非編碼RNA ANRIL CNV-2738282增加中國南方人群肺動脈高壓的易感性

李惠波 段躍興 賴曉純 馮燕玲 黃蓮枝 陳欽修 程宏基 鄭棟 伍金雷 程穎 黃冰生 林桂雄 吳鈺燕 張鵬 李國揚 曾慶春 卓裕豐

廣州市番禺區(qū)何賢紀念醫(yī)院1心內(nèi)科，3呼吸內(nèi)科（廣州511400）；2廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院腎內(nèi)科（廣州510260）；4南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院心內(nèi)科（廣州510515）

肺動脈高壓（pulmonary hypertension，PAH）是一種發(fā)病機制復雜的血管疾病，其主要特征為肺血管阻力增加和血管壓力持續(xù)增高［1-3］。目前對PAH 發(fā)病相關(guān)機制尚不清楚。而有研究顯示單核苷酸多態(tài)等基因遺傳變異與PAH 發(fā)生有著密切的關(guān)聯(lián)［4-6］。而基因組DNA 拷貝數(shù)變異（copy-number variations，CNVs）是近年來新發(fā)現(xiàn)的遺傳變異形式，且CNVs 更易引起基因的結(jié)構(gòu)異常或表達變化［7］。已有研究顯示染色體9p21.3 區(qū)段是血管疾病的遺傳熱區(qū)［8］，而ANRIL（antisense non coding RNA in the INK4 locus）在此染色體位點功能中發(fā)揮重要作用［9］。但是關(guān)于PAH 與ANRIL 的研究國內(nèi)外鮮有報道。本研究基于文獻報道和生物信息學分析，擬探索位于血管疾病遺傳熱區(qū)9p21.3 的長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）ANRIL 的CNVs 與PAH 疾病發(fā)生的關(guān)系，以期找出適合評價PAH 發(fā)病、診斷的遺傳分子標記。

1 資料與方法

1.1 樣本資料本研究共納入在2015年1月至2018年12月期間就診于番禺區(qū)何賢紀念醫(yī)院和南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院的PAH 患者587 例，還有736 例年齡和性別匹配的健康對照者也在同一時期的體檢項目中登記。通過右心導管測定所有患者的血液動力學，若平均肺動脈壓≥25 mmHg 而肺毛細血管楔壓正常，則可診斷為PAH［10］。

1.2 研究方法

1.2.1 CNV 選擇、基因型及LncRNA ANRIL 靶基因表達檢測生物信息學分析發(fā)現(xiàn)LncRNA ANRIL（http：//dgv.tcag.ca/dgv/app/home），本研究中只檢測CNV-2738282 基因型，并分析其與PAH 的關(guān)聯(lián)。收集150 對PAH 病例和健康對照新鮮靜脈血樣本，采用實時熒光定量PCR 法檢測LncRNA ANRIL及其靶基因在PBMC 標本中的表達水平、ANRIL 在細胞核和胞漿的表達。

1.2.2 LncRNA ANRIL 的生物學表型檢測將pcDNA3.1-ANRIL 和pcDNA3.1 空白質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至EAhy926 細胞，轉(zhuǎn)染6 h 后換液培養(yǎng)，G418 藥物篩選穩(wěn)定表達細胞系。進行單核細胞粘附實驗、單核細胞跨上皮細胞遷移實驗和血管內(nèi)皮細胞遷移實驗。

1.2.3 熒光素酶報告基因?qū)嶒灱毎臃N于24孔板，當細胞匯合度達80%～90%時，將LipofectamineTM3000 與CARD8 啟動子報告基因質(zhì)粒和pcDNA3.1-ANRIL 或pcDNA3.1 空白質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染加入各培養(yǎng)孔，14～16 h 后分別檢測螢光素酶和內(nèi)參海腎熒光素酶活性。

1.2.4 ChIRP實驗使用Magna ChIRPTMChromatin Isolation by RNA Purification Kit 試劑盒（Millipore，馬薩諸塞州，美國）進行ANRIL 對CARD8 基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機制探討。實驗依照試劑操作說明進行，最后洗滌、分離并純化RNA 和DNA 后應(yīng)用qRT-PCR 法進行檢測。

1.2.5 RNA-pull down 實驗委托上海生工生物工程公司體外合成ANRIL 片段以及截斷的突變RNA 序列ANRIL-Mut 作為參照，并以T7 RNA polymerase 轉(zhuǎn)錄為ANRIL RNA 片段。用親和素錨定磁珠收集RNA-蛋白質(zhì)復合物，對復合物進行Western blot 驗證。

1.3 統(tǒng)計學方法應(yīng)用R 軟件（版本3.0.2）進行統(tǒng)計和分析。使用χ2檢驗、logistic 回歸模型，獨立樣本t檢驗分析在病例對照組間比較的差異，及其在不同基因型之間的差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CNV-2738282 與人群肺動脈高壓的發(fā)病顯著相關(guān)利用TaqMan 拷貝數(shù)分型方法，檢測PAH 病例和健康對照的CNV-2738282 的拷貝數(shù)。CNV-30795 的基因型與人群PAH 發(fā)病存在顯著關(guān)聯(lián)，且相較于2-copy 常見基因型攜帶者，≤1-copy 基因型攜帶者發(fā)生PAH 的風險顯著降低（OR= 0.41，95%CI：0.32～0.52）。進一步分層分析顯示（表2），CNV-2738282 與PAH 發(fā)病的風險在年齡、性別、吸煙、飲酒等亞組間差異均有統(tǒng)計學意義；因樣本量小，CNV-2738282 與PAH 發(fā)病的關(guān)聯(lián)在有PAH家族史亞組中差異無統(tǒng)計學意義。此外，未觀測到CNV-2738282 與上述環(huán)境因素在PAH 發(fā)病風險上存在顯著的交互效應(yīng)。見表1。

表1 CNV-2738282 與PAH 之間危險因素相關(guān)性Tab.1 Correlation of risk factors between CNV-2738282 and PAH 例（%）

表2 通過PAH 和對照組中的選擇變量對CNV-2738282 基因型進行分層分析Tab.2 Analysis of CNV-2738282 genotype by PAH and the selection variables in the control group 例（%）

2.2 CNV-2738282低拷貝導致ANRIL表達降低采用qPCR 法檢測PAH 外周血PBMCs ANRIL 基因的表達水平，發(fā)現(xiàn)ANRIL 的表達水平在不同CNV-2738282 基因型PBMCs 間存在顯著差異，攜帶≤1-copy 基因型的PAH 患者中ANRIL 表達水平顯著低于2-copy 基因型的患者（P＜0.001，圖1）。

圖1 CNV-2738282 基因型與ANRIL 表達的關(guān)系Fig.1 The relationship between CNV-2738282 genotype and ANRIL expression

2.3 ANRIL 在PAH 病例中呈高表達水平qPCR法檢測了150 對PAH 和健康對照外周血PBMCs ANRIL 的表達水平，發(fā)現(xiàn)ANRIL 在60.7%（91/150）的病例PBMCs 中的表達高于健康對照者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001，圖2A）。

2.4 ANRIL 與CARD8 表達相關(guān)基于物信息學分析LncRNA ANRIL 可能通過與靶基因CARD8 啟動子區(qū)結(jié)合而調(diào)控其表達，繼而在PAH 外周血檢測了CARD8 基因的表達，發(fā)現(xiàn)兩者表達呈正相關(guān)（r= 0.354，P＜0.001，圖2B）。并且，CARD8 在PAH 病例外周血的表達高于健康者，差異有統(tǒng)計學意義（P= 0.002，圖2C）。此外，過表達ANRIL的血管內(nèi)皮細胞系相較于對照細胞系，其CARD8的表達顯著上調(diào)（圖2D）。

2.5 ANRIL 通過Trans-acting 機制在轉(zhuǎn)錄水平影響CARD8 的表達亞細胞定位實驗顯示ANRIL主要在胞核表達，提示其可能在轉(zhuǎn)錄水平參與基因表達調(diào)控（圖2E）。生物信息學分析顯示ANRIL 可通過結(jié)合CARD8啟動子區(qū)而調(diào)控CARD8的表達，故通過構(gòu)建CARD8 啟動子熒光素酶報告基因，將報告基因和pcDNA3.1-ANRIL 或空載體共轉(zhuǎn)染血管內(nèi)皮細胞系；過表達ANRIL 能明顯上調(diào)CARD8 基因的轉(zhuǎn)錄水平（圖2F）。ChIRP 實驗結(jié)果證實，ANRIL 可與CARD8 基因啟動子特異性結(jié)合（圖2G、H）。RNA Pull-down 實驗結(jié)果則顯示，在蛋白水平ANRIL 未與CARD8 蛋白特異性結(jié)合。上述結(jié)果提示ANRIL 是通過特異性結(jié)合CARD8 基因啟動子而參與CARD8 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控（圖2I）。

圖2 ANRIL 與CARD8 表達的關(guān)聯(lián)及其分子Fig.2 The relationship between ANRIL and CARD8 expression and its molecules

2.6 ANRIL 介導的細胞生物學表型變化見圖3，相較于對照細胞系，過表達ANRIL 能顯著促進THP-1 細胞對血管內(nèi)皮細胞EA.hy926 的黏附和定植能力；此外，過表達ANRIL 的EA.hy926 細胞的遷移能力亦明顯增加。

圖3 ANRIL 過表達對血管內(nèi)皮細胞的生物學功能影響Fig.3 The effect of ANRIL overexpression on the biological function of vascular endothelial cells

3 討論

PAH 是一種進行性致死性血管疾病，其特征是肺動脈壓升高，血管重塑［11］，并最終導致右心室心力衰竭［12-13］。而有證據(jù)表明LncRNAs 變異在PAH 發(fā)病機制中扮演著重要的角色［14-15］。但是關(guān)于ANRIL CNVs與PAH關(guān)系的研究至今鮮有報道。

CNVs 可直接造成位于該區(qū)段的基因拷貝數(shù)發(fā)生變化，影響基因表達水平，導致表型差異［16］，已成為目前研究的熱點之一。YANG 等［17］研究發(fā)現(xiàn)攜帶BMPR2 變異的PAH 患者臨床上表現(xiàn)為肺動脈血流動力受阻及心功能受損。本研究發(fā)現(xiàn)ANRIL 在PAH 病例中表達水平增多，同時ANRIL與CNV-2738282 表達成正相關(guān)，提示ANRIL 表達水平越高，PAH 發(fā)病風險升高。

近年來發(fā)現(xiàn)ANRIL 參與心血管疾病的發(fā)病機制是通過調(diào)節(jié)基因的表達。LU 等［18］研究發(fā)現(xiàn)ANRIL 基因型rs10757278 調(diào)節(jié)CARD8 促進心血管疾病發(fā)生。而CARD8 也參與肺部疾病的發(fā)病機制［19-21］。本研究發(fā)現(xiàn)PAH 患者中ANRIL、CARD8表達呈正相關(guān)，而且ANRIL 與CARD8 特異性結(jié)合基因啟動子而參與CARD8 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。利用生物功能分析表明，ANRIL 是通過特異性結(jié)合CARD8 基因啟動子影響血管內(nèi)皮細胞的各項功能。

經(jīng)查閱國內(nèi)外文獻，暫未發(fā)現(xiàn)國內(nèi)外ANRIL拷貝數(shù)分布差異的相關(guān)報道，因此也遺憾的未能進一步研究。綜上，本研究在國內(nèi)較先發(fā)現(xiàn)ANRIL CNV-2738282 與我國人群PAH 發(fā)病存在顯著關(guān)聯(lián)，該CNV 通過調(diào)控ANRIL 的表達，影響ANRIL 對下游靶基因CARD8 的轉(zhuǎn)錄激活，繼而影響PAH 疾病的發(fā)生，可作為人群PAH 易感評估的生物標志物。