小磨香油芝麻渣中類黑精的提取及抗氧化活性分析

毛肇潔，林冰潔，余遠，王霞,2，咸麗，張羽，楊忠欣，張豐香,2

（1.濰坊醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，山東濰坊 261053）（2.濰坊市食品營養(yǎng)與安全重點實驗室，山東濰坊 261053）（3.瑞福油脂股份有限公司，山東濰坊 261057）

芝麻在我國已經(jīng)有兩千多年的栽培史，是重要的油料作物之一，香油源于芝麻，又稱為芝麻油、麻油，是中國傳統(tǒng)的調味植物油。其中，用水代法加工制取的芝麻香油稱為小磨香油，其制油工藝具有操作溫度低、營養(yǎng)成分及香味物質損失少的優(yōu)點，是中國傳統(tǒng)的、特有的制油方法，在我國已有600多年歷史[1]。小磨香油較冷軋香油儲藏穩(wěn)定性高，產(chǎn)品呈琥珀色、香味濃郁、口感綿長，其營養(yǎng)豐富并具有獨特的風味，深受世界各國消費者的喜愛，除在我國香油市場占主導地位，還遠銷韓國、日本、東南亞等，廣受國際贊譽。

焙炒是小磨香油的關鍵工藝，在150~200 ℃高溫條件下，芝麻當中會發(fā)生一系列的化學反應，其中最主要的就是美拉德反應，使焙炒后的芝麻香味濃郁，較多研究者認為是芝麻中含有的還原糖和氨基酸在焙炒過程中生成的美拉德反應產(chǎn)物[2]，經(jīng)水代法提取香油后剩余的芝麻渣呈深褐色[3]。美拉德反應產(chǎn)物中，改變食品色澤的這類物質被稱類黑精，是美拉德反應后期生成的一類褐色的大分子含氮化合物[4]。研究發(fā)現(xiàn)，類黑精不僅能賦予食物色澤和風味，還有很好的生物活性，如抗氧化、抑菌、抗炎、益生元活性等[5]，類黑精的結構目前尚未得出定論，但現(xiàn)有的研究表明類黑精的主要是由重復單元的吡咯或呋喃組成的聚合物。小磨香油加工剩余的芝麻渣仍然具有很高的營養(yǎng)成分，若未能及時處理，當作廢料丟棄或者只是用來做肥料，則對資源造成了浪費[6]。目前絕大部分芝麻渣僅是簡單的作為飼料處理，對其中美拉德反應產(chǎn)物的研究不足，影響芝麻渣深度的開發(fā)利用。因此，本研究主要圍繞小磨香油芝麻渣中類黑精的提取及活性展開，為芝麻渣的深度開發(fā)利用提供一定的科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

新鮮小磨香油芝麻渣，瑞福油脂股份有限公司；牛血清蛋白、DPPH，Sigma公司；考馬斯亮藍G250、葡萄糖、PBS、抗壞血酸，北京索萊寶科技有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 儀器與設備

臺式冷凍離心機（3-16KL），德國Sigma公司；數(shù)控超聲波清洗器（KQ-500DE），昆山市超聲儀器有限公司；臺式酸度計（FE28），梅特勒-托利多集團；紫外可見分光光度計（UV-5100B），上海元析儀器有限公司；酶標儀（Thermo1510），美國賽默飛世爾科技公司；冷凍干燥機（FDU-2110），日本EYELA公司；電子舌（SA402B），日本INSENT；傅里葉紅外光譜儀（Nicolet iS50），美國Thermo公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 類黑精的提取方法

將芝麻渣進行冷凍干燥，用30%~60%沸程的石油醚對干燥后的芝麻渣進行脫脂[7]。準確稱量1 g脫脂芝麻渣樣品6份，分別加入去離子水，pH 8、pH 10的水溶液，體積分數(shù)為30%、60%、90%的乙醇溶液50 mL，100 Hz超聲提取1 h；5000 r/min離心10 min；取上清液，在420 nm下測其吸光度值[8,9]，吸光值越大表示類黑精含量越高；將剩余上清液收集透析，截留分子量為14 ku，時間24 h，間隔4~6 h換水，透析所得產(chǎn)物冷凍干燥，即得芝麻渣類黑精組分，-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 類黑精組分中蛋白和總糖的測定

采用考馬斯亮藍法[10]；總糖的測定采用苯酚-硫酸法[11]。

1.3.3 類黑精及芝麻渣溶液滋味測定

將不同溶液提取類黑精后離心剩余的芝麻渣中加入電子舌基準液50 mL，100 Hz超聲提取1 h，過濾，得到濾液，用于測定苦味；分別稱取60%乙醇和pH 10.0堿提取的類黑精0.3 g和0.5 g溶于100 mL基準液中，過濾之后利用電子舌對其苦、澀、咸、鮮、酸五味進行測定。測量循環(huán)次數(shù)為四次。

1.3.4 類黑精抗氧化活性測定

1.3.4.1 清除·OH的能力

分別配置0.1、1、2、5 mg/mL的樣品溶液和Vc溶液，將Vc作為陽性對照，不加樣品溶液作為空白對照，參照WANG等[12]的方法。分別吸取200 μL不同濃度的溶液置于1.5 mL的離心管中，然后依次加入150 μL的7.5 mmol/L硫酸亞鐵溶液、300 μL 8.0 mmol/L水楊酸-乙醇溶液和300 μL 7.5 mmol/L雙氧水溶液，旋渦震蕩混勻后在37 ℃下反應45 min，用酶標儀在510 nm下測溶液的吸光度值。按下列公式計算類黑精的羥自由基清除率：

注：OD空為不加樣品的空白對照吸光度，OD樣為加入樣品溶液的吸光度。

1.3.4.2 還原力的測定

配置1 mg/mL和5 mg/mL的樣品溶液和Vc溶液，Vc作為陽性對照，參考OYAIZU[13]的方法添加試劑，測溶液在700 nm處吸光度值。

1.3.4.3 DPPH·清除率的測定

分別配置0.1 mg/mL、1 mg/mL、5 mg/mL的樣品溶液和Vc溶液，參照SHYU等[14]的方法測定芝麻渣類黑精DPPH 自由基清除率。

1.3.5 傅里葉紅外光譜儀測定類黑精結構將冷凍干燥后的類黑精樣品與純KBr研細均勻，置于模具中，用(5~10)×107Pa壓力在油壓機上壓成透明薄片，采用傅立葉變換紅外光譜儀在4000~400 cm-1波數(shù)范圍測定吸收光譜。掃描次數(shù)16次，分辨率4 cm-1。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)表示為平均值±標準偏差（SD），利用t檢驗進行組間差異比較、spearman相關性檢驗進行關聯(lián)性分析，p<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。采用GraphPad Prism 8.0等軟件進行數(shù)據(jù)處理和繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同溶液對類黑精提取的影響

本實驗采用去離子水、不同pH值的堿溶液和不同濃度的乙醇溶液對冷凍干燥后的芝麻渣類黑精進行提取，采用420 nm吸光度值的大小表征類黑精溶出量的多少[8]。實驗結果如圖1所示。隨著溶液pH值的增加，提取溶液的顏色越深，吸光度值越大，pH 10.0提取類黑精的吸光度值為1.86；采用不同濃度乙醇提取時，吸光度值在60%乙醇濃度時有最大值1.60，90%乙醇取液的吸光度值最低。因此，本實驗主要對去離子水提、60%醇提和pH 10.0堿提的芝麻渣類黑精展開研究，與咖啡中的類黑精提取不同，焙烤芝麻中類黑精多采用乙醇浸提法提取，如SHYU[15]和YOO[16]等都采用了高濃度的乙醇對焙烤芝麻中的類黑精進行了提取，在提取劑中適當添加有機溶劑可以減少蛋白的溶解，提高提取效果[17]。

圖1 不同提取溶液在A420 nm吸光度值Fig.1 Absorbance values of different extraction solutions in A420nm

2.2 不同溶液提取類黑精組份中蛋白和總糖的含量

類黑精是還原性的糖和游離的氨基酸發(fā)生美拉德反應的末期產(chǎn)物，是一類大分子、含氮、帶有負電荷、呈褐色的聚合物，現(xiàn)在研究認為類黑精可以分為多聚糖型類黑精和蛋白質型類黑精兩大類，如咖啡中的類黑精多為多聚糖型，而焙烤食品中的多為蛋白質型[18]。本實驗分別對水提、60%醇提和pH 10.0堿提的類黑精組分中的蛋白和總糖含量進行了測定，測定結果如圖2所示。pH 10.0堿提組分的蛋白含量最高，達到47.58%，其次是60%醇提30.40%、水提24.89%，這主要因為芝麻當中的蛋白70%左右為11S球蛋白，易溶于堿溶液而不易溶于水[19]；60%醇提組分的總糖含量最高，為25.18%，水提與pH 10.0堿提組分的多糖含量相差不大。利用spearman相關性檢驗對不同提取溶液的A420值和蛋白含量進行相關性分析，得到r=0.9333，p=0.0007<0.05，即吸光度值與蛋白含量相關，蛋白含量越高，溶液顏色越深，吸光度值越大，間接說明焙烤芝麻渣中的類黑精主要是蛋白質結合型的。

圖2 不同溶液提取類黑精組分的蛋白和總糖含量Fig.2 Protein and polysaccharide contents of melanoidins extracted by different solutions

2.3 類黑精的滋味及芝麻渣的苦味

采用電子舌對芝麻渣類黑精的苦味（Bitterness）、澀味（Astringency）、鮮味（Umami）、酸味（Sourness）、豐富度（Richness）、苦味回味（Aftertaste-A）、澀味回味（Aftertaste-B）和咸味（Salt）進行測定，結果如圖3所示。從圖中可以看出，芝麻渣類黑精最突出的滋味是苦味和鮮味。60%醇提類黑精在低的濃度下卻有高的苦味值7.28，pH 10.0堿提類黑精的苦味值是6.46，兩者之間的差異具有統(tǒng)計學意義，p<0.01。對原芝麻渣和不同溶液提取類黑精之后的芝麻渣的苦味進行測定，其結果見圖4。不同溶液提取類黑精之后，芝麻渣的苦味都顯著下降，其中60%乙醇提取之后，剩余芝麻渣的苦味最小，其次是pH 10.0堿提，水提之后芝麻渣苦味的降低最小。因此可以推斷使芝麻渣產(chǎn)生苦味的主要是類黑精類物質，人們對于苦味往往是拒絕的，因為苦味往往被認為與有毒和不能吃的東西有關，但是有些苦味物質可作為特色風味或對人體有益，比如咖啡、苦瓜等[9]。

圖3 芝麻渣類黑精的滋味分析圖Fig.3 Taste analysis diagram of melanoidins from sesame residue

圖4 原芝麻渣和提取類黑精后剩余芝麻渣的苦味Fig.4 Bitterness of sesame residue and residual sesame residue after extraction of melanoidins

2.4 芝麻渣類黑精的抗氧化活性

現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)類黑精具有很好的抗氧化活性。LEE等[20]發(fā)現(xiàn)從焙烤芝麻中分離出的褐色組分對酶促褐變的抑制效果要好于其他組分。YOO等[16]也發(fā)現(xiàn)富含褐色物質的甲醇提取組分有很好的抗氧化活性。JO等[21]從脫脂的焙烤芝麻渣中提取的褐色物質能防止火雞胸肉和大腿肉中脂質的氧化。焙烤芝麻粕中的美拉德反應產(chǎn)物有很好的抗氧化活性，隨著焙烤溫度的升高，芝麻粕的甲醇提取物的褐變指數(shù)顯著增加，其清除DPPH·和抑制Cu2+誘導的人LDL氧化的抗氧化作用也增強[22]。ZHAO等[23,24]利用單糖和游離的氨基酸以及芝麻蛋白水解肽制備MRPs，發(fā)現(xiàn)利用木糖和芝麻蛋白肽生成的美拉德反應產(chǎn)物可顯著提高冷壓芝麻的氧化穩(wěn)定性。本實驗從·OH和DPPH·的清除能力以及還原能力三個方面分析了不同溶液提取的芝麻渣類黑精的抗氧化活性。

2.4.1 芝麻渣類黑精的·OH清除能力

不同溶液提取類黑精的·OH清除能力如圖5所示。類黑精·OH清除能力和濃度有關，隨著濃度增加，其清除能力也增加，但都比同等濃度下的Vc的清除率低（p<0.01），這與彭松林等[25]對鹵烤鴨中類黑精的·OH清除能力的研究結果相一致；當濃度大于1 mg/mL時，水提和堿提類黑精的清除率隨濃度增加提升較快，且水提類黑精的清除率要高于堿提和醇提類黑精（p<0.01），·OH清除能力有隨著類黑精濃度的增高而增強的趨勢，5 mg/mL水提類黑精的清除率是樣品中清除率最高的，其清除率達到了56.52%；當濃度小于2 mg/mL時，醇提的清除率要高于堿提的（p<0.01），類黑精的濃度和提取方式是影響·OH清除率的因素。

圖5 不同溶液提取類黑精的·OH清除率Fig.5·OH scavenging rate of melanoidin extracted from different solutions

2.4.2 類黑精的還原力

彭松林[25]和趙一夢[26]等研究發(fā)現(xiàn)鹵烤鴨和黑蒜中的類黑精具有一定的還原能力，但是不強。本研究發(fā)現(xiàn)不同溶液提取的類黑精也具有一定的還原能力，具體結果見圖6。隨著類黑精濃度的增加，其還原能力也增加，但都低于同濃度下Vc的還原能力（p<0.01）。不同濃度下，60%醇提類黑精的還原能力要高于水提和pH 10.0堿提的（p<0.05）；5 mg/mL的60%醇提類黑精的清除率最高，A700nm為0.22，水提和pH 10.0堿提分別為0.16、0.18，而同樣濃度下Vc的A700nm為1.60。

圖6 不同溶液提取類黑精的還原力Fig.6 Reducing ability of melanoidins extracted from different solutions

2.4.3 類黑精對DPPH·的清除能力

芝麻渣類黑精對DPPH·的清除能力如圖7所示。芝麻渣類黑精清除DPPH·的能力與濃度有關，在0.1 mg/mL的濃度下，三種溶液提取的類黑精的清除能力都要小于Vc對照組（p<0.01），在此濃度下清除能力最好的是60%醇提類黑精，DPPH·清除率達到47.20%，水提和pH 10堿提分別為40.46%、29.12%；當濃度提升到1 mg/mL時，三種溶液提取類黑精的清除能力都有增加，60%醇提類黑精的清除能力與Vc對照組一致，差異無統(tǒng)計學意義，p>0.05；當類黑精濃度進一步增加到5 mg/mL時，水提和60%醇提類黑精的清除能力與Vc對照組一致，差異無統(tǒng)計學意義，p>0.05；pH 10.0堿提類黑精的清除能力在1 mg/mL時最大，清除率為46.91%，當濃度增加到5 mg/mL時下降為16.99%。綜上分析，一定濃度水平下，水提和醇提類黑精具有較強的DPPH·的清除能力，清除率可達95%，顯著高于王明慧[27]等研究的糯米藕類黑精DPPH·的清除能力，其改變類黑精的相對濃度，最強清除率僅達到53.39%。

圖7 不同溶液提取類黑精的DPPH·清除率Fig.7 DPPH free radicals scavenging rate of melanoidins extracted from different solutions

2.5 芝麻渣類黑精的結構

目前食品中類黑精的完整結構還沒有被破解。但從無水模型系統(tǒng)（葡萄糖-谷蛋白加熱到150 ℃ 45 min，葡萄糖-甘氨酸/谷氨酸加熱到125 ℃ 2 h）和食品中獲得的高分子量類黑素結構已有相關報道。研究發(fā)現(xiàn)從模型系統(tǒng)、面包皮、咖啡和番茄醬中提取的黑色素，主要由呋喃組成，并含有羰基化合物、吡咯、吡嗪和吡啶等結構[28]。本實驗提取芝麻渣類黑精的傅里葉紅外光譜圖如圖8所示。在3050 cm-1附近的弱吸收峰主要是不飽和碳的C-H伸縮振動吸收；在1600 cm-1和1500 cm-1附近有強的吸收峰，主要是由芳環(huán)骨架振動引起的；在880~680 cm-1范圍內(nèi)存在很弱吸收帶，表明芳環(huán)的氫被取代，形成共軛體系；在1685~1660 cm-1范圍內(nèi)有尖且強的吸收峰，推斷為存在α或β不飽和酮結構；在3385 cm-1附近寬的吸收峰主要歸于O-H和N-H伸縮震動，且在1400 cm-1附近存在C-N伸縮震動吸收峰[29]。因此，綜上分析，芝麻渣類黑精中也存有芳族胺和呋喃等雜芳環(huán)結構。

圖8 芝麻渣類黑精的傅里葉紅外變換光圖譜圖Fig.8 Fourier transform infrared spectrogram of melanoidins from sesame dregs

3 結論

食品類黑精已經(jīng)成為眾研究者關注的焦點，但是關于芝麻渣類黑精仍鮮少有涉足。本研究采用不同pH值的堿液和不同濃度的乙醇溶液對芝麻渣中的類黑精進行提取，發(fā)現(xiàn)用pH 10.0的堿溶液和體積分數(shù)為60%的乙醇提取芝麻渣中的類黑精含量較高，而醇提溶液的苦味值最大，且對芝麻渣的脫苦能力最強，芝麻渣類黑精的滋味主要是由苦味和鮮味值組成，因此60%的乙醇溶液是芝麻渣類黑精的良好提取容劑。用pH 10.0的堿溶液提取的芝麻渣類黑精的蛋白質含量最高，達47.58%，60%乙醇提取的多糖含量最高，達25.18%；且提取液的吸光度值與蛋白含量存在相關性，推斷芝麻渣類黑精主要是蛋白結合型。經(jīng)紅外光譜顯示，芝麻渣類黑精中含有芳族胺和呋喃等結構。本研究揭示了芝麻渣類黑精的滋味和一定濃度的乙醇溶液對芝麻渣類黑精具有良好的提取性，并研究發(fā)現(xiàn)芝麻渣類黑精具有良好的清除DPPH·的能力，為后續(xù)芝麻渣類黑精的研究奠定基礎，利用類黑精的抗氧化性、抗菌性和抗血糖等功能研究保健食品，延長食品貨架期[30,31]，并提高芝麻渣的利用率。