紫蘇葉乙醇提取物的抗過敏活性及其作用機(jī)制

邢鈺彬，劉思佳，星萍，陳曉平

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春 130118)

紫蘇（Perilla frutescens）為唇形科一年生草本植物，又名回回蘇、紅紫蘇、赤蘇、蘇子等。國家衛(wèi)健委公布2019最新版藥食同源目錄里，將紫蘇、紫蘇子歸納到了藥食同源可用種類里。我國已有2000多年的栽培歷史，在我國多作為香辛配料，食用方式單一。紫蘇葉中含有多種化學(xué)成分都具有很好的生物活性，如揮發(fā)油、黃酮類、花色苷類、酚酸類、苷類、和三萜類等。國外研究者發(fā)現(xiàn)紫蘇一類香料植物，除了具有香辛料特有的增進(jìn)食欲、矯臭、賦香、著色等四大作用外，還具有抗氧化性[1,2]、抗菌性[3,4]、抗過敏性等多種機(jī)能[5,6]。Shin T Y[7]等通過對紫蘇葉水提物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)紫蘇的水提物在老鼠體內(nèi)或體外均有治療I型過敏和C48/80引發(fā)的過敏，阻止組織胺的釋放。Takagi S[8]從紫蘇葉中首次分離出了紫蘇糖肽，紫蘇糖肽具有抑制組胺釋放及蛋白激酶C活性的作用，認(rèn)為該種物質(zhì)能夠阻止Ca2+觸發(fā)靶細(xì)胞脫顆粒，干擾組胺物質(zhì)的釋放，達(dá)到抗過敏的作用。

近年來，全球化進(jìn)程加快，食品的種類和加工工藝越來越多，致使?jié)撛谶^敏人群不斷擴(kuò)大，由食品過敏引發(fā)的過敏疾病已占過敏總數(shù)的90%左右[9,10]。過敏引發(fā)的皮膚瘙癢難耐，紅腫等一系列反應(yīng)使許多患者深受其害[11,12]。近年來發(fā)現(xiàn)一些天然活性物質(zhì)具有抗過敏活性，并且天然活性物質(zhì)的作用靶點(diǎn)多，對機(jī)體不易產(chǎn)生毒性和副作用，因此越來越多的研究開始轉(zhuǎn)向天然活性物質(zhì)[13,14]。本研究在構(gòu)建小鼠全身皮膚瘙癢模型和小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)模型基礎(chǔ)上，通過小鼠被動(dòng)皮膚過敏反應(yīng)試驗(yàn)和DNCB誘發(fā)遲發(fā)型小鼠超敏反應(yīng)試驗(yàn)，確定紫蘇葉乙醇提取物對目前最常見的I、IV型過敏的抗過敏作用，以期明確紫蘇葉乙醇提取物的抗過敏作用，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，為紫蘇葉這一種食藥兩用植物的應(yīng)用及高值化開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑

紫蘇葉：由課題組采購市售皺葉紫蘇鮮葉。自然晾干，去雜，粉碎過80目篩，密封袋保存?zhèn)溆谩?/p>

主要試劑：無水乙醇、丙酮天津市富宇精細(xì)化工有限公司；生理鹽水石家莊四藥有限公司；卵白蛋白范德北京生物科技有限責(zé)任公司；地塞米松索萊寶生物科技有限公司；2,4-二硝基氯苯天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；免疫球蛋白E（IgE）試劑盒、白三烯B4（LTB4）試劑盒、血小板活化因子（PAF）試劑盒、α腫瘤壞死因子（TNF-α）試劑盒、白細(xì)胞介素4（IL-4）試劑盒、γ-干擾素（IFN-γ）試劑盒上海撫生實(shí)業(yè)有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級KM小鼠，5～7周齡，體質(zhì)量30～35 g，SPF級，購于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0010；小鼠維持飼料，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號（SCXK（京）2019-0008）。

飼養(yǎng)條件：飼養(yǎng)于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔級動(dòng)物飼養(yǎng)室。室溫20～25 ℃、濕度40%～60%，人工照明，12 h明/12 h暗，籠具及墊料定期清洗更換，動(dòng)物于飼養(yǎng)中心隔離適應(yīng)一周后用于試驗(yàn)。

1.1.3 儀器與設(shè)備

FW100微型高速萬能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；BSA2202S電子天平、BSA124S電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；FD-2A-30真空冷凍干燥機(jī)，江蘇天翔儀器有限公司；S-1-150S高速冷凍離心機(jī)，鞏義市宏華儀器設(shè)備工貿(mào)有限公；HBS-1101酶標(biāo)分析儀，南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SG330H超聲儀，上海冠特超聲儀器有限公司；電子數(shù)顯千分尺，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 紫蘇葉乙醇提取物制備

紫蘇葉由課題組采購。自然晾干，去雜，粉碎過80目篩，密封袋保存?zhèn)溆?。精密稱取紫蘇葉粉末，每50 g加入1000 mL 60%乙醇浸泡2 h，間歇式超聲提取，功率200 W，時(shí)間1 h，溫度50 ℃。將上清液濾出，相同條件下將濾渣再提取2次，合并濾液，離心除去殘?jiān)?，所得上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，超低溫冰箱預(yù)凍后冷凍干燥，備用[15]。

1.2.2 紫蘇葉乙醇提取物對小鼠被動(dòng)皮膚過敏反應(yīng)的影響

選取KM小鼠5只，5～7周齡，體質(zhì)量30～35 g，雌雄各半。稱取20 mg/mL卵白蛋白生理鹽水溶液與等體積紫蘇葉乙醇提取物（Folium Perillae Extract，F(xiàn)PE）水溶液混合均勻后作為致敏液，每只動(dòng)物腹腔注射致敏液0.2 mL致敏，隔日1次，共3次，于首次致敏后第14 d對小鼠進(jìn)行眼球取血，將采集的血液樣本常溫放置40 min，3000 r/min 4 ℃離心10 min，分離血清，置4 ℃冰箱，用于后續(xù)抗血清生理鹽水稀釋液制備[16]。

另取KM小鼠60只，體質(zhì)量30～35 g，雌雄兼用，按體質(zhì)量隨機(jī)分為6組即正常對照組（Control）、模型組（Model）、陽性對照組（Positive）、紫蘇葉乙醇提取物低劑量組（FPE-L）、中劑量組（FPE-M）、高劑量組（FPE-H），每組10只。Control組和Model組灌胃給予純化水，F(xiàn)PE-L、FPE-M、FPE-H組分別灌胃給予0.25、0.5、1 g/kg FPE水溶液，除Positive組于實(shí)驗(yàn)第12 d開始腹腔注射給藥外，其余各組小鼠均在實(shí)驗(yàn)第1 d開始灌胃給藥，每只0.1 mL/10 g，1次/d，連續(xù)給藥14 d。Positive組于第12 d開始腹腔注射1.6 mg/kg地塞米松，注射劑量每只0.1 mL/10 g。連續(xù)注射給藥3 d。試驗(yàn)期間自由采食、采水，每2 d稱量一次體重。

末次灌胃后60 min，小鼠背部常規(guī)備皮（3 cm×3 cm），除Control組外，其他試驗(yàn)組背部皮內(nèi)注射0.2 mL抗血清生理鹽水稀釋液（將之前制備并于4 ℃保存?zhèn)溆玫目寡澹?.9%生理鹽水=1:5的混合配制液）。48 h后，尾靜脈注射1%卵白蛋白生理鹽水混合溶液0.2 mL/只致敏。以前后爪搔抓頭部和軀干、嘴咬身體各部位作為皮膚瘙癢指征，即刻觀察并記錄各組小鼠30 min內(nèi)出現(xiàn)的瘙癢次數(shù)及首次開始瘙癢時(shí)間，即瘙癢閾值[17,18]。

瘙癢閾值測試后，小鼠眼球取血，將采集的血液樣本常溫放置40 min，3000 r/min 4 ℃離心10 min，分離血清，按試劑盒說明測定血清中免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）、白三烯B4（leukotriene B4，LTB4）、血小板活化因子（platelet activating factor，PAF）水平。取血后將小鼠頸椎脫臼致死，分離完整的胸腺、脾臟、心臟、肝臟稱重，根據(jù)公式（1）計(jì)算臟器系數(shù)。

1.2.3 紫蘇葉乙醇提取物對DNCB誘發(fā)的小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響

選取KM小鼠60只，5～7周齡，體質(zhì)量30～35 g，雌雄兼用，按體質(zhì)量隨機(jī)分為6組即正常對照組（Control）、模型組（Model）、陽性對照組（Positive）紫蘇葉乙醇提取物低劑量組（FPE-L）、中劑量組（FPE-M）、高劑量組（FPE-H），每組10只。Control組和Model組灌胃給予純化水，F(xiàn)PE-L、FPE-M、FPE-H組分別灌胃給予0.25、0.5、1 g/kg紫蘇葉乙醇提取物水溶液，除Positive組于試驗(yàn)第12 d開始腹腔注射給藥外，其余各組小鼠均在試驗(yàn)第1 d開始灌胃給藥，每只0.1 mL/10 g，1次/d，連續(xù)給藥13 d。Positive組于第11 d開始腹腔注射1.6 mg/kg地塞米松，注射劑量每只0.1 mL/10 g。連續(xù)注射給藥3 d[19]。試驗(yàn)期間自由采食、采水，每2 d稱量一次體重。

試驗(yàn)開始前1 d小鼠背部常規(guī)備皮（3 cm×3 cm），各組試驗(yàn)動(dòng)物除空白對照組外于脫毛24 h后（試驗(yàn)第1 d）在其脫毛區(qū)域均勻涂抹3% DNCB（4:1丙酮橄欖油混合液配制）40 μL致敏1次，第2 d加強(qiáng)致敏一次，涂抹劑量減半?？瞻捉M給予等量4:1丙酮橄欖油。實(shí)驗(yàn)第5 d在小鼠右耳內(nèi)外側(cè)均勻涂抹1% DNCB 20 μL激發(fā)，左耳涂等量4:1丙酮橄欖油，實(shí)驗(yàn)第8、11 d重復(fù)此刺激。從小鼠背部致敏前1 d開始，利用電子數(shù)顯千分尺分別測量每組小鼠左、右耳中部的厚度，平行測量2次，取平均值，根據(jù)公式（2）計(jì)算耳腫脹度。每隔2 d同法測定耳腫脹度（即耳部激發(fā)24 h后）。末次激發(fā)48 h后（第13 d）脫頸處死小鼠，用打孔器摘取各鼠右耳相同部位同樣大小的耳片，加入0.9 mL冰冷的生理鹽水，于冰水浴中充分研磨，勻漿，3000 r/min、4 ℃離心15 min取上清液，按試劑盒說明測定α腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF-α）、白細(xì)胞介素4（interleukin-4，IL-4）、γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）水平[20,21]。取耳后分離完整的胸腺、脾臟、心臟、肝臟稱重，根據(jù)公式（1）計(jì)算臟器系數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用Excel 2019對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。應(yīng)用SPSS 23.0.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）來表示，組間t檢驗(yàn)，p＜0.05表示組間差異有統(tǒng)計(jì)顯著性，p＜0.01表示組間差異極顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫蘇葉乙醇提取物對小鼠被動(dòng)皮膚過敏反應(yīng)的影響

2.2.1 紫蘇葉乙醇提取物對被動(dòng)皮膚過敏模型小鼠臟器系數(shù)的影響

臟器系數(shù)是試驗(yàn)動(dòng)物某臟器的重量與其體重之比值。正常時(shí)各臟器與體重的比值比較恒定。臟器系數(shù)增大，表示臟器充血、水腫或增生肥大等；臟器系數(shù)減小，表示臟器萎縮及其他退行性改變。由表1可見，各組小鼠脾臟、胸腺、心臟、肝臟無顯著性變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。

表1 FPE對被動(dòng)皮膚過敏模型小鼠臟器系數(shù)的影響Table 1 Effect of FPE on organ coefficient of mice with passive skin allergy (±s, n=10)

表1 FPE對被動(dòng)皮膚過敏模型小鼠臟器系數(shù)的影響Table 1 Effect of FPE on organ coefficient of mice with passive skin allergy (±s, n=10)

注：與Control組比較：#表示差異顯著（p＜0.05），##表示差異極顯著（p＜0.01）；與Model組比較：*表示差異顯著（p＜0.05），**表示差異極顯著（p＜0.01）。下表同。

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2.1.2 紫蘇葉乙醇提取物對被動(dòng)皮膚過敏模型小鼠瘙癢次數(shù)及瘙癢閾值的影響

被動(dòng)皮膚過敏試驗(yàn)為抗Ⅰ型過敏反應(yīng)藥物的常用篩選方法，該類反應(yīng)主要由IgE抗體介導(dǎo)。卵白蛋白作為一種異種蛋白，首次注射入小鼠體內(nèi)，可致敏機(jī)體產(chǎn)生富含IgE的抗體?？贵w再次注入體內(nèi)，IgE抗體與肥大細(xì)胞或嗜堿粒細(xì)胞結(jié)合，形成致敏靶細(xì)胞，使機(jī)體呈高敏狀態(tài)。當(dāng)機(jī)體再次接觸同種抗原時(shí)，抗原與特異性IgE發(fā)生聯(lián)橋，導(dǎo)致肥大細(xì)胞活化及脫顆粒，釋放包括組胺、PAF、LTB4等多種生物活性物質(zhì)，引起平滑肌收縮、黏膜水腫、血管通透性增高形成過敏癥候群，包括皮膚紅腫、瘙癢等一系列局部或全身反應(yīng)[22]。本試驗(yàn)中，結(jié)果由表2可以看出，F(xiàn)PE-M、FPE-H組小鼠與Model組小鼠相比，瘙癢次數(shù)明顯減少，有極顯著性差異（p＜0.01）。FPE-L、FPE-M、FPE-H組與Model組相比顯著延長小鼠首次瘙癢時(shí)間，提高瘙癢閾值，F(xiàn)PE-M與Model組比較，有顯著性差異（p＜0.05），F(xiàn)PE-H組與Model組有極顯著性差異（p＜0.01），且呈現(xiàn)一定的劑量相關(guān)性。提示FPE對被動(dòng)皮膚過敏小鼠全身瘙癢有一定的止癢作用，對I型過敏反應(yīng)有一定的抑制作用。但效果沒有陽性對照組顯著。

表2 FPE對被動(dòng)皮膚過敏模型小鼠瘙癢次數(shù)及瘙癢閾值的影響Table 2 Effects of FPE on pruritus frequency and pruritus threshold in mice with passive skin allergy (±s, n=10)

表2 FPE對被動(dòng)皮膚過敏模型小鼠瘙癢次數(shù)及瘙癢閾值的影響Table 2 Effects of FPE on pruritus frequency and pruritus threshold in mice with passive skin allergy (±s, n=10)

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2.1.3 紫蘇葉乙醇提取物對被動(dòng)皮膚過敏模型小鼠血清中IgE、PAF、LTB4水平的影響

結(jié)果見圖1。Model組（11.90 ng/mL）小鼠與Control組（4.68 ng/mL）相比，血清中IgE水平顯著提高（p＜0.01），顯示建模成功。與Model組相比，各劑量組小鼠血清中IgE水平均有所下降。其中FPE-M組小鼠血清中IgE水平（10.15 ng/mL）下降了14.7%，存在顯著差異（p＜0.05），F(xiàn)PE-H組小鼠血清中IgE水平（8.22 ng/mL）下降了30.92%，存在極顯著差異（p＜0.01）。說明紫蘇葉乙醇提取物可顯著降低致敏小鼠血清中IgE的水平，高劑量作用效果更加顯著。日本學(xué)者ImaokaK等人的研究也表明，日本種綠葉紫蘇的提取物能夠顯著的抑制IgE類抗體，但對IgG類抗體無影響，表明了日本種綠葉紫蘇的提取物對IgE類抗體產(chǎn)生的過敏性疾病有療效作用[23]。

圖1 紫蘇葉乙醇提取物對被動(dòng)皮膚過敏模型小鼠血清中IgE水平的影響Fig.1 Effect of ethanol extract of perilla leaf on serum IgE level in mice with passive skin allergy

血小板激活因子（PAF）是另一種炎癥介質(zhì)，乃由IgE致敏的嗜堿性粒細(xì)胞在結(jié)合抗原后產(chǎn)生。PAF一方面可直接作用于靶細(xì)胞，還可刺激細(xì)胞合成其他炎癥介質(zhì)，特別是前列腺素和白三烯的合成。由圖2可知，Model組小鼠血清中PAF水平（22.27 pg/mL）明顯高于Control組（14.98 pg/mL）（p＜0.01），顯示建模成功。與Model組相比較，各劑量組小鼠血清PAF水平均有所下降，低、中、高劑量組中PAF的含量分別下降4.2%、13.8%和15.5%。其中FPE-M組（19.20 pg/mL）和FPE-H組（18.86 pg/mL）與Model組比較存在極顯著差異（p＜0.01）。上述數(shù)據(jù)表明：Model組致敏小鼠血清中PAF含量會增加，紫蘇葉乙醇提取物可以有效的控制致敏小鼠血清中PAF的含量，暫時(shí)未發(fā)現(xiàn)明顯的劑量依賴關(guān)系。

圖2 紫蘇葉乙醇提取物對被動(dòng)皮膚過敏模型小鼠血清中PAF水平的影響Fig.2 Effect of ethanol extract of perilla leaf on serum PAF level in mice with passive skin allergy

白三烯是花生四烯酸（arachidonic acid，AA）分別經(jīng)環(huán)氧酶、5-脂氧合酶代謝途徑生成的重要的炎癥介質(zhì)，廣泛參與機(jī)體炎性、過敏性反應(yīng)的發(fā)生，還可強(qiáng)化肥大細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)的效應(yīng)參與過敏反應(yīng)發(fā)病機(jī)制的調(diào)節(jié)[24]。由圖3可以看出，與Control組（20.22 pg/mL）相比，Model組（36.17 pg/mL）小鼠血清中LTB4水平顯著提高，顯示建模成功。與Model組相比，各劑量組小鼠血清中LTB4水平均有所下降。以FPE-H組（28.05 pg/mL）效果最明顯，血清中LTB4含量下降了22.45%，與Model組存在極顯著差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。說明紫蘇葉乙醇提取物可以有效控制致敏小鼠血清中LTB4水平的上升，對過敏有一定的對抗作用。

圖3 紫蘇葉乙醇提取物對被動(dòng)皮膚過敏模型小鼠血清中LTB4水平的影響Fig.3 Effect of ethanol extract of perilla leaf on serum LTB4 level in mice with passive skin allergy

2.2 紫蘇葉乙醇提取物對DNCB誘發(fā)的小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響

2.2.1 紫蘇葉乙醇提取物對DNCB誘發(fā)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)小鼠臟器系數(shù)的影響

除FPE-H組小鼠胸腺系數(shù)有所下降外（p＜0.05），其余各組小鼠脾臟、胸腺、心臟、肝臟無顯著性變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。結(jié)果見表3。

表3 FPE對DNCB誘發(fā)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)小鼠臟器系數(shù)的影響Table 3 Effect of FPE on organ coefficient of DNCB induced delayed hypersensitivity mice (±s, n=10)

表3 FPE對DNCB誘發(fā)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)小鼠臟器系數(shù)的影響Table 3 Effect of FPE on organ coefficient of DNCB induced delayed hypersensitivity mice (±s, n=10)

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2.2.2 紫蘇葉乙醇提取物對DNCB誘發(fā)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)小鼠耳腫脹度的影響

Ⅳ型過敏反應(yīng)又稱遲發(fā)型超敏反應(yīng)，主要由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)。本試驗(yàn)中選用的二硝基氯苯系一種半抗原，常被用作制備變應(yīng)性接觸性皮炎動(dòng)物模型，以評價(jià)藥物抑制Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)的效果。本試驗(yàn)中，小鼠致敏側(cè)與非致敏側(cè)的耳片厚度差可說明過敏反應(yīng)的程度，差值越小，說明抗過敏作用越明顯。與空白組小鼠比較，模型組小鼠耳腫脹度均顯著提高（p＜0.01），顯示建模成功。與模型組相比，各組耳腫脹度均有所降低，其中以FPE-H組抑制DNCB引起的小鼠耳腫脹效果最好，在耳部致敏第3 d、第6 d耳腫脹度顯著降低（p＜0.05），第9 d耳腫脹度極顯著降低（p＜0.01）。結(jié)果見表4。相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)，佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯、花生四烯酸或噁唑酮誘導(dǎo)的耳炎小鼠灌胃給予1 kg/L野生紫蘇的水提物0.4 mL，可顯著緩解耳腫脹[25]。

表4 FPE對DNCB誘發(fā)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)小鼠耳腫脹度的影響Table 4 Effect of FPE on ear swelling in DNCB induced delayed hypersensitivity mice (±s, n=10)

表4 FPE對DNCB誘發(fā)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)小鼠耳腫脹度的影響Table 4 Effect of FPE on ear swelling in DNCB induced delayed hypersensitivity mice (±s, n=10)

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2.2.3 紫蘇葉乙醇提取物對DNCB誘發(fā)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)小鼠耳組織液IL-4、IFN-γ、TNF-α水平影響

IL-4是T細(xì)胞自身分泌的生長因子，在過敏反應(yīng)中能促進(jìn)巨噬細(xì)胞提呈抗原。本文試驗(yàn)中，F(xiàn)PE-M組（458.10 pg/mL）小鼠與Model組（507.94 pg/mL）相比，耳組織液中IL-4水平顯著降低（p＜0.05），F(xiàn)PE-H組（410.67 pg/mL）與Model組比較耳組織液中IL-4水平下降了19.14%，效果極顯著（p＜0.01）。說明紫蘇葉乙醇提取物可顯著降低致敏小鼠耳組織液中IL-4水平，緩解過敏過程中過敏介質(zhì)的釋放。高劑量作用效果更加顯著。結(jié)果見圖4。

圖4 紫蘇葉乙醇提取物對DNCB誘發(fā)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)小鼠耳組織液IL-4水平影響Fig.4 Effect of ethanol extract from Perilla frutescens leaves on IL-4 level in ear tissue of mice with DNCB induced delayed hypersensitivity

IFN-γ能作用于內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等，提高將抗原呈遞給局部CD4+T細(xì)胞的效率，是遲發(fā)性超敏反應(yīng)中最重要的細(xì)胞因子。與Model組（29.52 pg/mL）相比，低、中、高劑量組小鼠耳組織液中IFN-γ含量分別降低了7.3%、21.1%、32.52%。FPE-M組（23.29 pg/mL）致敏小鼠耳組織液中IFN-γ水平顯著降低（p＜0.05），F(xiàn)PE-H組（19.83 pg/mL）效果極顯著（p＜0.01）。結(jié)果見圖5。數(shù)據(jù)顯示紫蘇葉乙醇提取物對于DNCB誘發(fā)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)小鼠耳部IFN-γ上升有所抑制，對DNCB誘發(fā)的IV型超敏反應(yīng)有一定的對抗作用，且紫蘇葉乙醇提取物的抗過敏效果與用量呈一定的劑量相關(guān)性。

圖5 紫蘇葉乙醇提取物對DNCB誘發(fā)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)小鼠耳組織液IFN-γ水平影響Fig.5 Effect of ethanol extract from Perilla frutescens leaves on IFN-γ level in ear tissue of mice with DNCB induced delayed hypersensitivity

TNF-α能放大小靜脈內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合和活化白細(xì)胞的能力，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。本試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，Model組（175.63 pg/mL）小鼠與Control組（54.84 pg/mL）相比，耳組織液中TNF-α水平顯著提高（p＜0.01），顯示建模成功。與Model組相比，各劑量組小鼠耳組織液中TNF-α水平均有不同程度的下降，其中FPE-H組（146.45 pg/mL）小鼠耳組織液中TNF-α水平顯著性降低（p＜0.05），與Model組相比下降了16.6%。

圖6 紫蘇葉乙醇提取物對DNCB誘發(fā)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)小鼠耳組織TNF-α水平影響Fig.6 Effect of ethanol extract from Perilla frutescens leaves on TNF-α level in ear tissue of mice with DNCB induced delayed hypersensitivity

3 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，紫蘇葉乙醇提取物對小鼠臟器生長沒有影響。小鼠被動(dòng)皮膚過敏試驗(yàn)中，F(xiàn)PE具有抗I型過敏反應(yīng)活性，能顯著降低小鼠瘙癢次數(shù)延長首次瘙癢時(shí)間。高劑量組與模型組相比極顯著降低小鼠瘙癢次數(shù)（p＜0.01），由24.3次降低至15.8次，首次瘙癢時(shí)間由121.59 s顯著延長至231.90 s。FPE能顯著降低致敏小鼠血清中IgE、PAF、LTB4水平，高劑量組小鼠血清中IgE、PAF、LTB4水平分別下降了30.92%、15.50%、22.45%，表明FPE抗過敏作用機(jī)制與阻止過敏反應(yīng)生物活性物質(zhì)釋放、干預(yù)花生四烯酸代謝產(chǎn)物的生成有關(guān)。DNCB誘發(fā)的小鼠遲發(fā)型超敏反試驗(yàn)中，F(xiàn)PE能顯著降低小鼠耳腫脹度，第9 d極顯著降低小鼠耳腫脹度（p＜0.01）。高劑量組水平小鼠耳組織液中TNF-α、IL-4、IFN-γ水平分別下降了19.14%、32.52%、16.61%。綜上所述，通過體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)，證實(shí)紫蘇葉乙醇提取物水溶液對I型過敏和IV型過敏的抗過敏活性，并初步探討其對I型過敏作用機(jī)制與阻止過敏反應(yīng)生物活性物質(zhì)釋放、干預(yù)花生四烯酸代謝產(chǎn)物的生成從而發(fā)揮抗過敏作用有關(guān)。但更深入的分子生物學(xué)機(jī)制和功效因子尚不明確，有待今后進(jìn)一步研究。