體外模擬消化對酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響

韓榮欣

張紅印1

周光鑫1

王海東1

肖鳳琴1

李光哲1,2

嚴(yán)銘銘1,2

(1. 長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117；2. 吉林省中藥保健食品科技創(chuàng)新中心，吉林 長春 130117)

酸棗仁作為國家頒布的首批藥食同源中藥材，近年來在食品及保健食品中的應(yīng)用日益增加。現(xiàn)代科學(xué)研究表明，酸棗仁中富含多種化學(xué)成分，如皂苷、黃酮、生物堿、脂肪酸以及蛋白質(zhì)等化學(xué)成分[1]，具有多種藥理作用，如鎮(zhèn)靜催眠、抗焦慮、抗抑郁等對中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用，抗動脈粥樣硬化、抗心律失常等對心血管系統(tǒng)作用，以及抗氧化、抗腫瘤、抗炎、改善記憶能力等其他藥理作用[2]。研究[3]表明，酸棗仁中蛋白質(zhì)含量約占其干重的40%，含有17種人體所需氨基酸，其組成較為合理，具有較高的營養(yǎng)價值和研究前景。

自由基是人體在進(jìn)行正常生命活動時產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物。目前已從多種植物(如黑豆[4]、綠豆[5]、核桃[6]等)中提取分離出蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物及肽類物質(zhì)，并且表現(xiàn)出較好的自由基清除活性，這些蛋白酶解產(chǎn)物或抗氧化肽可作為食品添加劑有效地應(yīng)用于食品加工行業(yè)。

課題組[7]前期研究發(fā)現(xiàn)，酸棗仁蛋白具有一定的抗氧化活性，且其功能特性較好，可作為一種潛在的新型功能性蛋白資源應(yīng)用于食品行業(yè)中。采用酶解法對酸棗仁蛋白進(jìn)行酶解處理得到的酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物，具有比酸棗仁蛋白更好的功能特性[8]以及體外抗氧化活性。研究擬通過體外模擬胃腸消化，對消化前后酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物的氨基酸組成以及體外抗氧化活性進(jìn)行比較，探究人體攝入后對酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物的活性變化，為酸棗仁蛋白及其酶解產(chǎn)物在食品和保健食品行業(yè)的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 試劑與儀器

1.1 試驗(yàn)材料

酸棗仁蛋白：課題組自制；

堿性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶：上海源葉生物科技有限公司；

人工胃液：北京百奧萊博科技有限公司；

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS+)：北京索萊寶科技有限公司；

其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)儀器

高速中藥粉碎機(jī)：HX-400A型，浙江省永康市溪岸五金藥具廠；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-6型，金壇市佳美儀器有限公司；

集熱式磁力攪拌器：DF-101S型，金壇市醫(yī)療器械廠；

冷凍干燥機(jī)：SCIENTZ-50F型，寧波新芝凍干設(shè)備股份有限公司；

紫外分光光度計：UV-1700型，日本島津(中國)有限公司；

高效液相色譜儀：2010A型，日本島津(中國)有限公司；

臺式pH計：S220-K-CN型，梅特勒—托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司；

電子分析天平：AB265-S型，梅特勒—托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司；

高速離心機(jī)：Centrifuge 5840 R型，德國Eppendorf公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物制備 根據(jù)Wang等[9]的方法并修改。取酸棗仁蛋白，加入蒸餾水配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的蛋白溶液，m酶∶m底物為1∶50，加入堿性蛋白酶，調(diào)節(jié)溶液pH為8.5，酶解時間3 h，90 ℃水浴滅酶10 min，冷卻后用1.0 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至7.0，8 000 r/min離心10 min，取上清液，凍干得酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物(SZPHs)。

1.3.2 體外模擬胃腸消化 根據(jù)Zhang等[10]的方法并修改。取酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物，加入蒸餾水配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的溶液，與模擬人工胃液按V酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物∶V模擬人工胃液為1∶1混勻，用濃度為1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)溶液pH至3.0，向混合溶液中加入胃蛋白酶，使其用量為2 000 U/mL，37 ℃、100 r/min振蕩2 h，冷卻后用1.0 mol/L 的NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至7.5，將消化液與模擬腸液按V消化液∶V模擬腸液為1∶1混勻，加入胰蛋白酶，使其用量為100 U/mL，繼續(xù)消化2 h，100 ℃水浴滅酶10 min，冷卻后用1.0 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至7.0，8 000 r/min離心10 min，取上清液凍干得酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物消化物(SZPHs-GD)。

1.3.3 氨基酸組成分析 根據(jù)Wang等[9]的方法并修改。取SZPHs、SZPHs-GD各30 mg，加入4 mL濃度為6 mol/L 的HCl溶液，110 ℃反應(yīng)24 h。由于測定方法為酸水解法，色氨酸在測定過程中大部分被破壞，導(dǎo)致其含量較低，故不作分析。

1.3.4 分子量分布測定 參照Zhang等[10]的方法。色譜條件：色譜柱為Shodex OHpak SB-803 HQ GPC色譜柱；流動相為乙腈—水—三氟乙酸(V乙腈∶V水∶V三氟乙酸=20.0∶80.0∶0.2)；流速0.5 mL/min；柱溫30 ℃；紫外檢測波長220 nm；進(jìn)樣量20 μL。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)曲線計算各樣品分子量分布范圍：核糖核酸酶A(13.700 kDa)、人胰島素(5.808 kDa)、胸腺肽α1(3.108 kDa)、生長抑素(1.638 kDa)、甘氨酸—甘氨酸—甘氨酸(0.189 kDa)。

1.3.5 體外抗氧化活性測定

(1) DPPH自由基清除能力：根據(jù)Wen等[11]的方法并修改。取一定質(zhì)量的SZPHs及SZPHs-GD，加蒸餾水配制成不同質(zhì)量濃度的溶液；準(zhǔn)確稱取4.00 mg DPPH粉末，加95%乙醇超聲溶解定容至100 mL，制備0.04 mg/mL的DPPH溶液。分別吸取1 mL樣品溶液與DPPH溶液混勻，室溫下避光反應(yīng)30 min，測定517 nm處吸光度；以1 mL蒸餾水代替樣品溶液作為空白對照組，以0.5 mL蒸餾水+0.5 mL 95%乙醇混合溶液代替DPPH溶液作為樣品對照組，以維生素C為陽性對照組，并按式(1)計算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：

S——DPPH自由基/超氧陰離子清除率，%；

A0——空白對照組吸光值；

A1——樣品組吸光值；

A2——樣品對照組吸光值。

(2) ABTS+自由基清除能力：根據(jù)Chang等[12]的方法并修改。將5 mL濃度為7.4 mmol/L的ABTS+儲備液與88 μL濃度為2.6 mmol/L的過硫酸鉀溶液混勻，靜置12～16 h，配制成ABTS+儲備液。取ABTS+儲備液0.4 mL，用pH為7.4的PBS溶液稀釋，使734 nm處吸光度為0.7±0.2，制成ABTS+工作液。分別將200 μL ABTS+工作液與10 μL不同濃度的樣品溶液混勻，室溫避光反應(yīng)6 min，測定734 nm處吸光度值。用10 μL PBS溶液代替樣品溶液作為對照組，以維生素C為陽性對照組，按式(2)計算ABTS+自由基清除率。

(2)

式中：

S——ABTS+自由基清除率，%；

A0——空白對照組吸光值；

A1——樣品組吸光值。

(3) 超氧陰離子清除能力：采用鄰苯三酚自氧化法[13]。取pH為8.2的Tris-HC1溶液3 mL，加入不同質(zhì)量濃度的樣品溶液0.1 mL，(25.0±0.5) ℃水浴20 min，加入25 ℃預(yù)熱后的鄰苯三酚溶液(7 mmol/L)0.3 mL，混勻，25 ℃水浴4 min，迅速加入濃鹽酸1 mL，混勻，測定420 nm處吸光度值；以0.1 mL蒸餾水代替樣品溶液作為對照組，以3 mL蒸餾水代替鄰苯三酚溶液作為樣品對照組，以維生素C為陽性對照組，按式(1)計算超氧陰離子清除率。

(4) 羥基自由基清除能力：采用鄰二氮菲法[14]。取鄰二氮菲溶液(0.75 mmol/L)1 mL于試管中，加入PBS溶液(0.2 mol/L，pH=7.4)2 mL，再加入樣品溶液1 mL，混勻，加入FeSO4溶液(0.75 mmol/L)1 mL，混勻，加入0.025% H2O2溶液1 mL，混勻，37 ℃水浴1 h，測定536 nm處吸光度值；以1 mL蒸餾水代替樣品溶液作為對照組，以1 mL蒸餾水代替H2O2溶液作為樣品對照組，以維生素C為陽性對照組，按式(3)計算羥基自由基清除率。

(3)

式中：

S——羥基自由基清除率，%；

A0——空白對照組吸光值；

A1——樣品組吸光值；

A2——樣品對照組吸光值。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析 所有試驗(yàn)平行測定3次，結(jié)果取平均值，使用Origin 2019和SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 體外模擬消化前后的氨基酸組成變化

由表1可知，酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物及其消化物中谷氨酸(分別為17.66%，19.07%)、天冬氨酸(分別為7.92%，8.62%)、精氨酸(分別為6.84%，6.87%)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，其中天冬氨酸、谷氨酸等帶負(fù)電氨基酸(NCAA)為主要氨基酸，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為25.58%和27.69%，這是由于NCAA是種子類植物中主要的氨基酸[15]。研究[16]表明，NCAA可通過提供電子達(dá)到有效清除自由基的作用。SZPHs及SZPHs-GD中還具有一定的疏水性氨基酸(HAA，分別為16.13%，14.82%)，HAA的存在與其脂溶性有關(guān)，可通過與脂溶性自由基結(jié)合達(dá)到清除自由基的作用[17]。此外，SZPHs及SZPHs-GD中必需氨基酸(EAA)含量較高，且消化前后質(zhì)量分?jǐn)?shù)無顯著變化，分別為17.34%和17.14%，各氨基酸含量均達(dá)到WHO/FAO對成人需求量的要求，表明SZPHs具有一定營養(yǎng)價值。體外模擬消化試驗(yàn)表明，SZPHs經(jīng)體外模擬胃腸消化后，HAA含量有所降低，而親水性氨基酸、芳香族氨基酸(AAA)及NCAA含量增加，這種含量變化現(xiàn)象可能會對其體外抗氧化活性造成一定影響。

表1 SZPHs及SZPHs-GD的氨基酸組成?

2.2 體外模擬消化前后分子量分布變化

由表2可知，SZPHs及SZPHs-GD分子量主要在5 kDa以下，分別占其總比例的82.06%及86.79%。SZPHs經(jīng)體外模擬消化后，分子量>10 kDa的比例有所降低，分子量<5 kDa的比例有所增加，表明SZPHs經(jīng)體外模擬消化后，其肽鍵被進(jìn)一步破壞，產(chǎn)生了更多分子量較小的肽段。此外，分子量<1 kDa的肽因其較低的分子量而表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化活性[18]。SZPHs及SZPHs-GD所含<1 kDa的肽段分別占總比例的17.79%和19.67%，說明SZPHs及SZPHs-GD具有較好的抗氧化活性。

2.3 體外模擬消化前后的抗氧化活性變化

2.3.1 DPPH自由基清除活性 由圖1可知，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5～2.5 mg/mL時，SZPHs及SZPHs-GD的DPPH自由基清除活性與樣品濃度呈劑量依賴關(guān)系，且在質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL時，二者均達(dá)到其最大清除率(93.99%和81.25%)。說明SZPHs經(jīng)模擬胃腸消化后，在1.0～2.5 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，DPPH自由基清除率可達(dá)到72.89%～81.25%，具有較高的DPPH自由基清除活性，優(yōu)于小麥蛋白酶解產(chǎn)物[19](55.29%)、苦蕎蛋白酶解產(chǎn)物[18](71.91%)、蛋清多肽[20](69.20%)等。此外，經(jīng)體外模擬胃腸消化后，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時，DPPH自由基清除率由73.79%降至55.45%，可能是由于消化后HAA含量降低，其與脂溶性的DPPH結(jié)合能力降低，故DPPH自由基清除能力有所降低，與馬勇等[21]的結(jié)果類似。

2.3.2 ABTS+自由基清除活性 由圖2可知，當(dāng)質(zhì)量濃

表2 SZPHs及SZPHs-GD的分子量分布

度為0.5～2.5 mg/mL時，SZPHs及SZPHs-GD對ABTS+自由基清除活性隨質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，且在質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL時，二者均達(dá)到最大清除活性(86.59%和90.40%)。當(dāng)質(zhì)量濃度為1.0～2.5 mg/mL時，SZPHs-GD對ABTS+自由基的清除率可達(dá)到78.83%～90.40%，具有較好的ABTS+自由基清除活性，優(yōu)于其他蛋白酶解產(chǎn)物或多肽(大豆蛋白酶解物55.84%[22]，芝麻抗氧化肽51.26%[23]等)。SZPHs經(jīng)體外模擬胃腸消化后，所得產(chǎn)物SZPHs-GD對ABTS+自由基的清除能力增強(qiáng)，可能是由于SZPHs經(jīng)模擬胃腸消化后，親水性的肽和氨基酸含量增加，進(jìn)而增強(qiáng)了對ABTS+自由基的清除能力。綜上，SZPHs經(jīng)體外模擬消化后，可進(jìn)一步提升對ABTS+自由基的清除活性。

2.3.3 超氧陰離子清除活性 由圖3可知，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5～2.5 mg/mL時，SZPHs及SZPHs-GD對超氧陰離子的清除活性與樣品濃度呈正相關(guān)，二者均在2.5 mg/mL時具有最高的清除活性(43.19%和47.51%)。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5～2.5 mg/mL時，SZPHs-GD對超氧陰離子的清除率可達(dá)到30.46%～47.51%，具有較好的超氧陰離子清除活性。此外，SZPHs-GD的超氧陰離子清除活性較SZPHs略有提高，其中最高可提高近10%，可能是由于模擬胃腸消化后，芳香族氨基酸含量增加，其提供質(zhì)子能力增強(qiáng)，提高了對超氧陰離子的清除能力[13]。綜上，SZPHs經(jīng)體外模擬消化后，可進(jìn)一步提高其對超氧陰離子的清除活性。

圖1 SZPHs及SZPHs-GD的DPPH自由基清除率

圖2 SZPHs及SZPHs-GD的ABTS+自由基清除率

圖3 SZPHs及SZPHs-GD的超氧陰離子清除率

2.3.4 羥基自由基清除活性 由圖4可知，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5～2.5 mg/mL時，SZPHs及SZPHs-GD對羥基自由基的清除活性隨質(zhì)量濃度的增加逐漸增強(qiáng)，且在2.5 mg/mL時達(dá)到最大值(50.23%和32.66%)。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5～2.5 mg/mL時，SZPHs-GD對羥基自由基清除率可達(dá)9.92%～32.66%，具有一定的羥基自由基清除活性。經(jīng)過體外模擬消化后，SZPHs-GD對羥基自由基的清除活性略有降低，可能是由于消化后產(chǎn)生了對羥基自由基沒有清除作用的小肽或者氨基酸，與Barbara等[24]的結(jié)果類似。

3 結(jié)論

經(jīng)體外模擬胃腸消化后，酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物消化物中疏水性氨基酸含量有所降低，而帶負(fù)電氨基酸和親水性氨基酸含量升高，必需氨基酸含量無明顯變化，可達(dá)到WHO/FAO所要求的成人需求量，說明模擬胃腸消化對酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物營養(yǎng)價值影響較小。分子量分布研究表明，酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物經(jīng)體外模擬消化后，分子量>5 kDa的比例增加，表明模擬胃腸消化后，可進(jìn)一步降低其分子量。體外抗氧化試驗(yàn)表明，酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物消化物對DPPH自由基清除率最高可達(dá)81.25%，對ABTS+自由基清除率最高可達(dá)90.40%，對超氧陰離子清除率最高可達(dá)47.51%，對羥基自由基清除率最高可達(dá)32.66%，具有較好的體外抗氧化活性。綜上，酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物經(jīng)模擬胃腸消化后，所得產(chǎn)物酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物消化物仍具有較好的氨基酸組成及良好的抗氧化活性，可作為一種潛在的抗氧化劑應(yīng)用至食品行業(yè)中。后續(xù)將對酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物及酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物消化物在細(xì)胞試驗(yàn)中的抗氧化作用進(jìn)行研究，并通過凝膠色譜等技術(shù)對酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物及酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物消化物進(jìn)行分離純化，以期得到具有高抗氧化活性的肽段。

圖4 SZPHs及SZPHs-GD的羥基自由基清除率