不同方式發(fā)酵桑葚果酒的功能性及香氣成分比較

汪沙，盧紅梅，陳莉，牟燦燦，吳震，李榮源

（貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州貴陽 550025）

桑葚（Mulberry fruit）為?？坡淙~喬木桑樹（Morus alba L.）的聚花果，又名桑果[1]。桑葚富含生物堿、多酚、黃酮類等化合物[2]，具有滋陰補血、保肝護腎、增強免疫力及促進新陳代謝等功效[3]；桑葚果不僅含有豐富的人體自身不能合成的多不飽和脂肪酸、氨基酸[4,5]，還有人體所需要的微量元素[6]，白藜蘆醇具有保護心血管、神經(jīng)系統(tǒng)、抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、抗衰老、抗氧化和保肝等多種對人體有益的藥理功能，還能激發(fā)某些人體內(nèi)抑癌基因表達，抑制癌細胞生長，并能阻止形成血液栓塞，被譽為繼紫衫醇之后又一種新的抗癌物質[7]。但桑葚不利于保藏，桑葚貯藏溫度為6 ℃時，在第3 d就會發(fā)生腐爛[8]，因而以桑葚鮮果發(fā)酵而成的桑葚果酒集天然、營養(yǎng)、保健于一體，既能使不易貯藏的桑葚得到充分利用，又可豐富酒類品種、繁榮果酒市場。

不同的原料及發(fā)酵工藝得到的桑葚果酒品質和風味也不同，譚霄[9]用產(chǎn)γ-氨基丁酸釀酒酵母JM037釀造出的桑葚果酒檢測出27種香氣成分，劉偉[10]用葡萄酒果酒專用SY酵母釀造的桑葚果酒檢測出58種香氣成分，曾霞[11]通過對桑葚酒的工藝進行優(yōu)化得到具有65種香氣成分的桑葚果酒，目前，關于對影響桑葚果酒功能性及香氣成分的工藝研究主要包括初始糖度、初始Ph、酵母菌株、發(fā)酵溫度等的選擇上，卻鮮有研究發(fā)酵方式對其功能性及香氣物質的影響。本文以分批發(fā)酵、分批補料發(fā)酵、分批帶渣發(fā)酵三種發(fā)酵方式發(fā)酵桑葚果酒，對桑葚酒功能性物質含量進行對比，采用固相微萃取聯(lián)合氣相色譜-質譜（SPME/GCMS）對三種桑葚果酒香氣成分進行分析測定，得出最佳的發(fā)酵方式。

1 材料與方法

1.1 主要材料

貴州省開陽縣：九成熟的“大十”桑葚。

1.2 主要試劑

白藜蘆醇：北京索萊寶科技有限公司；甲醇、乙腈、乙酸乙酯：天津市科密歐化學試劑；有限公司；無水硫酸鈉、氯化鈉、氫氧化鈉、可溶性淀粉、硼酸鈉、酚酞：成都金山化學試劑有限公司；鹽酸：天津市天大化工實驗廠；碘：天津市津北精細化工有限公司；碘化鉀：天津市致遠化學試劑有限公司；胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏：上海博微生物科技有限公司；次甲基藍：天津光復化學試劑有限公司。以上皆為分析純。

1.3 主要儀器

1260II高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；N-1100旋轉蒸發(fā)儀、SB-1100水浴鍋，上海愛朗儀器有限公司；Thermo賽默飛TRACE?1310氣相色譜儀、JK-5L空氣發(fā)生器、Thermo Fisher X2電感耦合等離子體質譜儀，北京京科瑞達科技有限公司；LS-B50L立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；SW-CJ-1F型潔凈工作臺，上海雷韻試驗儀器制造有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 發(fā)酵工藝

1.2.1.1 分批發(fā)酵

對桑葚進行破碎取汁并依次加K2S2O5（160 mg/L）、果膠酶（30 mg/L），靜置24 h后，過濾取清汁，添加白砂糖調整糖含量至240 g/L，添加酵母（300 mg/L）于發(fā)酵罐中進行發(fā)酵，發(fā)酵溫度22～26 ℃，當糖含量降至4 g/L左右時，利用經(jīng)殺菌的300目濾布進行過濾，在15 ℃環(huán)境下密封避光貯存1個月后，在10 ℃條件下進行滿罐密封避光保存，陳釀時間3個月。

1.2.1.2 分批補料發(fā)酵

對桑葚進行破碎取汁，取果汁的四分之一按1.2.1.1進行發(fā)酵，剩下的果汁按1.2.1.1添加K2S2O5和果膠酶處理后，放入4 ℃冰箱中保存，分三次每隔一天平均補加剩下的桑葚果汁，其余處理同1.2.1.1。

1.2.1.3 分批帶渣發(fā)酵

對桑葚進行破碎取汁，添加與果汁同等質量的桑葚渣后同1.2.1.1處理。

1.2.2 感官評價

選取10名經(jīng)過專業(yè)培訓有經(jīng)驗的感官評價人員對桑葚果酒進行感官評價，其感官評分細則如表1。

表 1感官評分細則Table 1 Details of sensory scoring

1.2.3 甲醇含量的測定

GC條件：進樣口溫度250 ℃，初始溫度為50 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升至65 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min升至70 ℃，保持2 min后，以30 ℃/min升至250 ℃。檢測器溫度：250 ℃，氫氣流量：40 mL/min，空氣流量：350 mL/min，載氣流量：40 mL/min，分流比：30:15，進樣量：2 μL。

1.2.4 白藜蘆醇的測定

參照《GB/T 15038-2006葡萄酒、果酒通用分析方法》[12]。

1.2.5 總花色苷的測定

參照Giusti M M[13]

1.2.6 多酚的測定

參照李靜[14]。

1.2.7 黃酮的測定

參照楊林娥[15]。

1.2.8 桑葚果酒揮發(fā)性成分的測定

GC條件：進樣口溫度為250 ℃，初始溫度40 ℃，保持3 min，以10 ℃/min升至230 ℃，保持6 min；載氣為高純He（99.999%）；載氣流量為恒定流速1 mL/min。MS條件：離子源為EI源，離子源溫度200 ℃，電子能量70 eV，發(fā)射電流1 mA，檢測器電壓2000 V，接口溫度250 ℃。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析

采用orign 8.6、excel對數(shù)據(jù)進行繪圖、分析。

2 結果與分析

2.1 感官評價結果

如表2所示，分批發(fā)酵桑葚果酒感官評分（78）最低，分批補料發(fā)酵桑葚果酒感官評分最高（90），略高于分批帶渣發(fā)酵桑葚果酒的感官評分（88），這表明分批補料發(fā)酵和分批帶渣發(fā)酵能提高桑葚果酒的感官品質。

表2 感官評價結果/分Table 2 The results of sensory evaluation

2.2 不同發(fā)酵方式對桑葚果酒甲醇、白藜蘆醇的影響

甲醇是果酒釀造過程中生成的副產(chǎn)物，人一旦攝入5 g會出現(xiàn)嚴重中毒，超過12.50 g可能導致死亡[16]。根據(jù)NY/T 1508-2017《綠色食品果酒》[17]中規(guī)定果酒的甲醇≤0.40 g/L，由圖1可知，三種桑葚果酒均符合標準，分批帶渣發(fā)酵桑葚果酒中甲醇含量高是因為桑葚果渣中的果膠在果膠酶的作用下生成甲醇，這與YURI L[18]研究結果相同。

圖1 三種桑葚果酒中甲醇、白藜蘆醇含量Fig.1 The content of methanol and resveratrol in three mulberry wines

白藜蘆醇是桑葚酒重要的功能性成分，也是影響桑葚酒市場競爭力的一個重要因素[19]。分批帶渣發(fā)酵桑葚果酒白藜蘆醇含量（0.19 mg/100 mL）是分批發(fā)酵桑葚果酒9.79倍，分批補料發(fā)酵桑葚果酒的3.80倍，分批帶渣發(fā)酵能顯著提高桑葚果酒中白藜蘆醇含量。

2.3 不同發(fā)酵方式對桑葚果酒多酚、黃酮、總花色苷的影響

多酚、黃酮、總花色苷具有抗癌、降血糖、護肝臟等多種生理功能，是影響桑葚果酒品質的重要指標[20]。由圖2可知，分批帶渣發(fā)酵桑葚果酒的多酚（2020.89 mg/L）、黃酮（310.56 mg/L）、總花色苷（97.25 mg/L）含量最高，分別比分批發(fā)酵桑葚果酒提高了32.07%、41%、29.29%，這表明帶渣發(fā)酵有利于提高桑葚果酒中功能性成分的增加，有助于提高桑葚果酒的品質。

圖2 三種桑葚果酒多酚、黃酮、總花色苷含量Fig.2 Retention rates of anthocyanins, polyphenols and flavonoids in three mulberry fruit wines

2.4 桑葚果酒中香氣成分成分分析

2.4.1 不同發(fā)酵方式發(fā)酵桑葚果酒的總香氣成分GC-MS分析

圖3 分批發(fā)酵桑椹酒揮發(fā)性成分總離子圖譜Fig.3 Total ion spectrum of volatile components in batch fermentation of mulberry wine

圖4 分批補料發(fā)酵桑葚酒揮發(fā)性成分總離子圖譜Fig.4 Total ion spectrum of volatile components in fed-batch fermentation of mulberry wine

圖5 分批帶渣發(fā)酵桑葚酒揮發(fā)性成分總離子圖譜Fig.5 Total ion spectrum of volatile components of mulberry wine in batch fermentation with residue

本試驗在3種桑葚果酒樣品中共檢測出191種香氣成分。如圖6和表3所示，主要香氣物質有20種（百分含量＞1%），酯類種類和酯類、醇類百分含量高于其他種類香氣成分，烯類、酚類、苯類百分含量最低。分批發(fā)酵桑葚果酒含烷烴類9種（2.55%）、醇類13種（25.96%）、酯類55種（54.71%）、醛酮類25種（5.34%），酸類11種（5.44%），苯環(huán)及酚類9種(0.45%），烯類2種(0.13%），其他物質9種(1.60%），共計133種；分批補料發(fā)酵桑葚果酒含烷烴類10種（1.60%）、醇類14種（26.36%）、酯類61種（57.48%）、醛酮類22種（4.43%），酸類12種（5.59%），苯環(huán)及酚類10種（0.60%），烯類2種（0.20%），其他物質11種（1.43%），共計142種。分批帶渣發(fā)酵桑葚果酒香氣成分種類最多，含烷烴類9種（1.43%）、醇類16種（29.70%）、酯類57種（6.20%）、醛酮類27種（4.64%），酸類11種（3.62%），苯環(huán)及酚類10種（0.68%），烯類4種（0.70%），其他物質12種（1.35%），共計146種。三種不同發(fā)酵方式發(fā)酵的桑葚果酒風味物質種類均高于孔燕[21]（44種）、曾霞[11]（70種）、商敬敏[22]（28種）等人發(fā)酵的桑葚果酒。

圖6 揮發(fā)性物質種類（a）、百分含量圖(b)Fig.6 Types of volatile substances (a) and percentage content diagram (b)

表3 三種桑葚酒主要香氣成分含量表（百分含量＞1%）Table 3 Contents of main aroma components of three mulberry wines

由圖7可知，三種桑葚果酒中共有香氣物質99種。分批發(fā)酵和分批補料發(fā)酵、分批帶渣發(fā)酵共有香氣物質17、11種，分批補料發(fā)酵和分批帶渣發(fā)酵共有香氣物質4種；分批發(fā)酵、分批補料發(fā)酵、分批帶渣發(fā)酵分別含特有香氣物質19、22、19種。

圖7 三種桑葚果酒香氣成分venn圖Fig.7 Venn diagram of aroma components in three mulberry wines

2.4.2 醇類組分比較

醇類主要是酒精發(fā)酵過程中氨基酸或糖代謝的產(chǎn)物[23]。分批發(fā)酵、分批補料發(fā)酵、分批帶渣發(fā)酵桑葚果酒醇類占各自香氣成分總量的25.96%、26.37%、29.70%。醇類多具有不愉快的香氣，但在三種桑葚果酒共有的主要醇類中，3-甲基-1-丁醇（分批發(fā)酵10.32%、分批補料發(fā)酵16.70%、分批帶渣發(fā)酵15.33%）百分含量最高，賦予桑葚酒特殊的植物香，乙醇（3.59%、3.61%、3.48%）具有特殊的、令人愉快的香味，苯乙醇（10.26%、3.40%、6.02%）具有獨特的玫瑰花香、丁香、茉莉花香等多樣風味。

2.4.3 酯類組分比較

酯類是發(fā)酵酒揮發(fā)性成分的重要組成部分，也是構成香氣骨架的關鍵成分[24]，三種桑葚果酒中共檢測出酯類物質77種，其中主要酯類物質有10種，辛酸乙酯百分含量（10.80%、10.00%、10.66%）最高，具有菠蘿香、蘋果香、似白蘭地酒香，其次為癸酸乙酯（5.34%、10.11%、10.50%）、乙酸乙酯（7.83%、9.87%、8.78%），具有梨香、椰子香、葡萄酒香、白蘭地香和果香，剩下的乙酸異戊酯（1.73%、1.94%、3.24%）、庚酸乙酯（0.55%、0.94%、1.49%）、月桂酸乙酯（6.00%、6.54%、5.36%）、肉豆蔻酸乙酯（0.44%、1.46%、0.61%）、乙酸苯乙酯（2.83%、3.83%、1.31%）、己酸乙酯（5.93%、6.38%、0.07%）分別賦予了桑葚果酒蘋果香、菠蘿香、花香、椰子香等香味，草酸二丁酯（4.90%）是分批發(fā)酵桑葚酒中特有的酯類物質，呈菠蘿香、似朗姆酒香。

2.4.4 其他組分比較

三種桑葚酒中檢測出的除醇類、酯類的其他組分共97種，共有主要香氣成分有苯甲醛（0.08%、0.64%、1.09%）：杏仁香；辛酸（1.04%、0.96%、0.57%）：呈水果香氣；乙醛（1.56%）為分批發(fā)酵桑葚酒主要香味物中特有的香氣成分，具有果香、咖啡香、酒香、青香。乙酸為分批發(fā)酵（3.38%）、分批補料發(fā)酵（3.79%）桑葚酒共有香氣成分，呈酸味。

2.5 分批帶渣發(fā)酵桑椹酒中的特有香氣物質分析

分批帶渣發(fā)酵桑葚果酒特有的香氣物質共有17種：3-甲基丁醛、正丁醇、異丙醇、1-辛烯-3-醇、2-乙基己醇、壬醇、丁酸乙酯、庚酸甲酯、2-辛烯酸乙酯、苯甲酸甲酯、苯丙酸乙酯、β-月桂烯、3-蒈烯、3-甲基丁酸、反式-2-己烯酸、2-庚酮、2,5-二甲?；秽Ｆ渲?-甲基丁醛具有蘋果香；1-辛烯-3-醇有蘑菇、薰衣草、玫瑰和干草香氣；壬醇帶有甜而青的玫瑰花蠟和果香的脂蠟香氣；丁酸乙酯極易擴散，帶有清靈強烈的甜果香，有菠蘿、香蕉、蘋果氣息；苯甲酸甲酯具有濃郁的冬青油香氣；3-蒈烯具有強烈的松木樣香氣；2-庚酮有類似梨的水果香味。

2.6 主要香氣成分與感官得分相關性分析

圖8 香氣成分與感官得分的相關性熱圖Fig.8 Heat map of the correlation between aroma components and sensory scores

20種主要香氣成分含量與桑葚酒各模塊感官評價得分的相關性如圖所示，香氣成分含量與滋味和澄清度相關性不大；乙醛、苯乙醛、草酸二丁酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸、己酸乙酯與香氣呈正相關，肉豆蔻酸乙酯、辛酸、3-甲基-1-丁醇、乙酸乙酯與香氣呈負相關；乙醛、乙醇、苯乙醇、草酸二丁酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、月桂酸乙酯、己酸乙酯、苯甲醛、異丁醇、3-甲基-1-丁醇、正己醇、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙基9-癸烯酸酯與桑葚果酒的典型性相關性最為顯著，前8種呈負相關，后7種呈正相關。

3 結論

分批補料發(fā)酵、分批帶渣發(fā)酵桑葚果酒感官評分明顯高于分批發(fā)酵；分批帶渣發(fā)酵桑葚果酒功能性成分含量最高，白藜蘆醇含量（0.19 mg/100 mL）是分批發(fā)酵桑葚果酒9.79倍，分批補料發(fā)酵桑葚果酒的3.80倍，總花色苷97.25 mg/L，是鈕成拓等[25]發(fā)酵的桑椹酒的1.29倍；黃酮（310.56 mg/L）、多酚（2020.89 mg/L）；分批帶渣發(fā)酵香氣成分最多（146種）；分批發(fā)酵特有的主要香氣成分最多（2種），總香氣成分種類最少（133種）；分批補料發(fā)酵桑葚酒含香氣成分142種。三種不同發(fā)酵方式發(fā)酵的桑葚果酒風味物質種類均高于孔燕[21]、曾霞[11]、商敬敏[22]等人發(fā)酵的桑葚果酒。20種主要香氣成分與桑葚果酒典型性的相關性最為顯著。以感官評價、功能性成分、香氣成分對三種發(fā)酵方式得到的桑葚果酒進行綜合評價，分批帶渣發(fā)酵不僅有利于桑葚果酒功能性成分含量的提高，還能增加桑葚酒風味物質的多樣性。