石甘散聯(lián)合托吡酯對(duì)癲癇幼鼠認(rèn)知功能及海馬組織CB2R、MDA、SOD水平的影響

楊昕憓，于 濱

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 150000)

癲癇是一類由已知或未知病因所致的腦部神經(jīng)元過(guò)度同步化放電為特征的發(fā)作性腦病。目前醫(yī)學(xué)上關(guān)于癲癇的發(fā)病機(jī)制尚無(wú)統(tǒng)一定論[1-2]。已有研究證實(shí)，氧化應(yīng)激所致的后續(xù)反應(yīng)可能在癲癇的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色。氧化應(yīng)激產(chǎn)物自由基的過(guò)度表達(dá)可對(duì)蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)造成損傷，進(jìn)而破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，引起細(xì)胞凋亡[3-5]。因此如何抑制癲癇患者發(fā)病或產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)是治療癲癇的關(guān)鍵所在。托吡酯為一類廣譜抗癲癇藥物，已被證實(shí)對(duì)多種類型癲癇均具有較好的治療效果，并可作為一線抗癇藥物單獨(dú)或與其他藥物聯(lián)合使用[6-7]。中醫(yī)藥為我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)范疇，其具有毒副作用小、療效顯著等特點(diǎn)，已廣泛運(yùn)用于臨床中，而石甘散是有石菖蒲和甘松組成的抗癇藥物，臨床效果顯著[8-9]?；诖耍狙芯客ㄟ^(guò)探討石甘散聯(lián)合托吡酯對(duì)癲癇幼鼠認(rèn)知功能及海馬組織大麻素受體2(CB2R)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平的影響，旨在為臨床上治療癲癇提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取60只10日齡SD大鼠，體重為25～35 g，購(gòu)于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物許可證：SCXK-(豫)2019-017]。于屏障環(huán)境下飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)，將60只SD大鼠分為對(duì)照組、模型組、石甘散組、托吡酯組、聯(lián)合組，每組12只。

1.1.2主要儀器試劑

托吡酯(西安楊森制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20020555，每片25 mg)；石甘散：由石菖蒲、甘松按1∶1比例進(jìn)行配置；戊四氮、SOD試劑盒、MDA試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；CB2R兔多克隆抗體、兔抗GADPH(武漢博士德生物工程有限公司)；ECL高效化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國(guó)Genview公司)；蛋白提取試劑盒(寶生物工程有限公司)。Bio Rad 450酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio Rad公司)；JY-SCZ2型十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)蛋白電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1建模

對(duì)照組腹腔注射1 mL的0.9%氯化鈉溶液，連續(xù)注射28 d。其余4組均于每日固定時(shí)間腹腔注射戊四氮溶液(實(shí)驗(yàn)前30 min將300 mg戊四氮晶體溶于150 mL的0.9%氯化鈉溶液)，連續(xù)注射28 d，以RACINE[10]制訂的分級(jí)法為評(píng)斷標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)SD大鼠出現(xiàn)5次級(jí)以上Ⅱ級(jí)及以上癥狀即為癲癇模型構(gòu)建成功。

1.2.2干預(yù)

對(duì)照組及模型組給予0.9%氯化鈉溶液(10 mg/kg)灌胃，每日2次，連續(xù)28 d。石甘散組給予1 g/kg石甘散灌胃，每日1次，托吡酯組給予18 mg/kg托吡酯灌胃(使用前，以0.1 mg托吡酯：0.1 mL的0.9%氯化鈉溶液比例進(jìn)行稀釋)，每日1次，聯(lián)合組給予1 g/kg石甘散和18 mg/kg托吡酯灌胃，每日1次，連續(xù)干預(yù)28 d。

1.2.3認(rèn)知功能評(píng)價(jià)

水迷宮實(shí)驗(yàn)：水迷宮由直徑為1.3 m，高0.5 m的圓形蓄水池及透明玻璃構(gòu)成，水深0.3 m。實(shí)驗(yàn)期間水迷宮周圍參照物擺放順序無(wú)變動(dòng)，水溫為室溫。在測(cè)試前1 d，水池內(nèi)不放平臺(tái)，讓大鼠于池中自由游泳120 s，讓其熟悉周圍環(huán)境，此階段持續(xù)5 d后開始測(cè)試。定位航行實(shí)驗(yàn)：放置平臺(tái)，第1～4天每日上午及下午固定時(shí)間按照東北、西北、西南、東南4個(gè)象限將大鼠面向池壁完全浸入水中，記錄其從入水到找到平臺(tái)時(shí)間。若120 s內(nèi)未找到平臺(tái)則引導(dǎo)其找到平臺(tái)，搜索時(shí)間記為120 s。所有大鼠在找到平臺(tái)后均保持在臺(tái)上30 s，讓其熟悉周圍參照物?？臻g探索時(shí)間：第5天撤掉平臺(tái)，將大鼠頭向東北迷宮壁的中點(diǎn)浸入水中，記錄大鼠在120 s內(nèi)穿越原平臺(tái)次數(shù)及在原平臺(tái)處探索時(shí)間，并計(jì)算百分比。

1.2.4CB2R、MDA、SOD水平檢測(cè)

水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后立即處死大鼠，并提取海馬組織。冰浴條件下超聲震碎制成10%組織勻漿液，并于4 ℃、3 000 r/min條件下離心10 min,采用考馬斯亮藍(lán)檢測(cè)法測(cè)定海馬組織MDA及SOD水平。取海馬組織，根據(jù)蛋白提取試劑盒提取總蛋白并測(cè)定濃度。根據(jù)Western blot試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，采用1∶300比例稀釋后的兔抗CB2R孵育過(guò)夜。次日TBST洗滌后，加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗，孵育2 h后，進(jìn)行成像，并采用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。根據(jù)內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算目標(biāo)條帶相對(duì)值，判斷蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 水迷宮結(jié)果

第1～4天，5組在同一時(shí)間點(diǎn)找到平臺(tái)時(shí)間由高到低分別為模型組、石甘散組、托吡酯組、聯(lián)合組、對(duì)照組。撤掉平臺(tái)后，穿越原平臺(tái)位置次數(shù)及在平臺(tái)象限搜索時(shí)間所占百分比由低到高分別為模型組、石甘散組、托吡酯組、聯(lián)合組、對(duì)照組，見表1、2。

表1 各組大鼠搜索平臺(tái)時(shí)間

表2 各組大鼠穿越平臺(tái)時(shí)間及在原平臺(tái)象限搜索時(shí)間所占百分比

2.2 腦組織MDA及SOD水平比較

各組MDA水平由高到低分別為模型組、石甘散組、托吡酯組、聯(lián)合組、對(duì)照組，而SOD水平由低到高分別為模型組、石甘散組、托吡酯組、聯(lián)合組、對(duì)照組，見表3。

表3 各組腦組織MDA及SOD水平比較

2.3 海馬組織CB2R蛋白水平比較

各組CB2R蛋白水平表現(xiàn)分別為模型組(0.39±0.09)、聯(lián)合組(0.30±0.06)、石甘散組(0.20±0.05)、托吡酯組(0.19±0.05)、對(duì)照組(0.13±0.04)，模型組與其他各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；石甘散組與對(duì)照組及聯(lián)合組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；托吡酯組與對(duì)照組及聯(lián)合組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 海馬組織CB2R蛋白Western blot結(jié)果

3 討 論

流行病學(xué)資料顯示，世界范圍內(nèi)癲癇發(fā)病率約為5%，且是兒童時(shí)期最為常見的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，高發(fā)于出生后的第一年[11]。大部分癲癇兒童的智力無(wú)明顯異常，但有部分患兒會(huì)表現(xiàn)為暫時(shí)或永久性的認(rèn)知損傷，這將嚴(yán)重影響患兒的生活質(zhì)量及身心健康。研究認(rèn)為，導(dǎo)致癲癇患兒認(rèn)知功能的主要因素包括引起癲癇發(fā)作的神經(jīng)病理因素，其次為癲癇的發(fā)作形式、社會(huì)心理因素及抗癲癇藥物，上述因素相互作用導(dǎo)致患兒的認(rèn)知功能障礙[12-13]。抗癇藥物為目前臨床上治療癲癇的主要方式，其具有應(yīng)用范圍廣、使用時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)，而單藥或多藥物的長(zhǎng)期應(yīng)用導(dǎo)致抗癇藥物對(duì)患者，特別是大腦處于發(fā)育期的患兒認(rèn)知功能的影響則是臨床工作者及家長(zhǎng)的關(guān)注重點(diǎn)。

托吡酯是一種新型抗癇藥物，其發(fā)揮作用的主要機(jī)制包括以下幾個(gè)方面[14]：(1)通過(guò)γ-氨基丁酸(GABA)受體作用，從而對(duì)GABA介導(dǎo)的神經(jīng)抑制作用產(chǎn)生促進(jìn)作用；(2)對(duì)電壓依賴性鈉離子通過(guò)產(chǎn)生阻斷作用；(3)調(diào)節(jié)谷氨酸水平從而調(diào)節(jié)離子通道；(4)對(duì)部分電壓門控及鈣門控鉀離子通道內(nèi)流具有增強(qiáng)作用。有研究發(fā)現(xiàn)，托吡酯對(duì)正常幼鼠的認(rèn)知功能無(wú)影響，而對(duì)癲癇幼鼠的認(rèn)知功能具有一定的改善作用[15]。而也有研究發(fā)現(xiàn)，托吡酯對(duì)癲癇患者的運(yùn)動(dòng)力、注意力等方面產(chǎn)生負(fù)面影響[16]。石甘散屬我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)范疇，由石菖蒲及甘松組成。研究發(fā)現(xiàn)，石甘散可改善戊四氮所致的癲癇大鼠海馬組織中的谷氨酸、GABA水平，從而調(diào)節(jié)離子通道，抑制神經(jīng)元放電，最終保護(hù)腦細(xì)胞，發(fā)揮抗癇的作用[17]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，石菖蒲含有氨基酸、有機(jī)酸、揮發(fā)油等成分，具有抗驚厥、鎮(zhèn)靜、腦保護(hù)及益智等作用[18]。而甘松發(fā)揮藥效的主要成分為甘松新酮，并具有改善認(rèn)知功能、保護(hù)腦神經(jīng)及鎮(zhèn)靜等作用[19]?；诖?，本研究探討了石甘散聯(lián)合托吡酯對(duì)癲癇幼鼠認(rèn)知功能的影響。結(jié)果顯示，單獨(dú)用藥或聯(lián)合用藥均可改善癲癇幼鼠的認(rèn)知功能，且石甘散聯(lián)合托吡酯治療對(duì)幼鼠的認(rèn)知功能改善效果更為明顯。

氧化應(yīng)激及其所致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡是誘發(fā)并導(dǎo)致癲癇反復(fù)發(fā)作的主要原因，其主要機(jī)制為活性氧簇ROS的過(guò)度表達(dá)從而增加了細(xì)胞間的鈣離子濃度，進(jìn)而導(dǎo)致腦部神經(jīng)元的重塑、壞死及凋亡[5]。SOD為機(jī)體內(nèi)超氧化物酶，具有清除自由基、還原有毒過(guò)氧化物的作用；MDA是脂質(zhì)發(fā)生氧化應(yīng)激的終產(chǎn)物，具有細(xì)胞毒性，二者在癲癇的發(fā)生、發(fā)展中均發(fā)揮著重要作用。內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起著重要作用，而CB2R為內(nèi)源性大麻素受體之一，主要表達(dá)于外周免疫細(xì)胞。近年來(lái)，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)CB2R在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的特定區(qū)域也有所表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)，在毛果蕓香堿誘導(dǎo)的癲癇大鼠模型慢性期中，大麻素可改善大鼠的癲癇行為，并通過(guò)對(duì)神經(jīng)元自噬作用激活從而產(chǎn)生抗氧化作用[20]。本研究結(jié)果顯示，單獨(dú)用藥或聯(lián)合用藥均可改善癲癇幼鼠的腦組織MDA、SOD及海馬CB2R水平，且石甘散聯(lián)合托吡酯治療對(duì)幼鼠的各指標(biāo)改善效果更為明顯，提示可抑制癲癇幼鼠的氧化作用。

綜上所述，石甘散聯(lián)合托吡酯可顯著改善癲癇幼鼠認(rèn)知功能，并提高海馬組織SOD活性及CB2R水平，降低MOD含量，抑制氧化反應(yīng)，減輕自由基對(duì)腦組織的損傷。