牛乳酪蛋白源ACE抑制肽對大鼠的降血壓作用

劉飛，苗建銀，楊余語，何澤琪，喬子驕，劉果,3，杜潔，寧德山，曹庸

（1.廣州綠萃生物科技有限公司，廣東廣州 510663）（2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省功能食品活性物重點實驗室，廣東省天然活性物工程技術(shù)研究中心，廣東廣州 510642）（3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東廣州 510642）（4.無限極（中國）有限公司，廣東廣州 510665）

高血壓指動脈血壓持續(xù)升高，是心血管疾病中極為危險的因素[1]，高血壓會增加冠心病、中風(fēng)的發(fā)病率[2]，在國內(nèi)成年人高血壓發(fā)病率高達(dá)31%～35%，但在患病人群中自身知曉率、治療率較低[3-5]。據(jù)全國衛(wèi)生部門統(tǒng)計資料顯示，我國現(xiàn)有高血壓病患者已超過1.6億人，每年新增300萬人以上。高血壓的發(fā)病率已經(jīng)達(dá)到了23.2%。尤其北方高血壓發(fā)病率特別高，北方地區(qū)高血壓的發(fā)病率達(dá)到了32%～33%。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽（Angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides，ACEI），也稱為降血壓肽，是通過抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（Angiotensin-I converting enzyme，ACE）活性從而抑制血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)為血管緊張素Ⅱ，以此達(dá)到降低血壓[6-8]。目前用于臨床治療高血壓和心臟衰竭的合成ACE抑制劑已有許多，如卡托普利、培哚普利、依那普利、賴諾普利和雷米普利，但是，這些藥物可能產(chǎn)生低血壓、鉀水平上升、腎功能降低、咳嗽、味覺異常等副作用，不適長期服用[9-16]。而食物蛋白來源的ACE抑制肽通常由蛋白酶在溫和條件下水解蛋白質(zhì)而獲得[17-19]。而食物蛋白來源的ACE抑制肽通常由蛋白酶在溫和條件下水解蛋白質(zhì)而獲得，食用安全性高，無毒副作用，對高血壓患者可以起到降壓作用而對血壓正常者無降壓作用，同時還具有免疫調(diào)節(jié)、減肥和易消化吸收等功能，有著合成化學(xué)藥物不可比擬的優(yōu)越性[20-36]。

本文利用牛乳酪蛋白為原料，經(jīng)過胰蛋白酶水解、超濾膜處理得到分子量小于5000 u的降血壓肽（ACE抑制肽），通過自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）檢測ACE抑制肽的降血壓功效。酪蛋白為重要的乳源蛋白，原料安全、無毒副作用，有較高的營養(yǎng)價值，具有良好的研發(fā)背景，本文為酪蛋白的深加工和具有降血壓作用的乳源活性肽進(jìn)一步應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器設(shè)備

1.1.1 原料與試劑

降血壓肽（ACE抑制肽），批次20190326J，純度30%，廣州綠萃生物科技有限公司提供。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

BS223S天平，德國Sartorius公司；BP-2010A無創(chuàng)血壓計，北京軟隆生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 實驗動物

（SD）血壓正常大鼠，SPF級，8只，雄性；實驗開始時動物體重：195.6～216.8 g，廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，廣東省實驗動物質(zhì)量合格證號：44007200009225；動物許可證號：SYXK（粵）2013-0002。

（SHR）自發(fā)性高血壓大鼠，SPF級，40只，雄性；實驗開始時動物體重：189.40～224.00 g，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，北京市實驗動物質(zhì)量合格證號11400700044184；（動物許可證號：SCXK（京）2012-0001。

1.2 實驗方法

1.2.1 劑量設(shè)計依據(jù)[35]

根據(jù)《保健食品功能評價程序和檢驗方法規(guī)范》（2003年版）進(jìn)行劑量設(shè)計，以人推薦劑量的5倍作為大鼠給予受試產(chǎn)品的劑量（低劑量每天115 mg/kg、中劑量1165 mg/kg、高劑量2335 mg/kg）。根據(jù)人服用卡托普利的劑量，換算大鼠等效劑量作為卡托普利的大鼠給藥劑量（每天3.94 mg/kg，用于2周內(nèi)給藥，15.75 mg/kg，用于2周后給藥）。

1.2.2 藥物配制和給予樣品方法[31-36]

分別配置233.50 mg/mL（高劑量）、116.50 mg/mL（中劑量）、11.50 mg/mL（低劑量）的ACE抑制肽溶液。前2周陽性對照組劑量：卡托普利濃度為0.39 mg/mL。第3～4周陽性對照組劑量：卡托普利濃度為1.58 mg/mL。

將檢疫合格的8只SD血壓正常大鼠作為正常對照高劑量組（給予ACE抑制肽高劑量干預(yù)），8只/組；另將檢疫合格的40只SHR自發(fā)性高血壓大鼠按照血壓基礎(chǔ)值隨機分為模型對照組、ACE抑制肽高劑量組、中劑量組、低劑量組、卡托普利陽性對照組，8只/組。所有大鼠按照1 mL/100 g給予樣品，1次/d，連續(xù)30 d。

1.2.3 標(biāo)本的采集與處理[21,31-36]

1.2.3.1 尿液收集

實驗結(jié)束前1 d收集12 h尿液。

1.2.3.2 血清采集

實驗結(jié)束當(dāng)天，麻醉處死大鼠，腹主動脈取血，離心取血清進(jìn)行相關(guān)測定。

1.2.4 檢測指標(biāo)

1.2.4.1 觀察

從實驗開始至實驗結(jié)束每天觀察動物1次。

1.2.4.2 體重

從實驗開始至實驗結(jié)束每周稱量大鼠體重1次。

1.2.4.3 血壓、心率測定

從實驗前及實驗開始后每周測定大鼠血壓、心率1次[21]。

1.2.4.4 采用ELISA測定

試劑盒檢測血清血管緊張素Ⅱ濃度（Angiotensin-Ⅱ，ANG-Ⅱ）、一氧化氮（Nitric Oxide，NO）、內(nèi)皮素（ET）、降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）水平[21]。

1.2.4.5 采用生化分析儀測定

血清中血糖（GLU）、K+、Na+、Ca2+、總膽固醇（CHOL）、甘油三脂（Triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（Low density lipoprotein cholesterin，LDL-C）、血尿酸（UA）水平檢測[34]。

1.2.4.6 尿微量白蛋白檢測

測定收集尿液中尿微量白蛋白（ALB）的含量[21]。

1.2.5 統(tǒng)計分析

采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析；計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，以α=0.05為檢驗水平；采用重復(fù)測量資料方差分析方法對重復(fù)測量的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析；采用單因素方差分析方法對單次測量的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 體重

各組大鼠的體重隨著時間的變化而增加（表1）。投喂4周后，模型對照組（252.90 g）、陽性組（254.40 g）、ACE抑制肽低（245.70 g）、中（248.00 g）和高劑量組（252.90 g）的體重均無統(tǒng)計學(xué)差異，并且在各測定時間點的體重均無統(tǒng)計學(xué)差異（p＞0.05）。說明本實驗所用的大鼠符合建動物模型條件。

表1 干預(yù)30 d大鼠的體重變化Table 1 The weight change of rats after 30 days of intervention (± s , n=8, ♂, g)

表1 干預(yù)30 d大鼠的體重變化Table 1 The weight change of rats after 30 days of intervention (± s , n=8, ♂, g)

注：與模型對照組相比，“**”p＜0.01。

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表2 干預(yù)大鼠前和干預(yù)后的血壓和心率Table 2 Blood pressure and heart rate before and after intervention in rats (± s , n=8, ♂)

表2 干預(yù)大鼠前和干預(yù)后的血壓和心率Table 2 Blood pressure and heart rate before and after intervention in rats (± s , n=8, ♂)

注：與模型對照組相比，“*”p＜0.05，“**”p＜0.01。下表同。

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2.2 血壓和心率

在觀察期內(nèi)，模型對照組的血壓（包括收縮壓、舒張壓和平均壓）始終高于正常對照高劑量組，具有統(tǒng)計學(xué)差異（p＜0.01），說明本實驗所用SHR大鼠是良好的高血壓動物模型。給予樣品前，ACE抑制肽低、中、高劑量組和陽性對照組的基礎(chǔ)血壓（包括收縮壓、舒張壓和平均壓）、心率與模型對照組比較均無統(tǒng)計學(xué)差異（p＞0.05）。干預(yù)30 d后，模型對照組心率（次/分）、收縮壓（mm Hg）分別是446、186，ACE抑制肽中、低劑量組和陽性對照組的心率（次/分）分別398、402、395，與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05，p＜0.01）；ACE抑制肽高、低劑量組和陽性對照組的收縮壓（mm Hg）分別為175、175、172，與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.01），說明ACE抑制肽能有緩解大鼠心率過速[33]，且不同劑量的ACE抑制肽對SHR大鼠初始血壓均有顯著降低效果[32]；正常對照高劑量組在干預(yù)前后收縮壓分別為124 mm Hg、122 mm Hg，無明顯差異，說明本實驗的ACE抑制肽對血壓正常的大鼠無降壓作用，與夏磊等人研究結(jié)果一致[20]。

2.3 血清檢測及尿液檢測

除了收縮壓、心率是判斷高血壓的依據(jù)，血清中的ANG-II、ETI、NO等指標(biāo)濃度變化同樣也會引發(fā)高血壓病。本實驗給予樣品30 d后，與模型對照組相比，ACE抑制肽高劑量組血清的CGRP（10.09 pg/mL）與模型對照組（7.47 pg/mL）相比，明顯升高（p＜0.05）；ACE抑制肽高劑量組ET1濃度（8.69 pg/mL）與模型對照組（10.26 pg/mL）相比，明顯降低（p＜0.05），說明ACE抑制肽可在一定程度上改善腎血管性高血壓大鼠血清生化指標(biāo)，與模型對照組相比，ACE抑制肽高劑量組ALB含量明顯升高（p＜0.05），說明ACE抑制肽可在一定程度上改善SHR大鼠的腎功能指標(biāo)[21,34]，見表3。

表3 干預(yù)后的大鼠血清及尿檢結(jié)果Table 3 Serum and urine test results of rats after intervention (± s , n=8, ♂)

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2.4 血生化

由表4可見，給予樣品30 d后，與模型對照組相比，ACE抑制肽高劑量組的GLU（6.41 mmol/L）、CHOL（1.13 mmol/L）、HDLC（0.29 mmol/L）、血UA（108.20 μmol/L），具有統(tǒng)計學(xué)差異（p＜0.05，p＜0.01），而TG含量沒有統(tǒng)計學(xué)差異（p＞0.05）；陽性對照組的血清TG和血UA濃度都明顯升高，具有統(tǒng)計學(xué)差異（p＜0.05，p＜0.01）。這說明在連續(xù)灌胃30 d后，ACE抑制肽對血糖、尿酸以及膽固醇有一定控制作用[33]。

表4 干預(yù)30 d的大鼠血生化結(jié)果Table 4 Blood biochemical results of rats after 30 days of intervention (± s , n=8, ♂)

表4 干預(yù)30 d的大鼠血生化結(jié)果Table 4 Blood biochemical results of rats after 30 days of intervention (± s , n=8, ♂)

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2.5 血電解質(zhì)

由表5可見，給予樣品30 d后，與模型對照組血清TCa（2.13 mmol/L）相比，ACE抑制肽高劑量組的血清TCa（2.06 mmol/L）都明顯降低，具有統(tǒng)計學(xué)差異（p＜0.05），而K、Na、Cl和iCa都沒有統(tǒng)計學(xué)差異（p＞0.05），ACE抑制肽通過降低鈣離子濃度，降低總鈣的濃度，說明ACE抑制肽能促進(jìn)離子吸收，從而影響血鈣的濃度。

表5 干預(yù)30 d的大鼠血電解質(zhì)結(jié)果Table 5 Results of blood electrolytes in rats after 30 days of intervention (± s , n=8, ♂)

表5 干預(yù)30 d的大鼠血電解質(zhì)結(jié)果Table 5 Results of blood electrolytes in rats after 30 days of intervention (± s , n=8, ♂)

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3 結(jié)論

在本實驗條件下，干預(yù)30 d后，模型對照組心率（次/分）、收縮壓（mm Hg）分別是446、186，ACE抑制肽中、低劑量組和陽性對照組的心率（次/分）分別398、402、395，與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05，p＜0.01）；ACE抑制肽高、低劑量組和陽性對照組的收縮壓（mm Hg）分別為175、175、172，與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.01），說明牛乳酪蛋白源ACE抑制肽能有緩解大鼠心率過速，并且對SHR大鼠初始血壓均有顯著降低效果；本實驗給予樣品30 d后，ACE抑制肽高劑量組血清的CGRP濃度10.09 pg/mL，與模型對照組相比，明顯升高（p＜0.05）；ET1濃度8.69 pg/mL、GLU濃度6.41 mmol/L、CHOL濃度1.13 mmol/L、HDLC濃度0.29 mmol/L、血UA濃度108.2 μmol/L、血清TCa濃度2.06 mmol/L，與模型對照組相比，明顯降低（p＜0.05），說明ACE抑制肽可在一定程度上改善腎血管性高血壓大鼠血清生化指標(biāo)及腎功能指標(biāo)。同時對血糖及膽固醇有一定控制作用。ACE抑制肽可能通過升高血液CGRP、抑制ET1、降低血鈣水平起到降血壓作用。