假單胞菌PL-21的鑒定及其拮抗2種蘋果病原菌的作用

路兆軍 于曉麗 苗杰 趙瑩 王淑惠 陳麗英 李保進

關(guān)鍵詞： 假單胞菌;生物防治;蘋果病原菌

中圖分類號： S432.9+ 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-4440（2021）03-0808-04

Identification of Pseudomonas sp. PL-21 and its antagonistic effect on two apple pathogens

LU Zhao-jun1， YU Xiao-li2， MIAO Jie1， ZHAO Ying1， WANG Shu-hui1， CHEN Li-ying1， LI Bao-jin1

（1.Yantai Research Institute of Forestry，Yantai 264013，China;2.Yantai Agricultural Sci & Tech Institute of Shandong Province，Yantai 265500，China）

Key words： Pseudomonas sp.;biological control;apple pathogens

無致病假單胞菌是一類分布廣泛、資源豐富的革蘭氏陰性菌，目前已發(fā)現(xiàn)多種假單胞菌對植物的促生及防病作用明顯，具備開發(fā)成為生防制劑的潛力[1-3]。其生防機制主要包括分泌噬鐵素參與植物根際營養(yǎng)競爭、分泌抗生素類物質(zhì)抑制病原菌生長、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性等[4-6]。蘋果斑點落葉病、蘋果褐斑病分別是由蘋果鏈格孢強毒菌株（Alternaria alternaria f.sp mali）、蘋果盤二孢（Marssonina coronaria Davis）侵染引起的病害，這2種病害因顯病時間長、擴散速度快、危害嚴重等特點逐漸成為蘋果生產(chǎn)上的主要病害[7-9]，病害大流行時，兩者與其他蘋果早期落葉病極易形成復(fù)合侵染，使果樹葉片在8-9月即大量脫落，影響蘋果的產(chǎn)量和經(jīng)濟效益[10-11]。

目前，蘋果斑點落葉病、褐斑病等蘋果主要病害的防治主要依賴于化學(xué)農(nóng)藥，其成本低廉且見效快，但長期重復(fù)使用單一化學(xué)藥劑帶來的病原菌耐藥性、果品農(nóng)藥殘留，危害人體健康及環(huán)境污染等問題日益突出[12]。因此，開發(fā)應(yīng)用高效生防菌劑防治此類病害具有重要意義。本研究以從煙臺市蓬萊區(qū)蘋果根際分離到的1株假單胞菌PL-21為對象，明確其分類地位，分析其對蘋果斑點落葉病病原菌等的抑菌活性及離體防效，為今后相關(guān)病害生防制劑的開發(fā)與應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

假單胞菌PL-21分離自煙臺市蓬萊區(qū)蘋果根際，由煙臺市林業(yè)科學(xué)研究所實驗室保存。蘋果斑點落葉病病原菌（Alternaria alternaria f.sp mali）、蘋果褐斑病病原菌（Marssonina coronaria Davis）、蘋果圓斑病病原菌（Phyllositic solitaria）、蘋果輪斑病病原菌（Alternaria mali Roberts）由本實驗室保存，蘋果輪紋病病原菌（Botryosphaeria dothidea）、蘋果炭疽病病原菌（Colletotrichum gloeosporioides）由煙臺市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供。馬鈴薯胡蘿卜培養(yǎng)基（PCDA）[13]用于病原菌的保存及拮抗菌株抑菌分析;牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基（NB）用于拮抗菌株發(fā)酵、培養(yǎng);牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（NA）用于拮抗菌株培養(yǎng)、保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株P(guān)L-21的鑒定 按照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[14]和《伯杰氏細菌鑒定手冊》[15]的方法對菌株P(guān)L-21進行形態(tài)和生理生化特征鑒定。以PL-21總DNA為模板，用細菌16 S rDNA通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進行PCR擴增并由生工生物工程（上海）股份有限公司完成測序。測序結(jié)果與 NCBI 數(shù)據(jù)庫進行BLAST序列比對，下載同源性較高的相關(guān)菌株基因堿基序列，利用 MEGA軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 菌株P(guān)L-21的抗菌活性分析 采用平板對峙法[16]測定菌株P(guān)L-21對蘋果斑點落葉病病原菌等的拮抗活性，以不接種PL-21的平板作對照，28 ℃恒溫培養(yǎng)5～8 d，3次重復(fù)。采用菌絲生長速率法[17]測定菌株P(guān)L-21無菌發(fā)酵濾液對蘋果斑點落葉病病原菌等的抗菌活性：將菌株P(guān)L-21活化后按2%的體積比接入含100 ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)72 h即得發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)5 000 r/min離心10 min，取上清液用0.22 μm的微孔濾器過濾除菌后得到發(fā)酵濾液。發(fā)酵濾液按1∶50的體積比與50 ℃左右已滅菌的PCDA培養(yǎng)基混勻后倒平板，用6 mm打孔器打取活化好的指示菌菌餅置于平板中央，以未加發(fā)酵濾液的平板為對照，28 ℃恒溫培養(yǎng)5～8 d，3次重復(fù)。抑菌率計算公式：抑菌率（%）=（對照病原菌菌落直徑-處理病原菌菌落直徑）/對照病原菌菌落直徑×100%。

1.2.3 菌株P(guān)L-21發(fā)酵濾液對指示菌孢子萌發(fā)的抑制作用 蘋果斑點落葉病病原菌、蘋果褐斑病病原菌在PCDA平板上培養(yǎng)10 d后，用無菌水沖洗菌落配制成孢子懸液，按1∶1（體積比）分別將100%、60%、20%的發(fā)酵濾液與1 ml 1×104個的2種病原菌孢子懸液混合，使發(fā)酵液終體積分數(shù)為50%、30%、10%，以NB培養(yǎng)液按同樣比例與2種病原菌孢子懸液混合作對照，28 ℃ 培養(yǎng)，6 h、12 h、24 h后鏡檢，芽管長度超過分生孢子小端直徑50%視為萌發(fā)，3次重復(fù)，計算孢子萌發(fā)抑制率[18]。

1.2.4 菌株P(guān)L-21發(fā)酵濾液對指示菌的離體防效 采用平皿葉片法[19]進行菌株P(guān)L-21的離體防效試驗。清洗干凈健康蘋果新葉后用75%酒精浸泡10 s，無菌水沖洗并置于超凈臺晾干，在PL-21發(fā)酵濾液中浸漬1 h，超凈臺內(nèi)晾干，以在NB培養(yǎng)液中浸漬1 h為對照。處理結(jié)束24 h后用手術(shù)刀擦傷蘋果新葉，配制含量為1 ml 1×106個的蘋果斑點落葉病病原菌、蘋果褐斑病病原菌孢子懸液，每個葉片上滴60 μl孢子懸液并涂抹均勻后保濕培養(yǎng)，每個處理20張葉片，3次重復(fù)。10 d后按照病情分級標準進行調(diào)查和統(tǒng)計防效[20]。病情指數(shù)和防治效果公式如下：病情指數(shù)（%）=Σ（本級代表值×本級葉數(shù)）/（最高發(fā)病級代表值×調(diào)查總?cè)~數(shù)）×100%;防治效果（%）=（對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100%

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 利用 SPSS 22.0 軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，采用Duncans新復(fù)極差法進行多重比較及顯著性分析（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株P(guān)L-21的形態(tài)特征

菌株P(guān)L-21在NA平板上生長24 h后，形成近圓形、乳白色至淡黃色菌落，邊緣較為規(guī)則，中央稍隆起，不透明，菌體桿狀，革蘭氏陰性。

2.2 菌株P(guān)L-21的生理生化特征

菌株P(guān)L-21的生理生化試驗結(jié)果表明，該菌為好氧菌，硝酸鹽還原試驗無顏色變化，可液化明膠試管培養(yǎng)基，葡萄糖發(fā)酵反應(yīng)無氣泡產(chǎn)生及顏色變化，淀粉水解反應(yīng)不產(chǎn)生水解圈，在加入 2% 氯化鈉的平板上可正常生長但不能在加入 5%氯化鈉的平板上生長，在牛肉膏蛋白胨瓊脂平板上于4 ℃條件下可緩慢生長。參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》，菌株 PL-21與假單胞菌的特征基本相似。

2.3 菌株P(guān)L-21的16 S rDNA序列分析

PCR 擴增16 S rDNA堿基序列及測序結(jié)果表明，菌株P(guān)L-21的16 S rDNA堿基序列長度為1 435 bp，將該序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號GenBank NO. MT378354。將該序列與 GenBank 數(shù)據(jù)庫收錄的代表菌株的 16 S rDNA堿基序列進行BLAST比對，結(jié)果與假單胞菌屬的幾個種的堿基序列相似度達99%以上。用MEGA5構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株P(guān)L-21與假單胞菌AAS-156（KY810664.1）聚類在一個分支上。結(jié)合形態(tài)觀察、生理生化測定及系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，初步確定菌株P(guān)L-21為假單胞菌 （Pseudomonas sp.）。

2.4 假單胞菌PL-21及其發(fā)酵濾液的抗菌活性

經(jīng)平板對峙法分析假單胞菌PL-21的抗菌活性，結(jié)果表明，PL-21對6種病原菌具有不同程度的拮抗活性，其中對蘋果斑點落葉病病原菌、蘋果圓斑病病原菌、蘋果輪斑病病原菌的抑菌帶寬度分別為2.70 cm、1.72 cm、1.23 cm，對蘋果褐斑病病原菌、蘋果輪紋病病原菌、蘋果炭疽病病原菌的抑菌帶寬度分別為0.87 cm、0.95 cm、0.33 cm。

多數(shù)生防菌在發(fā)酵時可產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物來抑制植物病原菌的生長。菌絲生長速率測定結(jié)果表明，假單胞菌PL-21的發(fā)酵濾液對蘋果斑點落葉病病原菌、蘋果褐斑病病原菌的抑制率較高，分別為59.4%、65.22%，對蘋果輪紋病病原菌、蘋果圓斑病病原菌、蘋果輪斑病病原菌的抑制率次之，對蘋果炭疽病病原菌的抑制率最低，僅為7.46%。

2.5 PL-21發(fā)酵濾液對指示菌孢子萌發(fā)的抑制作用

終體積分數(shù)為50%、30%、10%的PL-21發(fā)酵濾液均可抑制指示菌孢子萌發(fā)，相同的時間內(nèi)抑制率隨體積分數(shù)增大而升高，同體積分數(shù)抑制率隨時間延長而降低，終體積分數(shù)為50%的發(fā)酵濾液24 h時對蘋果斑點落葉病病原菌、蘋果褐斑病病原菌孢子萌發(fā)的抑制率分別為60.6%、71.7%。

2.6 PL-21發(fā)酵濾液對指示菌的離體防效

經(jīng)PL-21發(fā)酵濾液處理后，葉片上蘋果斑點落葉病病斑、蘋果褐斑病病斑呈褐色、邊緣清晰且面積明顯小于對照，葉片仍然呈綠色;對照組葉片病斑逐漸變大后呈褐色或黑褐色且連成片狀，根據(jù)病情分級標準對防效試驗的定量統(tǒng)計結(jié)果顯示，處理組病情指數(shù)明顯降低，分別比對照降低40.37%、50.37%，PL-21發(fā)酵濾液可顯著降低蘋果葉片的發(fā)病程度，離體防效分別為54.50%、63.55%（表1）。

3 討論

本研究通過形態(tài)觀察、生理生化指標測定及16 S rDNA堿基序列分析，初步判定從蘋果根際中分離的PL-21為假單胞菌（Pseudomonas sp.）。假單胞菌作為拮抗微生物已被應(yīng)用于多種植物病害的生物防治[21]，如婁海博等[22]分離的熒光假單胞菌SN15-2對番茄青枯病的防效可達46.58%，董國菊等[23]發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌P-72-10可顯著抑制煙草疫霉菌菌絲生長，且對煙草黑脛病也有良好的控病效果。本研究首次明確了假單胞菌PL-21對6種蘋果病原菌的廣譜拮抗活性，進一步拓寬了假單胞菌的生防應(yīng)用范圍;其發(fā)酵濾液對蘋果斑點落葉病病原菌、蘋果褐斑病病原菌菌絲抑制率分別高達59.40%、65.22%，結(jié)合唐遠江[24]、寧爽[25]的研究結(jié)果分析，可能是PL-21分泌的抗生素、纖維素酶等代謝產(chǎn)物對病原菌生長具有毒力效應(yīng)，隨后的孢子萌發(fā)試驗驗證了這一推測：PL-21發(fā)酵濾液對蘋果斑點落葉病病原菌、蘋果褐斑病病原菌孢子萌發(fā)的抑制作用隨發(fā)酵濾液體積分數(shù)升高而升高，50%發(fā)酵濾液在24 h對2種病原菌孢子萌發(fā)的抑制率分別為60.6%、71.7%。由于生防菌株在實際應(yīng)用中需要克服植物表面諸如濕度、營養(yǎng)、微生物等多種因素才能發(fā)揮效能[20]，本研究測定了PL-21發(fā)酵濾液對蘋果斑點落葉病、蘋果褐斑病的離體葉片防效，結(jié)果分別為54.50%、63.55%，這與拮抗試驗結(jié)果和孢子萌發(fā)試驗結(jié)果具有一致性，進一步驗證了PL-21的生防潛力。

PL-21及其發(fā)酵濾液對蘋果常見病害的廣譜抑菌特性，特別是對蘋果斑點落葉病病原菌、蘋果褐斑病病原菌的高拮抗活性和較好的離體防效，豐富了相關(guān)病害生物防治的微生物資源及技術(shù)儲備。在后續(xù)試驗中，一方面需結(jié)合抗菌物質(zhì)合成基因分析、蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析等手段明確PL-21的抗菌代謝產(chǎn)物類型，另一方面，由于假單胞菌作為一類常見的植物根際促生菌，對植物具有明顯的促生作用[26-28]，還需驗證PL-21的果園防效及其對蘋果的促生效果，為相關(guān)生防制劑的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）