物，所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物見表1。

表1 實驗引物信息Table 1 Primers used in this study

1.2 儀器與設(shè)備

VCX800超聲波細胞破碎 美國Sonics公司；DYY-6D電泳儀 北京市六一儀器廠；Veriti PCR儀 美國Applied Biosystems公司；ZF-258凝膠成像系統(tǒng) 上海嘉鵬科技有限公司；CFX96 real-time PCR儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 H2O2對細菌最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）的測定

將10 μL對數(shù)中期的新鮮菌液（濃度約為9×1011CFU/mL）分別加入到200 μL含有不同濃度的H2O2（5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mmol/L）的無菌BHI培養(yǎng)基中，每組設(shè)3 個重復(fù)。另設(shè)一組不添加H2O2的菌液作為對照。此時各組菌液較為清亮。37 ℃靜置培養(yǎng)22 h后，肉眼觀察，無細菌生長（即菌液保持清亮，無明顯渾濁）的最低H2O2濃度即為該菌的MIC值。在MIC結(jié)果的基礎(chǔ)上，取200 μL肉眼觀察無菌生長的培養(yǎng)液進行BHI平板涂布，37 ℃培養(yǎng)22 h后，平板上無細菌生長的最低H2O2濃度，即為該菌的MBC值。

1.3.2 抑菌圈檢測

采用紙片瓊脂擴散法。調(diào)節(jié)對數(shù)中期菌液濃度近似為9×1011CFU/mL，稀釋107倍，取100 μL菌液進行平板涂布。用無菌鑷子夾取無菌圓形濾紙片（直徑6 mm），平貼于培養(yǎng)基表面。每個平板上均勻放4 張濾紙片，分別滴加10 μL含0（對照）、10、20、30 mmol/L H2O2的BHI于其上，37 ℃過夜培養(yǎng)，游標卡尺測量抑菌圈直徑。

1.3.3 細菌在不同濃度H2O2中的生長曲線測定

向100 mL對數(shù)中期菌液中分別加入一定量（0.05～2.04 mL）30% H2O2溶液（市售H2O2初始濃度9 790 mmol/L），使菌液中H2O2終濃度分別為5、20、50、100、200 mmol/L，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)。每隔0.5 h檢測菌液OD600nm的變化，連續(xù)測定至第3小時。

1.3.4 細菌CAT、SOD活力和GSH含量檢測

菌株培養(yǎng)至對數(shù)中期后，加入200 mmol/L H2O2分別脅迫0（對照）、10、20、40 min，磷酸鹽緩沖液洗滌并重懸菌體。超聲波細胞破碎儀破碎菌體，破碎時將菌體置于冰水混合環(huán)境，工作總時間5 min（超聲3 s、間歇5 s）。破碎后的細胞經(jīng)6 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液，依照CAT、SOD及GSH檢測試劑盒的步驟檢測細菌的CAT、SOD活力和GSH含量。

1.3.5 H2O2脅迫對細菌DNA損傷程度的檢測

本實驗采用RAPD技術(shù)[23]研究H2O2對細菌DNA的損傷。DNA損傷程度通過菌株基因組模板穩(wěn)定性（genomic template stability，GTS）進行評估。利用CTAB法提取對數(shù)中期細菌總DNA，進行RAPD分析，所使用的隨機引物見表1。反應(yīng)體系為：TaqMix 12.5 μL、隨機引物2 μL、DNA 3 μL、ddH2O 7.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，40～30 ℃梯度退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)20 次；94 ℃變性45 s，35 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)10 次；72 ℃充分延伸10 min。PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后，利用凝膠成像系統(tǒng)成像觀察并統(tǒng)計多態(tài)性條帶數(shù)。GTS計算公式如下：

式中：A為H2O2脅迫后細菌DNA的RAPD條帶數(shù)，即新出現(xiàn)和消失的PCR條帶數(shù)之和；N為未經(jīng)H2O2脅迫的細菌DNA PCR后的總條帶數(shù)。

1.3.6 細菌real-time PCR分析

對細菌抗氧化應(yīng)激物CAT、SOD和GSH的編碼基因kat、sod、gshF，SOS反應(yīng)重要基因recA、lexA、recR、lmo1302、lmo1975進行real-time PCR，定量分析H2O2脅迫對其轉(zhuǎn)錄表達的影響。用200 mmol/L H2O2脅迫EGDe和EGDeΔcodY菌株0（對照）、10、20、40 min后，分別提取細菌總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，1 μL RNA/10 μL體系得到細菌不同脅迫條件下的cDNA，以其為模板進行real-time PCR，每組設(shè)置4 個平行。反應(yīng)體系（15 μL）為：SYBRTaq7.5 μL、上下游引物各0.3 μL、cDNA 3 μL、ddH2O 3.9 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，62 ℃退火及延伸30 s，循環(huán)39 次；65～95 ℃，每5 s增加0.5 ℃，生成熔解曲線。以細菌16S rRNA為內(nèi)參基因，采用2－ΔΔCt法 處理數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

各實驗均進行3 次生物學(xué)重復(fù)，實驗結(jié)果取其平均值，利用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析，P≤0.05，差異顯著，Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 EGDe和EGDeΔcodY對H2O2耐受能力的比較

為了比較野生株EGDe和CodY缺失株EGDeΔcodY抗氧化脅迫的差異，首先檢測了H2O2對兩株細菌的MIC和MBC。H2O2對EGDe的MIC為25 mmol/L，MBC為30 mmol/L，對EGDeΔcodY的MIC為10 mmol/L，MBC為15 mmol/L，H2O2對EGDe的MIC和MBC大約是EGDeΔcodY的2 倍，表明缺失CodY會導(dǎo)致Lm對H2O2的耐受能力減弱。同時，也進行了抑菌圈實驗，如表2所示，當(dāng)濾紙片中H2O2濃度為10 mmol/L時，EGDe和EGDeΔcodY形成的抑菌圈直徑分別為（0.97±0.16）cm和（1.30±0.45）cm，H2O2對EGDeΔcodY的抑制略高于EGDe，但差異不顯著（P＞0.05）；當(dāng)H2O2濃度達到20 mmol/L后，EGDe和EGDeΔcodY形成的抑菌圈直徑分別為（1.01±0.15）cm和（1.57±0.34）cm，二者之間差異極顯著（P≤0.01）；當(dāng)H2O2濃度達到30 mmol/L時，EGDeΔcodY形成的抑菌圈直徑極顯著大于EGDe（P≤0.01），約為EGDe的1.7 倍。以上結(jié)果表明，CodY的缺失降低了Lm對H2O2的耐受能力，并且隨著H2O2濃度的升高，CodY缺失的影響越顯著。

表2 EGDe和EGDeΔcodY在不同濃度H2O2脅迫下抑菌圈大小Table 2 Diameter of inhibition zone of EGDe and EGDeΔcodY when exposed to different concentrations of H2O2

2.2 EGDe和EGDeΔcodY在不同濃度H2O2脅迫下的生長曲線

相比MIC（或MBC）以及抑菌圈實驗中所涉及的較低細菌初始濃度（類似實際生產(chǎn)中受Lm污染初期），為了檢測較高細菌初始濃度下（如在Lm污染嚴重時），加入不同濃度H2O2對EGDe和EGDeΔcodY生長繁殖的影響，并為后續(xù)實驗中比較兩株細菌中氧化應(yīng)激物相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達和酶活力差異確定適宜的脅迫濃度，向培養(yǎng)至對數(shù)中期的菌液（濃度約為9×1011CFU/mL，體積為100 mL）中分別加入一定量（0.05～2.04 mL）30% H2O2溶液，使菌液中H2O2終濃度分別為5、20、50、100、200 mmol/L，置于37 ℃、200 r/min培養(yǎng)。如圖1所示，當(dāng)H2O2脅迫濃度等于或低于100 mmol/L時，雖然隨著H2O2濃度升高，EGDe和EGDeΔcodY生長趨勢有所下降，但二者之間并無明顯差異。但當(dāng)H2O2濃度達到200 mmol/L時，EGDe的生長仍呈上升趨勢，只是生長速率較之前明顯減慢，而EGDeΔcodY生長則受到非常顯著的抑制，兩菌株的生長曲線存在顯著差異，因此選擇該脅迫濃度進行后續(xù)實驗。

圖1 EGDe（A）和EGDeΔcodY（B）在不同濃度H2O2脅迫下的生長曲線Fig.1 Growth curves of EGDe (A) and EGDeΔcodY (B) at different concentrations of H2O2

2.3 H2O2脅迫下EGDe和EGDeΔcodY中CAT、SOD活力和GSH含量

如圖2A所示，當(dāng)CodY缺失后，細菌中催化H2O2分解成氧和水的CAT活力明顯比野生株EGDe低（P≤0.05）。H2O2脅迫10 min后，野生株EGDe CAT活力開始急劇下降，而EGDeΔcodY中CAT雖有所下降，但并不如EGDe顯著。而SOD活力在EGDe和EGDeΔcodY中始終未表現(xiàn)出顯著差異，即使是受到H2O2脅迫處理長達40 min（圖2B）。細菌體內(nèi)GSH含量隨著H2O2脅迫時間延長總體呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，但EGDe內(nèi)GSH含量始終高于EGDeΔcodY（圖2C）。

圖2 EGDe和EGDeΔcodY在200 mmol/L H2O2不同脅迫時間下抗氧化應(yīng)激物酶活和GSH含量的比較Fig.2 Antioxidant parameters in EGDe and EGDeΔcodY after different durations of exposure to 200 mmol/L H2O2

2.4 H2O2脅迫下EGDe和EGDeΔcodY中CAT、SOD和GSH編碼基因的轉(zhuǎn)錄表達變化

為了進一步研究CAT、SOD和GSH編碼基因在EGDe和EGDeΔcodY中的轉(zhuǎn)錄表達，以未經(jīng)H2O2脅迫的EGDe為參照，進行了real-time PCR檢測。如圖3所示，編碼CAT的基因kat以及編碼SOD的基因sod的轉(zhuǎn)錄表達趨勢與其酶活力結(jié)果并不完全一致。如圖3A所示，kat在兩菌株內(nèi)的相對轉(zhuǎn)錄表達水平幾乎沒有差異，且并不受H2O2脅迫的影響；sod轉(zhuǎn)錄水平在EGDe中隨著H2O2脅迫時間延長而顯著上升，而EGDeΔcodY中sod的轉(zhuǎn)錄表達幾乎沒有變化，因此，sod在兩個菌株中的表達差異逐漸增加，當(dāng)H2O2脅迫40 min時差異達到高度顯著（P≤0.001）（圖3B）。只有GSH合成酶基因gshF在兩株細菌中的相對轉(zhuǎn)錄表達趨勢基本與其含量變化一致，且更加明顯和穩(wěn)定。如圖3C所示，缺失CodY后，細菌體內(nèi)的gshF的表達顯著降低，在H2O2脅迫10 min和20 min時差異極顯著（P≤0.01），但隨著脅迫時間延長，野生株中g(shù)shF的表達下降，差異不再顯著。

圖3 CAT、SOD和GSH編碼基因受到200 mmol/L H2O2不同時間脅迫后在EGDe和EGDeΔcodY中的相對表達水平Fig.3 Relative transcriptional expression of kat (A), sod (B) and gshF (C)in EGDe and EGDeΔcodY after different durations of exposure to 200 mmol/L H2O2

2.5 H2O2脅迫對EGDe和EGDeΔcodY基因組DNA穩(wěn)定性的影響

氧化脅迫會造成細菌DNA受損，但細菌能夠通過激活DNA修復(fù)機制維持DNA穩(wěn)定性（GTS）。為了深入研究CodY在細菌受到氧化脅迫后對維持細菌基因組DNA穩(wěn)定性的作用，利用RAPD技術(shù)檢測并統(tǒng)計電泳后EGDe和EGDeΔcodY多態(tài)性條帶數(shù)，計算和分析H2O2脅迫對細菌基因組DNA穩(wěn)定性的影響。如表3所示，經(jīng)200 mmol/L H2O2脅迫20 min后，EGDe基因組DNA的GTS降為未受脅迫時的93.1%，而EGDeΔcodY的GTS下降更低，為未受脅迫時的80.0%。表明在H2O2脅迫下，CodY缺失顯著影響了Lm基因組的穩(wěn)定性，細菌DNA受到氧化脅迫后損傷更嚴重。

表3 H2O2脅迫下EGDe和EGDeΔcodY GTS比較Table 3 Comparison of genomic DNA template stability of EGDe and EGDeΔcodY under H2O2 stress

Lm能夠通過激活SOS反應(yīng)進行DNA損傷修復(fù)，參與SOS反應(yīng)的重要基因包括recA、lexA、recR、lmo1302和lmo1975等。為進一步探究CodY在DNA損傷修復(fù)中的作用，利用real-time PCR技術(shù)，檢測EGDe和EGDeΔcodY中參與SOS反應(yīng)的上述基因在H2O2脅迫前后的轉(zhuǎn)錄表達水平。如圖4所示，與未受H2O2脅迫的EGDe（即脅迫0 min）相比，H2O2脅迫20 min后，SOS反應(yīng)誘導(dǎo)物編碼基因recA與DNA聚合酶IV的編碼基因lmo1975在EGDe中的轉(zhuǎn)錄表達水平呈現(xiàn)高度顯著提高（P≤0.001），而在EGDeΔcodY中的表達則正好相反，呈現(xiàn)高度顯著降低（P≤0.001）。同時，SOS反應(yīng)阻礙物編碼基因lexA及其基因家族調(diào)節(jié)子編碼基因lmo1302以及SOS反應(yīng)激活因子編碼基因recR的轉(zhuǎn)錄表達水平在EGDe中沒有明顯變化，但在EGDeΔcodY中表現(xiàn)出高度顯著降低（P≤0.001）。以上結(jié)果表明，在H2O2脅迫下，CodY會快速激活Lm中recA和lmo1975的轉(zhuǎn)錄表達，參與修復(fù)損傷的基因組DNA；而CodY的缺失會造成上述Lm中參與SOS反應(yīng)的所有重要基因（recA、lexA、recR、lmo1302、lmo1975）的轉(zhuǎn)錄表達顯著下調(diào)，從而顯著影響細菌的DNA損傷修復(fù)能力，造成細菌基因組DNA的穩(wěn)定性下降。

圖4 200 mmol/L H2O2脅迫下EGDe和EGDeΔcodY中基因相對表達水平Fig.4 Relative transcriptional expression of recA, lexA, recR, lmo1302,lmo1975 in EGDe and EGDeΔcodY after different durations of exposure to 200 mmol/L H2O2

3 討 論

作為普遍存在于低G+C含量革蘭氏陽性菌中的全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，CodY參與了細菌多種代謝途徑以及生理過程的調(diào)控。本研究通過實驗證實CodY可能通過調(diào)節(jié)Lm中氧化應(yīng)激物的轉(zhuǎn)錄表達或者酶活力水平以及SOS反應(yīng)中重要基因的表達，直接或者間接幫助細菌抵抗環(huán)境中氧化脅迫而生存下來。

CodY缺失后，即使在正常條件下（沒有氧化脅迫），EGDeΔcodY中GSH含量低于野生菌株EGDe；當(dāng)受到H2O2脅迫后，GSH的轉(zhuǎn)錄表達水平在EGDeΔcodY中下降更為明顯，極顯著低于在EGDe中的水平，表明CodY對細胞中谷胱甘肽含量具有重要的調(diào)控作用。通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)Lm中編碼合成GSH的基因gshF的啟動子區(qū)存在CodY結(jié)合位點，即CodY-box（AATTGGTAGAAATT）[14]，因此認為CodY可能直接與gshF啟動子結(jié)合，調(diào)控GSH在細菌受到氧化脅迫后的表達水平，幫助細菌抵御氧化損傷。而CAT和SOD的編碼基因kat和sod啟動子區(qū)沒有發(fā)現(xiàn)合適的CodY-box，而且在H2O2脅迫前后，盡管CAT活力呈現(xiàn)下降趨勢，但其轉(zhuǎn)錄表達在EGDe和EGDeΔcodY中并沒有顯著變化，說明CodY對其并沒有調(diào)控作用，或者作用很弱。氧化脅迫下SOD活力在EGDe和EGDeΔcodY中始終未表現(xiàn)出顯著差異，但編碼基因sod的轉(zhuǎn)錄表達在EGDe和EGDeΔcodY中差異高度顯著（P≤0.001）。該結(jié)果的產(chǎn)生，一方面是可能存在的轉(zhuǎn)錄后修飾或者翻譯水平的修飾使得RNA和蛋白質(zhì)的表達并不能一一對應(yīng)[24]。例如，Archambaud等[25]報道Lm中的SOD活性可通過改變其絲氨酸和蘇氨酸殘基的磷酸化修飾進行調(diào)控。另外，SOD活力與H2O2濃度之間也存在較為復(fù)雜的關(guān)系：氧化環(huán)境使細菌內(nèi)過量富集ROS，SOD能夠催化超氧根陰離子（O2－）發(fā)生歧化反應(yīng)，進而生成H2O2和O2：2O2－+2H+→H2O2+O2，產(chǎn)物H2O2隨后被CAT還原為H2O和O2[26]，然而過量的H2O2又會抑制SOD活力[27]。而本研究直接使用H2O2作為氧化脅迫物，這樣便使得菌體內(nèi)富集過量H2O2，因此EGDe中其sod轉(zhuǎn)錄水平呈上升趨勢，轉(zhuǎn)錄后階段又會受到過量的H2O2的抑制。

H2O2脅迫還會導(dǎo)致細菌DNA受到損傷。SOS反應(yīng)是細菌重要的應(yīng)激機制，在DNA損傷修復(fù)方面有重要作用，作為調(diào)節(jié)SOS反應(yīng)的兩種關(guān)鍵酶，RecA和LexA分別起誘導(dǎo)和抑制SOS反應(yīng)的作用[10]。DNA未受損傷的情況下，LexA結(jié)合到SOS-box并抑制SOS誘導(dǎo)的蛋白轉(zhuǎn)錄；DNA受到損傷后，RecA與ssDNA（單鏈DNA）結(jié)合并形成活性核蛋白，導(dǎo)致LexA蛋白水解并激活SOS調(diào)控的基因表達。同時，部分細菌中存在Com系統(tǒng)（competence system）能夠促進外源DNA的攝取，在DNA修復(fù)過程中有著重要作用[28]。對于枯草芽孢桿菌Com系統(tǒng)已有較多研究，其中，該細菌Com系統(tǒng)中的ComK與CodY能夠競爭性結(jié)合comK啟動子，當(dāng)CodY結(jié)合時抑制轉(zhuǎn)錄，進一步抑制recA的表達，阻止SOS反應(yīng)；當(dāng)CodY解除對comK的抑制作用時，recA轉(zhuǎn)錄表達被激活，從而激發(fā)SOS反應(yīng)[29]。Lm中也存在Com系統(tǒng)，且與枯草芽孢桿菌的com基因有相似的表達機制[28]。因此，可能類似于枯草芽孢桿菌，當(dāng)Lm受氧化脅迫后，其CodY對comK抑制作用消除，從而誘導(dǎo)DNA修復(fù)基因recA表達，同時DNA聚合酶IV等多種酶協(xié)助啟動因受損停滯的DNA復(fù)制叉[30]，激活SOS反應(yīng)通路。值得注意的是，受氧化脅迫后，EGDeΔcodY中SOS反應(yīng)重要基因recA、lexA、recR、lmo1302、lmo1975并沒有因為CodY的缺失而表現(xiàn)出上調(diào)，反而受到極顯著抑制。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能與CodY在Lm中起到的全局性調(diào)控作用有關(guān)，此前研究已證明CodY的缺失會造成Lm生長緩慢、毒力減弱以及運動能力降低[19]，說明CodY對維持細菌正常生命活動以及侵染宿主具有重要作用，而EGDeΔcodY由于完全失去了CodY的調(diào)控，細菌在自身生理活性減弱的同時又受到H2O2的脅迫，生命活動處于嚴重失衡狀態(tài)，極可能影響氧化脅迫下SOS反應(yīng)中基因的表達，導(dǎo)致recA、lexA、recR、lmo1302、lmo1975基因表達下調(diào)。

綜上所述，氧化環(huán)境中EGDe相比于EGDeΔcodY有更強的耐受能力。CodY幫助Lm提高GSH等抗氧化應(yīng)激物水平來直接清除菌體內(nèi)的ROS，以及調(diào)控SOS反應(yīng)通路直接或者間接抵御氧化脅迫造成的DNA損傷。本研究探究了CodY在Lm中抗氧化應(yīng)激作用方式，為深入理解革蘭氏陽性菌抵抗氧化脅迫而生存的復(fù)雜調(diào)控機制提供依據(jù)。