蘇淮仔豬腹瀉細(xì)菌性病原的分離鑒定與耐藥性分析

王禮偉 周剛 柏傳茂 楊生明 郭永久 唐炎 汪國(guó)蓮

摘要：為了解淮安地區(qū)蘇淮豬仔豬出現(xiàn)細(xì)菌性腹瀉的病因并提供治療方案，采集腹瀉仔豬的肛拭子樣品共95份，對(duì)采集的樣品進(jìn)行細(xì)菌分離與鑒定、動(dòng)物致病性鑒定及耐藥性分析。結(jié)果顯示，本次試驗(yàn)共分離鑒定到78株大腸桿菌，92株沙門氏菌;動(dòng)物致病性試驗(yàn)顯示，大腸桿菌致小鼠死亡率為65.38%，沙門氏菌致小鼠死亡率為95.84%;藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，大腸桿菌耐藥率高于沙門氏菌，且均對(duì)青霉素類和林可霉素類高度耐藥，對(duì)氟喹諾酮類耐藥率最低。多重耐藥結(jié)果顯示，所有分離菌株均為多重耐藥菌株，大腸桿菌主要表現(xiàn)8～10耐，沙門氏菌主要表現(xiàn)在6～8耐。

關(guān)鍵詞：仔豬;腹瀉;大腸桿菌;沙門氏菌;耐藥性

中圖分類號(hào)： S855.3? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）11-0127-05

收稿日期：2020-09-08

基金項(xiàng)目：蘇北科技專項(xiàng)科技幫扶項(xiàng)目（編號(hào)：SZ-HA2019032）;淮安市農(nóng)科院科研發(fā)展基金項(xiàng)目（編號(hào)：HNY202025）。

作者簡(jiǎn)介：王禮偉（1989—），男，江蘇淮安人，碩士，助理研究員，主要從事動(dòng)物傳染病防控及農(nóng)業(yè)科技服務(wù)。E-mail：wlw58@sian.cn。

通信作者：汪國(guó)蓮，碩士，研究員，主要從事農(nóng)業(yè)科技服務(wù)。E-mail：2567327519@qq.com。

仔豬腹瀉伴有不同程度的腹瀉、脫水、自身免疫力下降，是仔豬死亡和繼發(fā)其他疾病的重要原因，影響?zhàn)B豬生產(chǎn)效率和盈利情況，給養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，主要體現(xiàn)在發(fā)病率高、降低日增質(zhì)量、延長(zhǎng)出欄時(shí)間、飼料轉(zhuǎn)化率下降、飼料成本增加等 [1-2]。仔豬腹瀉是病原體、腸道環(huán)境和管理之間相互作用的結(jié)果，其中病原體的感染是導(dǎo)致仔豬發(fā)生腹瀉的主要原因，根據(jù)病原體的不同，細(xì)菌引發(fā)的可分為埃希氏大腸桿菌、沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等;病毒引發(fā)的如流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒、非洲豬瘟病毒等;寄生蟲引發(fā)的如剛地弓形蟲、艾美耳球蟲等 [3]。鑒于細(xì)菌性腹瀉在規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)患病中的普遍性和重要性，為進(jìn)一步了解淮安地區(qū)蘇淮仔豬腹瀉細(xì)菌性病原流行病學(xué)和抗生素耐藥情況，本試驗(yàn)采集腹瀉仔豬的肛拭子樣本進(jìn)行了細(xì)菌的分離鑒定、致病力試驗(yàn)及耐藥性分析，旨在為疾病防控、減抗禁抗、食品安全提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 2020年1月至4月采集來自淮安地區(qū)3個(gè)蘇淮豬養(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)腹瀉癥狀的仔豬肛拭子95份。發(fā)病仔豬主要表現(xiàn)為精神不振、食欲不佳、被毛聳亂、拉黃白色稀軟或水樣糞便等。以滅菌棉拭子采集發(fā)病仔豬肛拭樣品置于滅菌EP中，保存于-20 ℃冰箱待用。

1.1.2 試驗(yàn)材料 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基、MH瓊脂培養(yǎng)基、MH液體培養(yǎng)基均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司;無菌脫纖維兔血瓊脂培養(yǎng)基的制備參考文獻(xiàn) [4];獸醫(yī)臨床常用藥敏紙片均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司，包括紅霉素、阿奇霉素、克林霉素、林可霉素、鏈霉素、慶大霉素、多西環(huán)素、四環(huán)素、頭孢唑啉、青霉素、利福平、氧氟沙星。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的富集、分離與純化 將采集的肛拭子接種于5 mL MH液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h。然后用接種環(huán)按照常規(guī)細(xì)菌分離方法分別接種（“Z”字形）于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h。挑取典型單個(gè)菌落接種于5 mL MH液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，劃線接種到無菌脫纖維兔血瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，觀察菌株溶血情況，同時(shí)接種到MH液體培養(yǎng)基中備用。

1.2.2 革蘭氏染色鏡檢 將無菌脫纖維兔血瓊脂培養(yǎng)基中單個(gè)菌落進(jìn)行涂片、革蘭氏染色、顯微鏡油鏡下觀察菌體的形狀及染色特性。

1.2.3 細(xì)菌生化鑒定試驗(yàn) 將待檢菌落按照伯杰氏生化鑒定手冊(cè)進(jìn)行生化鑒定。

1.2.4 動(dòng)物致病性試驗(yàn) 將小鼠分成A、B、C 3組。A、B組小鼠分別依據(jù)體質(zhì)量按0.02 mL/g腹腔注射經(jīng)鑒定純化的大腸埃希氏菌和沙門氏菌菌液，每種菌注射2只，C組小鼠分別依據(jù)體質(zhì)量按0.02 mL/g 腹腔注射無菌生理鹽水。接種后觀察并剖檢發(fā)病和死亡的小鼠，統(tǒng)計(jì)致病率。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 吸取致死小鼠菌液100 μL置于MH瓊脂培養(yǎng)基上，涂布涂勻，3～5 min后，待菌液干燥后，均勻貼上4片不同的藥敏紙片（d=6 mm），參照文獻(xiàn) [4]的方法，放置恒溫箱培養(yǎng)18～24 h后測(cè)量抑菌環(huán)的直徑，根據(jù)抑菌圈的大小，根據(jù)《抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》 [5]判定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

對(duì)腹瀉仔豬肛拭子樣本進(jìn)行選擇分離鑒定，由圖1～圖6可知，疑似大腸桿菌在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)出粉紅色、光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊、直徑1.0～2.5 mm的菌落，其中12株在血瓊脂培養(yǎng)基上生成透明溶血環(huán);挑取典型單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，疑似大腸桿菌為兩端鈍圓、散在或成對(duì)、紅色、革蘭氏陰性短桿菌。疑似沙門氏菌在SS瓊脂上長(zhǎng)出乳白色、圓形、邊緣整齊、光滑、表面有隆起、中間有針狀黑點(diǎn)的小菌落，其中12株在血瓊脂培養(yǎng)基上生成透明溶血環(huán);挑取典型單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，疑似沙門氏菌為無莢膜、無芽孢、散在的革蘭氏陰性直桿菌。

2.2 細(xì)菌生化鑒定結(jié)果

分離的疑似大腸桿菌最終有78株能夠發(fā)酵乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和甘露醇，吲哚反應(yīng)陽(yáng)性，MR反應(yīng)陽(yáng)性，V.P.反應(yīng)陰性，檸檬酸鹽反應(yīng)陰性，三糖鐵斜面底部產(chǎn)酸及產(chǎn)氣、不生成硫化氫，符合大腸桿菌的生化特性;分離的疑似沙門氏菌最終有92株發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和甘露醇，吲哚反應(yīng)陰性，MR反應(yīng)陽(yáng)性，V.P.反應(yīng)陰性，檸檬酸鹽反應(yīng)陽(yáng)性，三糖鐵斜面產(chǎn)堿、底部產(chǎn)酸及產(chǎn)氣產(chǎn)硫化氫，符合沙門氏菌的生化特性。最終，分離鑒定得到78株大腸桿菌，分離率為82.10%（78/95）;分離到92株沙門氏菌，分離率為96.84%（92/95）。

2.3 細(xì)菌致病性試驗(yàn)結(jié)果

將分離鑒定的78株大腸桿菌菌液腹腔注射小鼠24 h后，小鼠被毛粗亂、喜臥少動(dòng)、精神沉郁、厭食、排松軟糞便等癥狀;48 h后開始死亡，剖檢發(fā)現(xiàn)腹腔充滿黏性黃色滲出物，肝臟、腎臟、脾臟腫大，腸道膨脹充氣，劃線培養(yǎng)后均能分離鑒定到大腸桿菌，大腸桿菌致小鼠死亡率為65.38%（51/78，溶血性菌株注射小鼠全部死亡）。將分離鑒定的92株沙門氏菌菌液腹腔注射小鼠24 h后，小鼠精神萎靡、戰(zhàn)栗、被毛蓬松，少數(shù)出現(xiàn)便血、水樣糞便等癥狀;48 h后開始死亡，剖檢發(fā)現(xiàn)小鼠腸道充血、腹腔積水、肝臟和脾臟均有壞死點(diǎn)，劃線培養(yǎng)后均能分離到沙門氏菌，沙門氏菌致小鼠死亡率為94.57%（87/92，溶血性菌株注射小鼠全部死亡）;對(duì)照組小鼠均正常。

2.4 細(xì)菌耐藥性試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)致死小鼠的51株大腸桿菌和87株沙門氏菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，由表1可知，分離鑒定的51株大腸桿菌對(duì)林可霉素（100.00%）、青霉素（98.04%）、克林霉素（96.08%）、紅霉素（94.12%）、阿奇霉素（90.20%）高度耐藥，其余抗菌藥物的耐藥率分別為：利福平（84.31%）、鏈霉素（82.35%）、頭孢唑啉（74.51%）等;分離鑒定的87株沙門氏菌對(duì)青霉素（94.25%）、林可霉素（90.80%）、克林霉素（87.36%）、多西環(huán)素（82.76%）高度耐藥，其余抗菌藥物的耐藥率分別為：紅霉素（59.77%）、阿奇霉素（55.17%）等。

2.5 細(xì)菌多重耐藥結(jié)果

由圖7可知，分離菌株多重耐藥結(jié)果，51株大腸桿菌中分離株中8～10重耐藥的占比最大，累計(jì)比例為72.55%（37/51），其中，最高為9重，耐藥比例為29.41%（15/51），1～4重耐藥菌株數(shù)為0%（0/51）。87株沙門氏菌分離株中6～8重耐藥的占比最大，累計(jì)比例為68.96%（60/87），其中，最高為7重，耐藥比例為28.74%（25/87），1～3重和11～12重耐藥的菌株數(shù)為0%（0/87）。

3 討論

根據(jù)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局發(fā)布數(shù)據(jù)，受非洲豬瘟疫情的影響，2019年我國(guó)生豬存欄31 041萬(wàn)頭，同比下跌27.5%;生豬出欄54 419萬(wàn)頭，同比下跌21.6%，而仔豬作為育肥豬的種苗，提高仔豬存活率至關(guān)重要 [6]。腹瀉是豬場(chǎng)常見傳染病之一，然而腹瀉的流行病學(xué)原因卻十分復(fù)雜，自身生理因素、飼料營(yíng)養(yǎng)缺乏、環(huán)境應(yīng)激和飼養(yǎng)管理不當(dāng)及其他病原體感染等因素，均可能會(huì)導(dǎo)致仔豬腸道生態(tài)內(nèi)環(huán)境改變，使得變形菌門中的大腸桿菌、沙門氏菌、霍亂弧菌等條件致病菌在內(nèi)的多種菌群失調(diào)，最終導(dǎo)致仔豬細(xì)菌性腹瀉等癥狀 [7-8]，Hermann-Bank等發(fā)現(xiàn)，腸桿菌屬、腸球菌屬增加了新生仔豬腹瀉的風(fēng)險(xiǎn)且與腸道微生物變異密切相關(guān)，且使用疫苗接種或抗生素治療效果有限 [9]。本試驗(yàn)對(duì)當(dāng)?shù)靥K淮豬仔豬腹瀉的細(xì)菌性病原進(jìn)行分離培養(yǎng)鑒定，95份樣本共分離出170 株病菌，大腸桿菌陽(yáng)性率82.10%（78/95），沙門氏菌陽(yáng)性率96.84%（92/95），混合感染率為73.68%（70/95）。黃美州等對(duì)甘肅地區(qū)新生仔豬腹瀉細(xì)菌性病原調(diào)查后發(fā)現(xiàn)大腸桿菌與沙門氏菌混合感染最終導(dǎo)致仔豬嚴(yán)重腹瀉 [10];李晨等從貴州地區(qū)7個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)128份仔豬腸道樣本中分離到大腸桿菌的陽(yáng)性率為60.94%（78/128），沙門氏菌的陽(yáng)性率為16.41%（21/128） [11];李淑紅等在湘西北地區(qū)豬場(chǎng)檢測(cè)到沙門氏菌分離率為55.56%（10/18），大腸桿菌分離率為44.44%（8/18） [12];曲歌等在吉林地區(qū)21家規(guī)模化豬場(chǎng)117份仔豬腹瀉糞便樣本中進(jìn)行PCR檢測(cè)，分離出大腸桿菌104份，其中49份具有致病性，占樣本總數(shù)的42.88%;分離出沙門氏菌19份，其中15份具有致病性，占樣本總數(shù)的12.82% [13]，這進(jìn)一步說明大腸桿菌在感染仔豬的普遍性，而沙門氏菌分離率差異性可能是由于地域差異、動(dòng)物健康程度及養(yǎng)豬場(chǎng)用藥情況不同所致。

另動(dòng)物感染試驗(yàn)結(jié)果顯示，大腸桿菌和沙門氏菌的致死率分別為65.38%（51/78）和94.56%（87/92），其中，溶血性菌株的致死率為100%，表明淮安地區(qū)分離菌株具有較強(qiáng)的毒力因子，與福建泉州地區(qū)大腸桿菌高致死率71.43%（30/42） [14]具有一致性。徐引弟等通過對(duì)致病性大腸桿菌開展藥敏紙片試驗(yàn)并對(duì)24個(gè)耐藥基因進(jìn)行擴(kuò)增分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌耐藥決定區(qū)基因發(fā)生變異是引起細(xì)菌耐藥性的主要原因，進(jìn)而從分子手段揭示了耐藥細(xì)菌株的基因型和表型具有一定關(guān)聯(lián)性，細(xì)菌產(chǎn)生多重耐藥性的機(jī)制具有較高的復(fù)雜性 [15]。因此，對(duì)于蘇淮豬可以參考從抗腹瀉基因MUC13、FUT1進(jìn)行定向選育，利用分子育種方案從源頭上進(jìn)行腹瀉的防控 [16]。

近年來，養(yǎng)殖業(yè)已經(jīng)大力開始提倡減抗禁抗行動(dòng)，但在疾病的預(yù)防治療、自配飼料的使用上，依然存在抗生素的濫用問題，致使細(xì)菌耐藥性問題日趨嚴(yán)重 [17-18]。本研究對(duì)分離獲得的致死小鼠大腸桿菌和沙門氏菌進(jìn)行了12種抗菌藥的耐藥性分析，結(jié)果表明，大腸桿菌和沙門氏菌對(duì)林可霉素類和青霉素類高度耐藥，耐藥率均超過90%，除喹諾酮類外，其他抗菌藥均呈現(xiàn)不同程度的耐藥率。張青嫻等對(duì)分離的1株豬源產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌同樣對(duì)青霉素類、頭孢類、四環(huán)素類、喹諾酮類抗生素耐藥，而對(duì)氨基糖苷類抗生素敏感，并通過4種常見的ESBLs耐藥基因擴(kuò)增分析，提出加強(qiáng)產(chǎn)酶耐藥菌的監(jiān)測(cè)及保守地使用現(xiàn)有抗生素的觀點(diǎn) [19]。而李佳瑞等從25株耐藥大腸桿菌攜帶的主動(dòng)外排基因進(jìn)行研究，acrA、acrB這2種主動(dòng)外排基因和調(diào)控基因mar A和sox S的相對(duì)表達(dá)量和多重耐藥的耐藥譜數(shù)呈正相關(guān)，調(diào)控基因acrR的相對(duì)表達(dá)量和多重耐藥的耐藥譜數(shù)呈負(fù)相關(guān) [20]。Xu等對(duì)我國(guó)北京等10個(gè)省份的動(dòng)物、人的非典型致病性大腸桿菌（aEPEC）進(jìn)行藥敏紙片試驗(yàn)，結(jié)果顯示，267株菌株中，128株（47.9%）檢出多重耐藥，40株耐藥菌株對(duì)10種以上抗菌藥物耐藥，有47株（17.6%）菌株被鑒定為產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBL），而從多重耐藥情況看，致死小鼠大腸桿菌和沙門氏菌多重耐藥情況嚴(yán)重，4耐及4耐以上菌株高達(dá)100% [21]，這一結(jié)果與Li等 [22]、田瑞 [23]研究基本一致，其中，Li等研究發(fā)現(xiàn)高達(dá)71.25%（57/80）的沙門氏菌菌株呈現(xiàn)多種藥物耐藥，對(duì)頭孢菌素類及氨基糖苷類抗生素敏感 [22];田瑞等研究的大腸桿菌分離率為86.31%（580/672），累計(jì)產(chǎn)生23種多重耐藥型 [23]。

4 結(jié)論

本研究從細(xì)菌性病原的角度對(duì)致蘇淮仔豬腹瀉的病因進(jìn)行初步分析，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌、沙門氏菌是主要致病菌，藥敏紙片試驗(yàn)顯示2種致病菌均呈現(xiàn)4重及以上多重耐藥性，均對(duì)喹諾酮類藥物高度敏感，試驗(yàn)結(jié)果可為蘇淮豬細(xì)菌性腹瀉癥的病因和臨床治療提供參考依據(jù)。

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