清肺消痤合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

唐靜月，胡敏敏，卞振華，袁曉航

清肺消痤合劑是醫(yī)院院內(nèi)制劑，全方由枇杷葉、桑白皮、黃芩、黃柏、連翹等十味中藥組成，具有清熱瀉火、消腫散結(jié)、涼血解毒的功效，臨床用于治療痤瘡、粉刺、炎性丘疹，療效顯著。據(jù)研究表明，黃芩苷具有抗炎、抗氧化等作用；黃柏具有顯著的抗菌、抗過敏等作用，為皮膚科常用藥材。為了更好地控制清肺消痤合劑的質(zhì)量并確保其臨床有效性，本研究自2019 年3―11 月采用薄層色譜法對連翹、黃芩、黃柏進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜法對黃芩苷和小檗堿進(jìn)行含量測定。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent 1200 高效液相色譜儀（DAD 二極管陣列檢測器）；Sartorius BSA224S-CW 分析天平；KQ-100 超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；UV-8紫外分析儀（上海分析儀器廠無錫分廠）。

1.2 材料

連翹、黃芩、黃柏對照藥材（批號120908-201216、120955-201810、121510-201606）及連翹苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿對照品（批號110821-201816、110715-201821、110713-201814）均購自中國食品藥品檢定研究院；清肺消痤合劑（批號190701、190702、190703，自制）；乙腈為色譜純，娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

1.3 薄層鑒別

1.3.1

連翹取清肺消痤合劑10 mL，加入乙酸乙酯20 mL，振搖2次，合并乙酸乙酯液并蒸干，加甲醇溶解殘渣，定容至2 mL，即得供試品溶液。稱取連翹對照藥材1 g，加石油醚（30～60 ℃）20 mL，密塞，超聲15 min，濾過后棄去石油醚液，殘渣揮干溶劑，加甲醇20 mL，超聲20 min，濾過后濃縮至5 mL即得對照藥材溶液。稱取連翹苷適量，加甲醇配得1 mg/mL 對照品溶液。按處方比例稱取缺連翹的其余9 味中藥飲片，照合劑制備工藝制得缺連翹的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得陰性樣品溶液。吸取上述四種溶液各3 μL，依次點于同一硅膠G 薄層板，展開系統(tǒng)選擇三氯甲烷-甲醇（5∶1），10%硫酸乙醇溶液噴淋后置烘箱105 ℃加熱5 min。

1.3.2

黃芩取清肺消痤合劑10 mL，加稀鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至2，加乙酸乙酯20 mL，振搖2次，合并乙酸乙酯液并蒸干，加甲醇溶解殘渣，定容至2 mL，即得供試品溶液。稱取黃芩對照藥材1 g，加乙酸乙酯-甲醇（3∶1）溶液30 mL，回流提取30 min，濾過后蒸干，加甲醇溶解殘渣，定容至5 mL，即得對照藥材溶液。稱取黃芩苷適量，加甲醇配得1 mg/mL對照品溶液。按處方比例稱取缺黃芩的其余9味中藥飲片，照合劑制備工藝制得缺黃芩的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得陰性樣品溶液。吸取供試液及陰性樣品溶液各1 μL，對照藥材及對照品溶液各3 μL，依次點于同一硅膠G 薄層板，展開系統(tǒng)選擇甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（9∶3∶2∶2），2%三氯化鐵乙醇溶液噴淋后于日光下檢視。

1.3.3

黃柏取清肺消痤合劑40 mL，蒸干，加甲醇溶解殘渣，定容至2 mL，即得供試品溶液。稱取黃柏對照藥材0.1 g，加1%醋酸甲醇溶液40 mL，超聲20 min，濾過后蒸干，加甲醇溶解殘渣，定容至2 mL，即得對照藥材溶液。稱取鹽酸小檗堿適量，加甲醇配得1 mg/mL 對照品溶液。按處方比例稱取缺黃柏的其余9 味中藥飲片，照合劑制備工藝制得缺黃柏的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得陰性樣品溶液。吸取上述四種溶液各3 μL，依次點于同一硅膠G 薄層板，展開系統(tǒng)選擇乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水（10∶7∶1∶1），于波長 365 nm 的紫外光燈下觀察。

1.4 含量測定

1.4.1

色譜條件 色譜柱：Eclipse XDB-C（250 mm×4.6 mm，5 μm）。流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸二氫鉀溶液（B）梯度洗脫（0～5 min，8%～9% A；5～15 min，9% A；15～17 min，9%～16% A；17～30 min，16%A；30～32 min，16%～25% A；32～45 min，25% A）。檢測波長為325 nm，柱溫30 ℃，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL。

1.4.2

溶液的制備

1.4.2.1

對照品溶液的制備 精密稱定適量對照品，加甲醇分別配得含黃芩苷1.66 mg/mL、含鹽酸小檗堿0.47 mg/mL 的對照品儲備液。各精密量取5 mL至25 mL量瓶，加甲醇定容，即得。

1.4.2.2

供試品溶液的制備 精密量取本品1 mL至5 mL 量瓶，加甲醇超聲（100 W，40 kHz）10 min，定容，即得。

1.4.2.3

陰性樣品溶液的制備 分別按處方比例稱取其余9味中藥飲片，按合劑制備方法制得缺黃芩、缺黃柏的陰性樣品，按“1.4.2.2”項配制，即得。

1.4.3

方法學(xué)考察 分別將上述3 種溶液按“1.4.1”項條件注入色譜儀，測定，對專屬性、線性、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收率進(jìn)行考察。

1.4.4

樣品測定 取清肺消痤合劑3批樣品配制供試液，照“1.4.1”項條件進(jìn)樣并計算含量。

2 結(jié)果

2.1 薄層鑒別

連翹、黃芩和黃柏薄層色譜圖中供試品在與對照藥材、對照品對應(yīng)位置處，呈現(xiàn)顏色一致的斑點，在陰性樣品圖譜中未出現(xiàn)，對鑒別無干擾，結(jié)果見圖1～3。

2.2 含量測定

2.2.1

專屬性考察 分別將對照品溶液、供試品溶液和缺黃芩、缺黃柏陰性溶液按“1.4.1”項條件注入色譜儀，測定。供試品圖譜中2種成分峰形良好，與相鄰色譜峰分離完全，陰性無干擾，結(jié)果見圖4。

圖4 HPLC色譜圖：A為混合對照品；B為供試品；C為缺黃芩陰性樣品；D為缺黃柏陰性樣品

2.2.2

線性關(guān)系考察 分別精密移取1.0，1.5，2.0，3.0，4.0，5.0 mL 對照品溶液至 5 mL 量瓶，加甲醇定容。按“1.4.1”項條件測定，記錄峰面積。橫坐標(biāo)、縱坐標(biāo)分別為對照品濃度和峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系試驗結(jié)果

2.2.3

精密度試驗 按“1.4.1”項下條件連續(xù)注入對照品溶液6次，記錄黃芩苷、小檗堿峰面積。結(jié)果

RSD

分別為0.08%、0.12%。

2.2.4

穩(wěn)定性試驗 取本品（批號190701）配制供試液，在0，2，4，6，8，10，12 h時進(jìn)樣，記錄黃芩苷、小檗堿峰面積。結(jié)果

RSD

分別為1.24%、0.46%。

2.2.5

重復(fù)性試驗 取本品（批號190701）6 份，配制供試液，按“1.4.1”項下條件測定，計算各成分含量的

RSD

值。結(jié)果

RSD

分別為2.43%、1.74%。

2.2.6

回收率試驗 精密移取已知含量的樣品0.5 mL 至5 mL 量瓶，平行6 份，分別加入適量黃芩苷和鹽酸小檗堿對照品，配制供試液，按“1.4.1”項下條件測定，計算各成分回收率及RSD，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率實驗結(jié)果（n=6）

2.2.7

樣品測定 3 批樣品中黃芩苷和小檗堿的含量結(jié)果見表3。

表3 清肺消痤合劑含量測定結(jié)果/（mg/L，）

3 討論

本研究通過TLC 考察了方中主要藥味，結(jié)果顯示連翹、黃芩、黃柏的薄層鑒別斑點清晰，專屬性強。試驗對連翹進(jìn)行鑒別時，曾選擇多種展開系統(tǒng)，分離效果不佳，選擇三氯甲烷-甲醇（5∶1）條件后，發(fā)現(xiàn)各項指標(biāo)良好。試驗中黃芩的鑒別方法是在藥典方法基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，調(diào)整展開系統(tǒng)溶劑比例，顯色后日光下觀察，操作簡便。本研究前期研究發(fā)現(xiàn)，方中枇杷葉采用正己烷-乙酸乙酯（7∶3）、三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）、三氯甲烷-丙酮（12∶1）等多種展開系統(tǒng)，均不能有效分離斑點，斑點間界限模糊，比移值不一致。桑白皮藥材進(jìn)過多次展開系統(tǒng)的調(diào)整，陰性樣品色譜圖仍舊顯現(xiàn)斑點，存在相似成分，綜合考慮后不選擇兩者進(jìn)行薄層鑒別。

此外，當(dāng)流動相為乙腈-0.1%磷酸水時，色譜峰存在拖尾現(xiàn)象，改用乙腈-0.1 %磷酸二氫鉀溶液后，黃芩苷、小檗堿和相鄰色譜峰分離完全，峰型良好，故選其作為含量測定流動相。方中君藥為枇杷葉與桑白皮，枇杷葉中齊墩果酸、熊果酸紫外吸收波長為210 nm，處于末端吸收狀態(tài)，干擾較大。本試驗擬建立同時測定桑皮苷A、黃芩苷和小檗堿的HPLC 含量測定方法，但實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)桑白皮中桑皮苷A 陰性存在干擾，故不選擇枇杷葉與桑白皮為含量測定對象。

本研究建立了TLC 法鑒別清肺消痤合劑中連翹、黃芩及黃柏，建立了HPLC 法測定黃芩苷及小檗堿含量，可簡便準(zhǔn)確的反映該制劑質(zhì)量，為其質(zhì)量控制提供了理論依據(jù)，可作為有效控制該制劑質(zhì)量的方法。