基于代謝組學(xué)分析桃膠中酚類化合物含量及抗氧化活性

劉啟月 李勇 陳小龍 余向陽

摘要： 為深入了解桃膠的營養(yǎng)價(jià)值，首先分析了5種不同顏色桃膠提取液中總酚含量及抗氧化活性差異，然后基于高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜（LC-QTOF-MS）和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS）的代謝組學(xué)方法對桃膠提取液中的酚類物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析。結(jié)果表明，不同顏色桃膠提取液中總酚含量和抗氧化活性存在明顯差異，顏色越深總酚含量越多、抗氧化活性越強(qiáng)，顏色最深樣品（S5）中總酚含量為28.23 μmol/g，是顏色最淺樣品組的7.8倍?；贚C-QTOF-MS分析桃膠提取液，共鑒定出32種活性化合物，其中黃酮類化合物有20種;基于LC-MS的靶向代謝組學(xué)方法對18種酚類化合物進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)橙皮素、柚皮素、表兒茶素、圣草酚含量最多。相關(guān)性分析結(jié)果表明，18種酚類化合物中，14種酚類化合物與總酚含量及抗氧化活性呈顯著正相關(guān)關(guān)系。

關(guān)鍵詞： 桃膠;酚類化合物;抗氧化活性;代謝組學(xué)

中圖分類號： TS218 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A 文章編號： 1000-4440（2021）03-0746-08

Analysis on phenolics contents and antioxidant activity in peach gum based on metabolomics

LIU Qi-yue1，2，3， LI Yong2，3， CHEN Xiao-long2，3， YU Xiang-yang1，2，3

（1.College of Food Science and Engineering， Nanjing University of Finance and Economics， Nanjing 210023， China;2.Key Lab of Food Quality and Safety of Jiangsu Province-State Key Laboratory Breeding Base Constructed by Province-Ministry， Nanjing 210014， China;3.Institute of Agricultural Resources and Environment， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China）

Abstract： To better understand the nutritive value of peach gum， total phenol content and antioxidant activity difference in the extracting solution of peach gum presenting five different colors were analyzed firstly. Then the phenolic substances in the extracting solution of peach gum were analyzed qualitatively and quantitatively via metabolomics methods of liquid chromatography-hybrid quadrupole time-of-flight mass spectrometry （LC-QTOF-MS） and liquid chromatograph-mass spectrometer （LC-MS）. The results showed that， total phenol content and antioxidant activity of peach gum extracting solutions with various colors were significantly different， and the deeper the color， the higher the total phenol content was， with stronger antioxidant activity. The total phenol content in the peach gum with the darkest color （S5） was 28.23 μmol/g， which was 7.8 times compared with the lightest color group. 32 active metabolites were identified in the extracting solution of peach gum via LC-QTOF/MS methods， including 20 flavonoid compounds. Quantitative analysis of 18 phenol compounds based on target metabonomics of LC-MS showed that， the contents of hesperetin， naringenin， epicatechin and eriodictyol were relatively high. Correlation analysis showed that， 14 phenolic compounds of 18 phenolic compounds in peach gums showed significant positive correlation with total phenols content and antioxidant activity.

Key words： peach gum;phenolic compounds;antioxidant activity;metabolomics

桃膠為薔薇科植物桃[Prunus persica （L.） Batsch]或山桃[Prunus davidiana （Carr.） Franch]等植物的樹皮受損后分泌出來的半透明無色、淺黃色或黃棕褐色琥珀?duì)罟腆w，初分泌時為透明狀黏液，隨著風(fēng)干日曬，經(jīng)氧化淺層變黑后透明度降低。古籍記載，桃膠味苦、平、無毒，煉服能保中不餓、和血益氣、下石淋、止痛等[1]。桃膠可活血消腫、通淋止痛，臨床運(yùn)用對腹瀉、疼痛、血淋、石淋、痢疾等癥均有效，被《中藥大辭典》收錄[2]。桃膠70%～80%的成分為桃膠多糖，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究結(jié)果表明，桃膠多糖具有良好的體內(nèi)外抗氧化活性[3]，且能提高免疫力、降血糖、降血脂、調(diào)節(jié)胃腸道[4-5]。作為藥食同源的農(nóng)副產(chǎn)品，桃膠除供日常食用外，在功能食品、醫(yī)療美容和醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用也受到越來越多的關(guān)注。

植物中存在的天然產(chǎn)物如多酚、黃酮類化合物及花色苷等物質(zhì)，可以起到保持人體健康、預(yù)防慢性疾病的作用，其中天然黃酮類化合物存在于絕大部分植物中，含有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)，羥基衍生物多具黃色，它在植物的生長、發(fā)育、開花、結(jié)果以及抗菌防病等方面起著重要的作用[6]。桃樹受機(jī)械損傷，如切傷或蟲咬后流出的一般是白色透明桃膠，受病菌感染后則分泌黃色或黃褐色至深紅棕色的膠。推測桃膠中除桃膠多糖外可能含有其他豐富的活性成分，且初始分泌出不同顏色桃膠可能是因?yàn)槠渲泻械狞S酮類物質(zhì)含量差異造成。

目前，對于桃膠的研究以其成分[7-8]及理化性質(zhì)[9-10]為主，成分研究又集中在桃膠多糖的研究，包括多糖提取純化[11-12]及其應(yīng)用[5，13-14]方面。桃膠中酚類化合物及其抗氧化活性方面鮮見相關(guān)研究報(bào)道。有研究者對不同品種、不同產(chǎn)地的桃膠進(jìn)行多糖含量[8]、微量元素[15]等檢測，但對不同顏色桃膠的成分差異未有研究報(bào)道。本研究收集同品種5種不同顏色桃膠，首先分析不同顏色桃膠提取液中總酚含量及抗氧化活性差異，然后基于LC-QTOF-MS和LC-MS的代謝組學(xué)方法對桃膠提取液中酚類物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析，為桃膠在醫(yī)藥保健、美容護(hù)膚等產(chǎn)品的開發(fā)利用提供試驗(yàn)依據(jù)，同時為其作為新資源食品開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桃膠樣品采摘于國家果樹種質(zhì)南京桃資源圃（位于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院內(nèi)）同品系桃樹，2019年6月至8月每周采集主干及主枝桃膠一次，新鮮桃膠采摘后經(jīng)自然晾干后低溫保存。按顏色將桃膠樣品分成5組（圖1），分別為白色透明桃膠組（S1）、淺黃色透明桃膠組（S2）、黃色透明桃膠組（S3）、棕黃色透明桃膠組（S4）、深黃褐色透明桃膠組（S5）。將不同顏色桃膠樣品粉碎后過60目篩，收集桃膠粉末樣品。準(zhǔn)確稱取桃膠樣品粉末100 mg于50 ml具塞試管中，加入20 ml 70%乙醇，60 ℃下超聲波處理1 h，離心取上清液經(jīng)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜過濾后，用于總酚含量、抗氧化活性以及酚類物質(zhì)定性定量分析，每個樣品重復(fù)制備5次。

酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)品芹菜素、金合歡素、圣草酚、金雀異黃酮、金圣草黃素、異櫻花亭、山柰酚、橙皮素、柚皮素、柚皮素-7-O-葡萄糖苷、根皮素、花旗松素、松屬素、表兒茶素、原花青素B1、積雪草酸、綠原酸、對羥基肉桂酸均采購于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司，均為分析純。分別精密稱取18個對照標(biāo)準(zhǔn)品，用色譜級甲醇溶解，配置成20 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。將18種單標(biāo)溶液混合成2 μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，逐級稀釋成1 000 ng/ml、500 ng/ml、200 ng/ml、100 ng/ml、50 ng/ml、20 ng/ml、10 ng/ml、5 ng/ml、2 ng/ml、1ng/ml等質(zhì)量濃度，待用。

植物總酚（TP）含量測定試劑盒（貨號A143-1-1）、總抗氧化能力（T-AOC）測定試劑盒（貨號A015-3-1，F(xiàn)RAP法）、總抗氧化能力（T-AOC）測定試劑盒（貨號A015-3-1，ABTS法）均購買于南京建成生物工程研究所。甲醇（德國Merck公司產(chǎn)品）、乙腈（德國Merck公司產(chǎn)品）、甲酸（美國Fisher公司產(chǎn)品） 均為色譜純。

1.2 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)（KDC-220HR，中國安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品），超聲波恒溫清洗機(jī)（10DT，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品），超純水儀（Direct-Q5 UV，美國Millipore公司產(chǎn)品）。

LC-MS為高效液相色譜（安捷倫1290）串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜（AB SCIEX QTRAP 6500），LC-QTOF-MS為高效液相色譜（安捷倫1260）串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜（AB SCIEX QTOF 5600+）。

1.3 方法

1.3.1 LC-QTOF-MS定性分析桃膠提取液 將不同顏色桃膠提取液混合后進(jìn)行LC-QTOF-MS分析，LC-QTOF-MS的色譜柱為XSelect HSS T3（4.6 mm×150.0 mm，3.5 μm），正電離模式流動相為0.1%甲酸/水（A）和乙腈（B），負(fù)電離模式流動相為0.005 mol/L乙酸銨（A）和乙腈（B）。流動相梯度洗脫程序?yàn)椋?～3.00 min，10% B;3.00～21.00 min，10%～95% B;21.00～28.00 min，95% B;28.00～28.10 min，10% B;28.10～34. 00 min，10% B。

LC-QTOF-MS的質(zhì)譜條件為選擇QTOF-MS全掃描模式和信息相關(guān)分析（IDA），質(zhì)量掃描范圍為m/z 50～1 000，正、負(fù)電離模式的源電壓分別為5 500 V和4 500 V，簾氣、霧化器（gas1）和加熱氣體（gas2）的流動壓力分別為25 psi、50 psi和50 psi。碰撞能量（CE）分別為30 V和-30 V。利用MS-DIAL軟件對LC-QTOF-MS數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，通過分析保留時間、質(zhì)量精度和同位素比值以及與公共數(shù)據(jù)庫（包括MassBank、LipidBlast、GNPS、MetaboBASE）進(jìn)行MS/MS相似性匹配來進(jìn)行化合物鑒定。

1.3.2 LC- MS定量分析桃膠提取液酚類物質(zhì) 基于LC-MS對18種酚類物質(zhì)進(jìn)行定量分析。LC-MS色譜柱為ZORBAX SB-C18色譜柱（2.1 mm×100.0 mm，3.5 μm，美國安捷倫公司產(chǎn)品），流動相A為0.1%甲酸水，流動相B為甲醇，梯度洗脫程序?yàn)椋?～1.00 min，95%～80% A;1.00～4.00 min，80%～25% A;4.00～7.00 min，25%～5% A;7.00～9.00 min，5% A;9.00～9.10 min，5%～95% A;9.10～13.00 min，95% A。柱溫為30 ℃，流速為0.3 ml/min，進(jìn)樣體積為2.0 μl。

質(zhì)譜條件為正負(fù)離子切換模式電噴霧電離，氣簾氣40 psi，離子化電壓5 500 V和4 500 V，霧化溫度400 ℃，霧化氣65 psi，輔助氣60 psi。

2 結(jié)果與分析

2.1 桃膠總酚含量及抗氧化能力分析

不同顏色桃膠總酚含量及抗氧化活性差異明顯，顏色越深，桃膠提取液總酚含量越高、抗氧化活性越強(qiáng)（圖2）。桃膠樣品S1、S2、S3、S4、S5提取液中總酚含量分別是3.60 μmol/g、4.02 μmol/g、6.70 μmol/g、14.40 μmol/g、28.23 μmol/g， S5樣品的總酚含量最高，為S1的7.8倍、S2的7.0倍、S3的4.2倍、S4的2.0倍。桃膠提取液的抗氧化活性變化趨勢與總酚含量變化趨勢一致。S5樣品的抗氧化活性最高，為10.46 μmol/g（ABTS法）和17.00 μmol/g （FRAP法）;S1樣品的抗氧化活性最弱，為2.79 μmol/g （ABTS法）和2.31 μmol/g （FRAP法）。

2.2 桃膠提取液的LC-QTOF-MS定性分析

基于LC-QTOF-MS方法在桃膠提取液中鑒定出32種活性化合物，其中包括兒茶酚/酚酸3種、兒茶素/花色素5種、黃酮類化合物20種、香豆素類2種、五環(huán)三萜酸1種、類氨基酸左旋肉堿1種[16]。表1為32種化合物的定性鑒定結(jié)果，圖3為正負(fù)總離子流色譜圖，表1中的32種化合物峰號與圖3一致。20種黃酮類化合物包括3種黃酮（木犀草素、芹菜素、金圣草黃素）、9種黃烷酮及其苷（圣草酚、圣草酚-7-O-葡萄糖苷、高圣草酚、柚皮素、柚皮素-7-O-葡萄糖苷、橙皮素、異櫻花亭、松屬素、5，7-二羥基-3′，4′-二甲氧基黃烷酮）、2種異黃酮（金雀異黃酮、鷹嘴豆芽素A）、2種黃酮醇（山奈酚、山奈素）、2種二氫黃酮醇（花旗松素、二氫山奈酚）、2種二氫查耳酮（根皮苷、根皮素）。在木質(zhì)部中，天然黃酮類化合物多以苷元形式存在[17]，桃膠由桃樹枝干部位分泌[18-19]，所鑒定出的20種黃酮類化合物也是以17種苷元為主。黃酮類化合物表現(xiàn)出多種多樣的藥理活性，能防治心腦血管系統(tǒng)的疾病和呼吸系統(tǒng)的疾病，具有抗炎抑菌、降血糖、抗氧化、抗輻射、抗腫瘤以及增強(qiáng)免疫能力等藥理作用[20]。其中橙皮素、柚皮素、柚皮苷是蕓香科柑橘屬植物主要藥效成分或代謝成分?；ㄆ焖伤?、圣草酚、高圣草酚、芹菜素、木犀草素、根皮素、根皮苷、山奈酚、山奈素等廣泛存在于蔬菜、水果及中藥中。5，7-二羥基-3′，4′-二甲氧基黃烷酮屬于甲基化黃酮類化合物，甲基化黃酮類化合物是一類重要的天然黃酮類衍生物，具有潛在的多種保健功能，與黃酮類前體相比，它們具有更高的生物利用度，但甲基化黃酮類化合物在植物中含量一般比黃酮苷元和黃酮苷低[21]。

2.3 基于靶向代謝組學(xué)定量分析桃膠提取液中酚類物質(zhì)含量

基于LC-QTOF-MS的定性分析結(jié)果，針對酚類化合物建立基于LC-MS的靶向代謝組學(xué)的定量分析方法。表2為不同顏色桃膠提取液中酚類化合物的定量分析結(jié)果，可以看出，桃膠提取液中不同酚類化合物含量存在顯著差異，S5樣品中18種酚類物質(zhì)的含量分別為：橙皮素100.56 μg/g、柚皮素66.41 μg/g、表兒茶素25.60 μg/g、圣草酚24.66 μg/g、花旗松素8.22 μg/g、原花青素B17.20 μg/g、松屬素6.25 μg/g、積雪草酸3.53 μg/g、柚皮苷3.30 μg/g、異櫻花亭 1.82 μg/g、金圣草黃素0.49 μg/g、綠原酸0.43 μg/g、山奈酚0.38 μg/g、芹菜素 0.35 μg/g、對羥基肉桂酸0.33 μg/g、根皮素0.26 μg/g、木犀草素0.24 μg/g、金雀異黃酮0 μg/g，其中橙皮素、柚皮素、表兒茶素、圣草酚平均含量最多，這4種酚類物質(zhì)可能是桃膠提取液中總酚的重要成分。

同一行數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示具有顯著差異（P<0.05）。ND表示小于定量限或未檢出。

此外，同一物質(zhì)在不同顏色桃膠提取液中含量差異顯著，除金雀異黃酮、綠原酸、積雪草酸及對羥基肉桂酸之外其余14種酚類化合物的含量均隨顏色變深而增加。以含量最多的橙皮素為例，桃膠樣品S1、S2、S3、S4、S5提取液中橙皮素含量分別是6.34 μg/g、10.60 μg/g、32.40 μg/g、65.11 μg/g、100.56 μg/g， S5樣品的橙皮素含量最高是S1的15.9倍、S2的9.5倍、S3的3.1倍、S4的1.5倍，與總酚含量測定結(jié)果一致，說明橙皮素是桃膠提取液中總酚的主要成分。

表3為不同顏色桃膠提取液中酚類化合物含量與總酚含量及抗氧化活性之間的相關(guān)性分析結(jié)果，18種酚類化合物中，除金雀異黃酮、綠原酸、對羥基肉桂酸、積雪草酸等與總酚含量及抗氧化活性無顯著相關(guān)性外，其余14種酚類化合物均與總酚含量及抗氧化活性呈顯著相關(guān)關(guān)系。

3 結(jié)論

本研究對不同顏色桃膠提取液的總酚含量、抗氧化活性進(jìn)行分析，同時采用LC-QTOF-MS及LC-MS的代謝組學(xué)方法對桃膠提取液中的小分子活性成分進(jìn)行定性定量研究。研究發(fā)現(xiàn)，桃膠中含有豐富的酚類物質(zhì)，且隨著顏色的變深其總酚含量及抗氧化活性均增加;基于LC-QTOF-MS對桃膠提取液中活性物質(zhì)進(jìn)行定性分析，共鑒定出32種活性成分，其中黃酮類化合物種類最多有20種;基于LC-MS對18種酚類化合物進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)橙皮素（100.56 μg/g）、柚皮素（66.41 μg/g）、表兒茶素（25.60 μg/g）、圣草酚（24.66 μg/g）含量最高，且大多數(shù)酚類物質(zhì)隨桃膠顏色變深含量變高。本研究對桃膠品質(zhì)進(jìn)行了初步探索，研究結(jié)果為桃膠的進(jìn)一步高值化開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：張震林）