醒腦益智劑聯(lián)合羅格列酮改善2型糖尿病小鼠記憶障礙的作用機制

毛黎黎 高曉斐 岳仁宋

【摘 要】 目的：研究醒腦益智劑聯(lián)合羅格列酮對2型胰島素抵抗型糖尿病癡呆小鼠學習記憶能力及胰島素信號通路的影響及其作用機制。方法：雄性10周齡C57BL小鼠16只為正常對照組，雄性10周齡KKay小鼠80只為模型組，高糖高脂飼料喂養(yǎng)8周后，隨機血糖≥13.9mmol/L為模型成立，隨機分為模型對照組、陽性對照組和聯(lián)合給藥高、中、低劑量組。陽性組每日用馬來酸羅格列酮片（0.003g/kg）灌胃，聯(lián)合給藥高、中、低劑量組每日分別用馬來酸羅格列酮片（0.003g/kg）和醒腦益智劑（3.6、7.2、14.4g/kg）灌胃，對照組每日用等體積生理鹽水ig，連續(xù)42 d。給藥前后分別行1次Morris水迷宮實驗，最后1次水迷宮后立即在冰具上采集樣本，檢測小鼠大腦皮層及海馬中PI-3K/Akt的蛋白表達水平以及GSK-3β（糖原合酶激酶-3β）、Tau蛋白及P-Tau（Tau蛋白磷酸化）水平。 結(jié)果：與正常組相比，模型組小鼠的平臺潛伏期明顯偏高（P<0.05），PI-3K活性明顯偏低（P<0.05），GSK-3β和p-Tau水平均明顯偏高（P<0.05），聯(lián)合給藥組各項指標與正常組無明顯差異。與模型組相比，陽性組與之各項指標差異均不明顯，聯(lián)合給藥組平臺潛伏期均明顯偏低（P<0.05），PI-3K/Akt活性均明顯偏高（P<0.05），GSK-3β和P-Tau水平均明顯偏低（P<0.05），其中以聯(lián)合給藥中劑量組效果最為明顯。給藥后各組間Ins R水平差異不大。 結(jié)論：在常規(guī)改善胰島素抵抗的基礎(chǔ)上，醒腦益智劑能有效提高2型糖尿病癡呆小鼠學習、記憶能力，其可能的作用機制為改善大腦海馬胰島素信號傳導通路，增強PI-3K活性，降低GSK-3β表達和Tau蛋白磷酸化水平。

【關(guān)鍵詞】 醒腦益智劑；糖尿病性記憶障礙；GSK-3β；Tau蛋白；PI-3K

【中圖分類號】R965 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2018）11-0014-05

Abstract：Objective To study the effect and mechanism of Xingnao Yizhi prescription with Rosiglitazone on memory impairment of type 2 diabetes. Method Sixteen 10-week C57BL mice were as normal group and 80 Kkay mice 10- week with high blood sugar （≥13.9 mmol/L） as model group，positive group and composite group with high，middle and low doses. Fed the positive group was given rosiglitazone maleate tablets （0.003 g/kg） ，and composite group was given rosiglitazone maleate tablets （0.003g/kg） and Xingnao Yizhi prescription （3.6、7.2、14.4 g/kg） . Normal and model groups were given equal volume of saline. After two Morris water mazes，samples were collected and immunohistochemical method was used to test 1-phosphatidylinosital 3-kinase （ PI-3K） / Akt and western blotting was used to test glycogen synthase kinase -3， Tau protein and phosphorylation of Tau protein. Result Compared with normal group，model group used much longer time to find the plat （P<0.05） ，had less active PI-3K （P<0.05） and more active GSK-3β and p-Tau， no significant differences in the composite group and normal group. Compared with control group，there was no significant differences in positive group，while PI-3K/Akt， GSK-3β and P-Tau were contrary in composite group （P<0.05）.Conclusion Xingnao Yizhi prescription can improve the study and memory level of type 2 diabetes mice with cognitive impairment based on the reducing of plasma insulin，and the possible mechanism may enhance the activity of PI-3K， and reduce the level of GSK-3β， P-Tau.

Keywords：Xingnao Yizhi Prescription；Diabetes Memory Impairment；GSK-3β；Tau；PI-3K

糖尿病性記憶障礙也可稱為“3型糖尿病”[1-2]，是老年期癡呆中較為常見的一種慢性進行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)性病變[3-4]。根據(jù)長期的臨床觀察發(fā)現(xiàn)，本病多以腎虛為本，痰濁、血瘀為標[5-6]，從而確立了以“胰-腎-腦”軸為指導的補腎醒腦法，現(xiàn)已制成院內(nèi)合劑-醒腦益智劑，但其作用機制尚未明確。故本實驗在建立穩(wěn)定的2型糖尿病性記憶功能障礙小鼠模型的基礎(chǔ)上，進一步觀察并明確醒腦益智劑對2型糖尿病性記憶功能和大腦胰島素信號傳導通路的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物 中藥處方包括熟人參、地黃、川芎、粉葛、冰片、山藥等，由成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥劑科提供并制備。陽性對照品為馬來酸羅格列酮片[商品名文迪雅，葛蘭素史克（天津）有限公司，國藥準字H20020475]，購于成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院。

1.2 試劑 Western Blot一抗購自Cellsignal公司，二抗購自北京博奧森生物公司。

1.3 動物 SPF級雄性10周齡健康C57BL小鼠16只，體重26～35 g；SPF級雄性10周齡健康KKAy小鼠80只，高脂高糖飼料（10%蔗糖、10%脂肪、基礎(chǔ)飼料）喂養(yǎng)8周，血糖穩(wěn)定后改為基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)。以上動物及飼料均由中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所提供[許可證號SCXK（京）2009-0004]。實驗中動物自由攝食及飲水，取材前禁食12 h，溫度（23±2）℃，相對濕度26%～29%。

1.4 儀器 One-Touch-II快速血糖儀及血糖試紙（美國強生公司）；顯微鏡（日本奧林巴斯BX51T-PHD-J1）；多功能真彩色細胞圖象分析管理系統(tǒng)（Image-Pro Plus，美國Media Cybernetics 公司）；醫(yī)用X射線膠片（柯達公司，美國）。

1.5 方法

1.5.1 造模和分組 C57BL小鼠16只，由基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，為正常對照組。Kkay小鼠80只，高糖高脂飼料喂養(yǎng)6周后檢測隨機血糖≥13.9 mmol/L為造模成功，隨機分為模型對照組、陽性對照組和聯(lián)合給藥高、中、低劑量組，每組16只。

1.5.2 給藥 陽性組每天用馬來酸羅格列酮片按小鼠體重（0.003 g/kg）灌胃，聯(lián)合給藥大、中、小劑量組每日分別用馬來酸羅格列酮片（0.003 g/kg）和醒腦益智劑生藥（3.6、7.2、14.4 g/kg）灌胃，正常組和模型組每天用等體積生理鹽水灌胃，持續(xù)42 d。

1.5.3 Morris水迷宮實驗 分組前及給藥后各進行一次。前4天為隱藏平臺實驗，限定時間90 s，若小鼠找到平臺，使之于平臺休息30 s；如90 s未找到平臺，將小鼠撈起并放于平臺休息30 s，并將時間記錄為90 s。第5天為空間搜索實驗，撤除平臺，記錄小鼠在90 s內(nèi)第1次找到平臺區(qū)的時間及找到平臺的次數(shù)。數(shù)據(jù)采集及圖像分析均由圖像自動監(jiān)視和處理系統(tǒng)完成。

1.5.4 取材及標本制作

1.5.4.1 免疫組化樣本 水迷宮試驗結(jié)束后，抽簽法每組選取8只小鼠，0.1% DCPC（0.1%去乙酰頭孢菌素C）溶液處理并高壓蒸汽消毒相關(guān)手術(shù)器械，按小鼠體重3 ml/kg腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，生理鹽水經(jīng)左心室灌注后取全腦，4 ℃4%多聚甲醛固定24 h，取包括海馬、大腦額葉皮質(zhì)進行脫水、透明、浸蠟、包埋后連續(xù)冠狀切片。

1.5.4.2 Western blotting樣本 水迷宮試驗結(jié)束后，抽簽法每組選取8只小鼠， 3.5%水合氯醛按3mL/kg腹腔注射麻醉后無菌操作開顱取海馬、大腦額葉皮質(zhì)，勻漿后取上清液制備Western Blotting樣本。

1.5.5 檢測方法

1.5.5.1 每周1次斷尾取血法監(jiān)測血糖。

1.5.5.2 免疫組化方法 檢測小鼠海馬組織中PI-3K/Akt蛋白活性。先采用100倍顯微鏡觀察小鼠大腦海馬區(qū)，每個樣本取6張相同部位的腦切片，然后在200倍光鏡下選擇5個相鄰視野對陽性細胞（棕黃色胞漿）進行觀察，最后采用Image-Pro Plus軟件測定光密度值。

1.5.5.3 Western Blotting 檢測小鼠海馬組織中GSK-3β的活性、Tau蛋白總量及Tau蛋白磷酸化水平。用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，并分離蛋白，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上加一抗、辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠二抗，充分顯影曝光并照相保存。

1.5.6 統(tǒng)計學分析 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標準差（x±s）表示，采用方差分析并進行組間兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 體重和血糖 給藥前Kkay小鼠體重（g）和血糖（mmol/L）均明顯大于正常對照組C57BL小鼠體重（P<0.05）；給藥后，正常組血糖水平變化不大，模型組血糖水平明顯升高并高于其他各組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。相較于正常組C57BL小鼠，轉(zhuǎn)基因KKay小鼠養(yǎng)至第18周齡時即已出現(xiàn)輕度記憶障礙，并隨時間推移、血糖升高而逐漸加重且波動不大，說明其作為2型糖尿病性記憶障礙模型已成熟穩(wěn)定。見表1。

2.2 Morris水迷宮實驗結(jié)果 給藥后潛伏期比較，聯(lián)合給藥組和正常組第5天比第1天明顯縮短，且明顯小于模型組和陽性組；平臺象限概率比較，聯(lián)合給藥組和正常組明顯大于模型組和陽性組。差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。說明在使用羅格列酮改善胰島素抵抗的基礎(chǔ)上，醒腦益智劑可有效改善2型糖尿病小鼠的學習和記憶功能。見表2。

2.3 Western blotting實驗結(jié)果 各組小鼠大腦海馬中Tau蛋白總量差異不大。與模型組相比，正常組和聯(lián)合給藥組在Ser396位點上Tau蛋白磷酸化水平明顯偏低，GSK-3β活性明顯偏高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。Tau蛋白的過度磷酸化是2型糖尿病性記憶障礙重要的病理改變[8]，而GSK-3β活性升高是其主要原因。在改善胰島素抵抗的基礎(chǔ)上，醒腦益智劑可以有效降低GSK-3β活性并糾正Tau過度磷酸化水平。見表3。

2.4 免疫組化結(jié)果 模型組和陽性組PI-3K/Akt染色陽性表達不明顯，正常組PI-3K/Akt染色陽性表達增多，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其主要表現(xiàn)為胞漿甚至細胞核呈黃褐色；與模型組和陽性組相比較，聯(lián)合給藥組PI-3K/Akt陽性細胞染色強度及陽性細胞分級均明顯高于模型組和陽性組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這說明醒腦益智劑能有效增強海馬中PI-3K活性表達，而PI-3K活性的異常降低是引起GSK-3β活性升高和Tau過度磷酸化的關(guān)鍵因素。見表4。

3 討論

腦內(nèi)胰島素功能復雜，其水平異常是促使記憶障礙發(fā)生的重要原因[8-12]。2型糖尿病是引發(fā)癡呆的重要因子之一，其可能的發(fā)病機制為大腦皮質(zhì)及海馬中存在PI-3K活性的降低、GSK-3β活性增高和Tau蛋白的過度磷酸化[8]，即胰島素抵抗產(chǎn)生的信號傳導障礙[9]。胰島素信號系統(tǒng)功能低下時，會導致下游途徑中磷脂酰肌醇-3激酶（PI-3K）下降，從而導致Tau蛋白磷酸化的主要糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）活性增高[13-14]。因此，研究不同的胰島素水平對PI-3K活性以及Tau蛋白過度磷酸化程度的影響，從分子水平上解釋糖尿病與記憶障礙的關(guān)系及致病機制，并在組織細胞凋亡的同時預防和延緩神經(jīng)細胞的退行性變方面都具有重要的意義[15]。

在臨床上，張發(fā)榮教授以腦為軸心的“胰（脾）-腦-腎軸”的消渴呆病病機學說為基礎(chǔ)，廣泛運用補腎醒腦法治療老年性癡呆（包括血管性癡呆），取得較好療效[16]?！鹅`樞·海論》云：“腦為髓之海，諸髓皆屬于腦”。腎主藏精，為先天之本，是腦髓生成的物質(zhì)基礎(chǔ)，故有“腎生腦”之說。消渴日久，陰虛燥熱，灼精耗液，脾腎虧耗，損及腦髓。在消渴呆病的發(fā)病環(huán)節(jié)中，根源為腦髓空虛，本質(zhì)是腎精虧虛，始動因子為胰（脾）。治療以補腎醒腦為根本大法，在控制血糖的基礎(chǔ)上，以阻止智能衰減為最終目標，在《備急千金要方》所載開心散及張錫純《醫(yī)學衷中參西錄》所載滋脺飲的基礎(chǔ)上，結(jié)合多年臨床實踐，形成了醒腦益智劑。

在臨床觀察研究的基礎(chǔ)上，研究在胰島素抵抗狀態(tài)下動物模型的記憶功能及海馬PI-3K、GSK-3β的活性和Tau蛋白過度磷酸化的修飾水平發(fā)現(xiàn)，醒腦益智劑可有效提高2型糖尿病性記憶障礙小鼠的學習、記憶能力，增強大腦皮質(zhì)及海馬組織中PI-3K表達，降低GSK-3β活性，糾正Tau蛋白的過度磷酸化，改善大腦組織中胰島素信號傳導通路，這也為祖國醫(yī)學進一步防治糖尿病性記憶障礙提供了理論依據(jù)。

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