龍眼肉不同提取物的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制

倪雪嬌 陳曉霞 宋婷 賈思禹 李紅艷

【摘 要】 目的：探討龍眼肉的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制。方法：采用Aβ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷，用龍眼肉不同提取物作用于損傷的PC12細(xì)胞，Elisa試劑盒檢測SOD、MDA水平，MTT檢測細(xì)胞增殖；采用H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷，Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果：龍眼肉水提取物和正丁醇提取物能提高Aβ誘導(dǎo)損傷的細(xì)胞存活和SOD活力，抑制H2O2誘導(dǎo)損傷的早期細(xì)胞凋亡，對(duì)MDA含量無明顯影響；乙酸乙酯提取物可減少H2O2誘導(dǎo)損傷的各期細(xì)胞凋亡及壞死，但對(duì)Aβ誘導(dǎo)損傷的細(xì)胞存活以及SOD活力和MDA含量無明顯影響。結(jié)論：龍眼肉具有神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用，但不同提取物作用機(jī)制可能不同。

【關(guān)鍵詞】 龍眼肉；神經(jīng)保護(hù)；抗氧化；凋亡

【中圖分類號(hào)】R285 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2018）11-0019-03

Abstract：Objective To explore the neuroprotective effect and mechanism of longan meat. Methods Using Aβ to induce PC12 cell injury， with different extracts of longan meat on the injured PC12 cells， Elisa kit to detect SOD、 MDA levels， MTT assay for cell proliferation； H2O2 induced PC12 cell injury， detection of Apoptosis by Annexin V-FITC / PI Double Staining. Results Longan meat extract and n-butanol extract can improve the cell viability and SOD activity， inhibition of early apoptosis， and no significant effect on MDA content induced by Aβ； Ethyl acetate extract can reduce cell apoptosis and necrosis induced by H2O2， but no significant effect on cell viability， SOD activity and MDA content induced by Aβ. Conclusion Longan meat extract has a neuroprotective effect， but the mechanisms of different extraction may be different.

Keywords：Longan Meat； Neuroprotective； Anti-Oxidation； Apoptosis

龍眼肉為無患子科植物龍眼Dimocarpus longan Lour. 的假種皮，屬藥食同源類中藥，具有補(bǔ)益心脾，養(yǎng)血安神之功效；臨床用于氣血不足，健忘失眠等癥[1]?，F(xiàn)代研究表明，龍眼肉具有改善記憶[2]、抗焦慮[3]、抗氧化[4-5]等多種作用，據(jù)報(bào)道，氧化應(yīng)激很可能是記憶減退、焦慮證等的一個(gè)共同誘因[6-7]。PC12 細(xì)胞來源于大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤，因其具有許多神經(jīng)元特性，被廣泛用于老年癡呆、焦慮證等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的體外研究[8]?；邶堁廴獾纳鲜鲎饔?，作者推測，龍眼肉很可能具有神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用；課題組前期研究也表明，龍眼肉提取物能夠促進(jìn)PC12細(xì)胞增殖并抑制其凋亡[9]，但對(duì)不同提取物的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制的比較研究前期未做報(bào)道。本研究通過比較龍眼肉不同提取物對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡及氧化應(yīng)激的影響，探討龍眼肉不同提取物的神經(jīng)保護(hù)作用，為系統(tǒng)研究龍眼肉神經(jīng)保護(hù)作用的物質(zhì)基礎(chǔ)及機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 龍眼肉，安徽益生源中藥飲片科技有限公司（批號(hào)160301）；高分化PC12細(xì)胞，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室提供；DMEM高糖培養(yǎng)基（批號(hào)8116244），Gibco；胰蛋白酶（批號(hào)GP3108）、青鏈霉素雙抗溶液（批號(hào)GA3502）、Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒（批號(hào)113688），Genview；胎牛血清（批號(hào)：20160629），四季青；MTT（批號(hào)M8180），北京Solaibio；Aβ25-35（批號(hào)095M4774V），Sigma；SOD（批號(hào)DZE30169）、MDA（批號(hào)DZE30157） Elisa試劑盒，南京建成；NU-4750型二氧化碳培養(yǎng)箱，Nuaire；RE-52 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮；NIB-100F型倒置熒光顯微鏡，寧波永新；MR-96A型酶標(biāo)儀，深圳邁瑞；NoVocyte 451141112066流式細(xì)胞儀，艾森生物。

1.2 方法

1.2.1 龍眼肉不同提取物的制備 龍眼肉，用1∶12（m∶v）的去離子水微沸提取1 h，提取3次，合并濾液，按極性大小，依次采用乙酸乙酯和正丁醇萃取，收集合并各次濾液，分別得到龍眼肉的乙酸乙酯、正丁醇和水提取物，60 ℃減壓濃縮，4 ℃密封保存。

1.2.2 MTT實(shí)驗(yàn)及SOD、MDA水平測定 對(duì)數(shù)生長期的PC12細(xì)胞以105/mL密度，接種于96孔板，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，隨機(jī)分為正常組、模型組和龍眼肉提取物高低劑量組及石杉?jí)A甲組，于加入Aβ前2 h加入；模型組與給藥組同步加入Aβ25μM；正常組常規(guī)培養(yǎng)。加入Aβ24 h后，吸出各組細(xì)胞上清液，采用Elisa試劑盒檢測SOD活性及MDA含量；細(xì)胞中加入5 mg/mL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h，加入100μL DMSO于酶標(biāo)儀490 nm處測定各孔吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 PC12細(xì)胞接種于6 cm培養(yǎng)皿中，隨機(jī)分為正常組，模型組和龍眼肉提取物組。除正常組常規(guī)培養(yǎng)外，其余各組采用200 μM H2O2處理細(xì)胞8 h，給藥組加入H2O2前先加受試藥物預(yù)處理2 h。經(jīng)H2O2處理12 h后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。每組3個(gè)復(fù)孔。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。組間比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 龍眼肉不同提取物對(duì)細(xì)胞增殖的影響 MTT法檢測結(jié)果（圖1）表明，細(xì)胞存活率模型組較正常組降低（P<0.05），龍眼肉水提取物0.5、1.0 mg/mL和正丁醇提取物1.0 mg/mL組較模型組提高（P<0.01）；正丁醇提取物0.5 mg/mL、乙酸乙酯提取物和陽性對(duì)照石杉?jí)A甲（2 μM），實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)未見神經(jīng)保護(hù)作用（P>0.05）。結(jié)果提示，實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，龍眼肉水提取物促進(jìn)細(xì)胞增殖作用最明顯。

2.2 龍眼肉不同提取物對(duì)SOD、MDA水平的影響 圖2A結(jié)果表明，SOD活力，模型組較正常組SOD降低（P<0.05）；龍眼肉水和正丁醇提取物組較模型組提高（P<0.05，P<0.01）；乙酸乙酯提取物組與模型組比較無差異但有升高趨勢(shì)。圖2B結(jié)果表明，MDA含量模型組較正常組增加但無顯著差異；龍眼肉不同提取物對(duì)MDA含量亦無明顯影響。結(jié)果提示，實(shí)驗(yàn)濃度下，龍眼肉水提取物抗氧化能力最強(qiáng)。

水、正、乙分別代表水、正丁醇和乙酸乙酯提取物；0.5、1.0代表給藥濃度0.5、1.0 mg/mL；石杉代表石杉?jí)A甲 2 μM。

2.3 龍眼肉不同提取物對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

由圖3可見，龍眼肉不同提取物均可使受損細(xì)胞活細(xì)胞數(shù)提高（P<0.01，圖3B）、早期凋亡細(xì)胞減少（P<0.01，P<0.05，圖3C）；對(duì)晚期凋亡及細(xì)胞壞死，僅乙酸乙酯部位有明顯作用。

3 討論

高分化PC12細(xì)胞因具有神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的一般特征，被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究。Aβ和H2O2均具有細(xì)胞毒性，可誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。因Aβ沉積是阿爾茨海默?。ˋD）的主要病理特征之一，氧化應(yīng)激又是導(dǎo)致AD的一個(gè)重要誘因，故Aβ和H2O2常被用于構(gòu)建體外AD細(xì)胞模型。作者前期采用H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷，用龍眼肉不同提取物進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果表明，龍眼肉水、正丁醇及乙酸乙酯提取物對(duì)細(xì)胞存活均有一定的保護(hù)作用，實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，以乙酸乙酯提取物促進(jìn)細(xì)胞增殖作用最明顯，并且其對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有一定抑制作用[9]。但是，不同提取物對(duì)Aβ誘導(dǎo)的體外AD模型是否有保護(hù)作用以及不同提取物對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的比較研究前期均未報(bào)道。本研究采用Aβ和H2O2誘導(dǎo)建立PC12細(xì)胞損傷模型，并探討龍眼肉不同部位的神經(jīng)保護(hù)作用。綜合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果并聯(lián)合前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，作者推測，龍眼肉不同極性部位均有神經(jīng)保護(hù)作用，但作用機(jī)制不完全相同：水和正丁醇提取物主要是提高細(xì)胞抗氧化能力，抑制早期細(xì)胞凋亡；乙酸乙酯提取物主要是抑制細(xì)胞各期凋亡及壞死。

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