長江中下游麥區(qū)小麥低多酚氧化酶活性種質(zhì)的初步鑒定

蔡瑾 楊繼書 翟文玲 付必勝 張巧鳳 吳紀中

摘要： 選取145份長江中下游麥區(qū)小麥種質(zhì)以及1份美國種質(zhì)和1份意大利種質(zhì)進行籽粒多酚氧化酶 （PPO）活性分析及2個主效基因等位研究。結(jié)果表明長江中下游麥區(qū)種質(zhì)間籽粒PPO活性差異明顯，具有很大的遺傳改良潛力;運用2個PPO活性主效基因的功能標記檢測上述147份種質(zhì)，發(fā)現(xiàn)4種基因型PPO活性均值大小順序為：Ppo-D1aPpo-D1aPpo-A1bPpo-A1b （L1L1L2L2）

關(guān)鍵詞： 小麥;多酚氧化酶活性;種質(zhì)資源

中圖分類號： S512.102.4 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-4440（2021）03-0545-10

Preliminary identification of wheat germplasm with low polyphenol oxidase activity in the wheat region of the middle and lower reaches of Yangtze River valley

CAI Jin， YANG Ji-shu， ZHAI Wen-ling， FU Bi-sheng， ZHANG Qiao-feng， WU Ji-zhong

（Institute of Germplasm Resources and Biotechnology， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China）

Abstract： 145 wheat germplasms of the wheat region in the middle and lower reaches of the Yangtze River， an American germplasm and an Italian germplasm were selected for the analysis of grain polyphenol oxidase （PPO） activity and the study of two allelic variation of major genes. The results showed that， the grain PPO activities between different wheat germplasms of the wheat region in the middle and lower reaches of the Yangtze River varied obviously and had great potential in genetic improvement. After detecting the above 147 germplasms by two functional markers of major genes related to PPO activity， average PPO activities of four genotypes showed the following order： Ppo-D1aPpo-D1aPpo-A1bPpo-A1b （L1L1L2L2）

Key words： wheat;polyphenol oxidase activity;germplasm

小麥面粉及面制品白度是小麥品質(zhì)改良的重要評價指標。在面粉貯藏與面制品加工過程中，褐變現(xiàn)象非常普遍。褐變不僅會降低面粉或面制品的白度，而且會影響其營養(yǎng)價值[1]。小麥籽粒中高含量多酚氧化酶（PPO）是引起面團酶促褐變的主要原因[2]。在有氧條件下，PPO能夠催化酚類底物形成醌，醌在植物體中進一步氧化聚合生成褐色色素，從而導致面團褐變[2-3]。小麥籽粒中PPO活性可以解釋面團色澤穩(wěn)定性的50%～70%[4]。因此，通過遺傳育種途徑降低PPO活性，對提升小麥面粉白度、保障食品安全具有重要意義。

小麥籽粒PPO活性是多基因控制的數(shù)量性狀[5-6]。前人通過對多個不同遺傳群體以及基因表達分析發(fā)現(xiàn)，控制小麥籽粒PPO活性的主效基因位于第2部分同源群染色體上，且2A染色體長臂（2AL）上的Ppo-A1對小麥籽粒PPO活性的影響要大于2D染色體長臂（2DL）上的Ppo-D1[7-12]。同時在其他染色體（例如3B、3D、4B和6B）上也定位到一些微效基因 [8-9，13-16]。國內(nèi)外多位研究者報道了與PPO活性緊密連鎖的分子標記。早在2005年，Raman等[9]利用小麥Chara/WW2449 DH（Double Haploid）群體鑒定出2AL上控制PPO活性的主效QTL的3個SSR標記，Xgwm294、Xwmc170和Xgwm312。Sun等[11]依據(jù)2A上PPO基因的DNA序列設計了STS標記PPO18，其685 bp（Ppo-A1a）擴增條帶對應高PPO活性， 而876 bp（Ppo-A1b）對應低PPO活性，這個標記被認為是檢測Ppo-A1基因的有效標記。He等[17]運用Ppo-D1基因的2個等位變異分別開發(fā)了互補顯性STS標記PPO16和PPO29。王小波等[18]又運用2D上小麥籽粒PPO mRNA序列（AY15506）開發(fā)了功能標記STS01，可以作為PPO16的替代標記。近年來開發(fā)的與小麥籽粒PPO活性相關(guān)的功能標記還有位于2A上的PPO05[19]、 PPO30和PPO33[17]、F4[20]、WPPO-1[21]和PPO8[22]，位于2B上的F8[23]、MG8和MG3[24]，以及位于2D上的PPO43[17]和WPPO-2[21]。其中，Ppo-A1基因的功能性標記PPO18，Ppo-D1基因的功能性標記STS01與PPO16、PPO29可靠、 實用、高效，廣泛應用于小麥分子標記輔助選擇育種。

中國科研人員從本世紀初開始進行低PPO活性小麥種質(zhì)資源的鑒定工作[21，25-27]。中國當前大面積推廣品種的PPO活性普遍偏高，而低PPO活性種質(zhì)嚴重缺乏，因此，低PPO活性種質(zhì)的鑒定是新PPO基因發(fā)掘和低PPO活性小麥育種的前提與關(guān)鍵。目前，國內(nèi)外眾多學者已經(jīng)鑒定出寧麥9號、CA9632、Funo、Lolo等一批低PPO活性的小麥種質(zhì)[13，27-31]。本單位引自美國Idaho州農(nóng)業(yè)試驗站的小麥種質(zhì) IDO580籽粒PPO活性極低，比美國低PPO活性品種IDO377s、Lolo 以及Jefferson 低50%以上[32-33]。但是，前人對低PPO活性種質(zhì)資源的篩選工作大多針對中國北方麥區(qū)或全國多個麥區(qū)的比較。本研究致力于對長江中下游麥區(qū)種質(zhì)資源進行篩選，進一步發(fā)掘長江中下游麥區(qū)的低PPO活性小麥種質(zhì)，為該麥區(qū)以及全國低PPO活性小麥育種提供新的親本資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

參試材料共147份，包括長江中下游麥區(qū)各地收集的小麥種質(zhì)145份以及1份美國種質(zhì)和1份意大利種質(zhì)（表1），由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究所種質(zhì)資源評價與創(chuàng)新研究室保存與提供。

1.2 田間種植

147份參試材料種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學院六合試驗基地，播種時間為2019年10月25日。每個材料種植5行，點播，行距0.25 m，行長2 m，每行均勻播種40粒，出苗后保證每行密度相同，田間管理同大田。

1.3 DNA提取及功能標記檢測

基因組DNA的提取參照Saghai-Maroof等[34]的CTAB提取法。采用中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所開發(fā)的Ppo-A1基因功能性標記PPO18[11]、Ppo-D1基因功能標記PPO16[17]和安徽農(nóng)業(yè)大學開發(fā)的Ppo-D1基因功能性標記STS01[18]標記序列及擴增條件。所有引物由上海生物工程技術(shù)服務有限公司合成。

1.4 小麥籽粒PPO活性檢測

采用多巴（L-DOPA/MOPS）為底物， PPO催化L-DOPA形成醌類物質(zhì)，進而引起褐變。活性測定按照Anderson等[14]的方法，并略作修改。反應底物為現(xiàn)配的10 mmol/L L-DOPA （L-3，4-Dihydroxyphenylalanine， Sigma-Aldrich Co.）與50 mmol/L MOPS[3-（N-morpholino） propanesulfonic acid， Sigma- Aldrich Co.]緩沖液（pH6.5）。對每份材料設8個重復和1個空白對照，選取無破損、無病害的籽粒，稱質(zhì)量后放入酶標板中，每孔加入上述反應底物15 μl。在37 ℃條件下勻速振蕩60 min后（100 r/min），在EPOCH微孔板分光光度計（BioTek Instruments， Winooski， VT， USA）475 nm處讀取其吸光值。PPO活性值為△A/（60×m×10-3），其中 △A為樣品吸光值與空白吸光值的差值，60為反應時間60 min，m表示單粒種子的質(zhì)量（g）。數(shù)據(jù)處理及分析采用Excel和SAS9.2軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥種質(zhì)間PPO活性的變異

參照Anderson等[14]方法對145份長江中下游麥區(qū)種質(zhì)以及1份美國種質(zhì)和1份意大利種質(zhì)籽粒PPO活性進行了檢測。結(jié)果表明，上述材料的籽粒PPO活性分布廣泛（表1、圖1），變幅在4.56 U到208.98 U之間，平均PPO活性為84.23 U，最高、最低PPO活性相差45.8倍，高于平均數(shù)的種質(zhì)68份，低于平均數(shù)的種質(zhì)79份，總體呈正態(tài)分布，峰值略偏向低PPO活性端。方差分析結(jié)果表明PPO活性在種質(zhì)間的差異極顯著（P<0.000 1），而各個種質(zhì)重復之間的差異不顯著（表2），說明該147份參試材料PPO活性的表型變異較為明顯，而各種質(zhì)重復之間的一致性較好。

基因型中L1表示Ppo-D1a等位基因，H1表示Ppo-D1b等位基因，L2表示Ppo-A1b等位基因，H2表示Ppo-A1a等位基因。鄂麥6號、華1151、蘇夫、農(nóng)豐125、蘇麥198、揚輻麥2049、揚輻麥2330、望水白、矮蘇麥3號、華麥9026、光明麥1319、劍子麥、白蒲（落青）13份材料未擴增出任何條帶，表明這些材料可能為Ppo-D1a、Ppo-D1b、Ppo-A1b、Ppo-A1a以外的其他等位變異類型。

上述147份小麥種質(zhì)的籽粒PPO活性差異很大，說明品種具有很大的改良潛力。種質(zhì)籽粒PPO活性整體上呈正態(tài)分布，根據(jù)PPO活性平均值和標準方差（s）將147份小麥材料分為5組。以平均值84.23 U為界，PPO活性小于17.88 U（-3s）的只有1份，為極低PPO活性種質(zhì);PPO活性為17.88～51.05 U（-2s）的有18份，為低PPO活性種質(zhì)（表3）。PPO活性為51.06～117.40 U（-1s～+1s）的有108份，為中等PPO活性種質(zhì);PPO活性為117.41～183.74 U（+2s～+3s）的有18份，為高PPO活性材料;PPO活性高于183.74 U（+4s）的種質(zhì)有2份，為極高PPO活性種質(zhì)（表3）。

2.2 PPO基因分子標記檢測結(jié)果與等位基因分析

利用Ppo-A1基因的功能標記PPO18[11]和Ppo-D1基因的功能性標記STS01[18]、PPO16 [17]對147份種質(zhì)進行基因檢測。其中，STS01（圖2b）與PPO16（圖2c）互為替代，為顯性標記。STS01與PPO16標記分別在560 bp和713 bp處擴增出一條低PPO活性條帶的為Ppo-D1a等位基因，而無條帶擴增的則為Ppo-D1b等位基因，分別以L1和H1表示;PPO18（圖2a）為共顯性標記，分別擴增Ppo-A1基因的Ppo-A1b（876 bp）和Ppo-A1a（685 bp）2種等位基因，分別以L2和H2表示。攜L1等位基因的種質(zhì)64份，平均PPO活性為72.83 U，攜H1等位基因的種質(zhì)70份，平均PPO活性為96.14 U，方差分析結(jié)果表明2種類型間差異顯著（P<0.05）（圖3a）。分別攜L2和H2等位基因的種質(zhì)為73和61份，平均PPO活性分別為69.02 U和104.13 U，方差分析結(jié)果表明二者差異顯著（P<0.05）（圖3a）。共13份材料未擴增出任何條帶，即未含Ppo-D1a、Ppo-D1b、Ppo-A1b、Ppo-A1a等位基因。

通過基因標記對上述小麥種質(zhì)進行檢測，共出現(xiàn)L1L1L2L2、L1L1H2H2、H1H1L2L2、H1H1H2H2 4種基因型。計算不同基因型的PPO活性均值并進行多重比較，結(jié)果（表4、圖3b）表明，不同基因型種質(zhì)PPO活性均值的高低順序為：L1L1L2L2

2.3 小麥種質(zhì)等位基因的地區(qū)分布

對147份小麥種質(zhì)進行了等位基因地區(qū)分布分析，種質(zhì)分別來自湖北、湖南、江蘇、上海、浙江、河南和安徽7個省（市），2份種質(zhì)分別引自美國和意大利。因上海、河南2?。ㄊ校┮约懊绹鸵獯罄髯缘臉颖玖枯^少（<5份），本研究不進行比較分析。在Ppo-D1和Ppo-A1位點上控制低PPO活性的等位基因L1和L2，在供試種質(zhì)中出現(xiàn)的平均頻率分別為43.54%和49.66%，后者比前者高6.12個百分點。其中，L1等位基因的頻率低于相對應控制高PPO活性的H1等位基因頻率，而L2等位基因的頻率高于H2等位基因。

在Ppo-D1和Ppo-A1位點的4種基因型中，L1L1L2L2的PPO活性最低，該基因型在湖北、湖南、江蘇、浙江和安徽5個省份的參試材料中平均出現(xiàn)頻率為26.19%，略高于4種基因型類型的平均值25.00%，其中，湖南省和浙江省的頻率最高，為33.33%，其次是江蘇省26.09%，而湖北省最低，為18.18%（表5）。

2.4 小麥低PPO活性種質(zhì)資源篩選

在147份種質(zhì)材料中，極低PPO活性種質(zhì)IDO580的基因型檢測為L1L1L2L2型，低PPO活性品種寧麥資69、阿夫、寧麥9號、揚輻麥2054、寧麥13、農(nóng)豐88、鄂麥16、鄂恩1號和鎮(zhèn)麥8號等基因型為L1L1L2L2，極高PPO活性品系鐵稈麥選系和高山麥選系以及高PPO活性品種華麥2668、揚麥16、揚麥23、光明麥1307、中農(nóng)28和華東3號等基因型為H1H1H2H2。上述材料，尤其是一些大面積推廣的小麥品種PPO活性差異很大，變異范圍廣，表明這些品種的改良潛力很大，通過育種途徑改善面粉及面制品的顏色褐變現(xiàn)象是可行的。例如，系譜中含有低PPO活性種質(zhì)寧麥9號的小麥品種寧麥13、寧麥16、揚輻麥4號、揚輻麥2166、鎮(zhèn)麥6號和寧麥資66等的PPO活性都相對比較低。系譜中含有極低PPO活性種質(zhì)IDO580的小麥創(chuàng)新種質(zhì)寧麥資69的PPO活性也極低。本研究篩選出IDO580、寧麥資69、阿夫、寧麥9號、揚輻麥2054、寧麥13和農(nóng)豐88等13份L1L1L2L2基因型種質(zhì)， PPO活性低于51.05 U，可以為小麥品質(zhì)育種提供一批低PPO活性材料（表6）。

3 討論

本研究通過對長江中下游麥區(qū)種質(zhì)的PPO活性分析發(fā)現(xiàn)，當前該麥區(qū)生產(chǎn)應用的品種PPO活性差異極大，不同PPO活性的種質(zhì)頻次分布呈正態(tài)分布，峰值略傾向低PPO活性一端。然而當前大面積推廣小麥品種，如鎮(zhèn)麥9號、揚麥13、揚麥21、揚麥158、鄂麥9和鄂麥11等品種的PPO活性較高（>100 U），揚麥16和揚麥23等品種的PPO活性則高達150 U以上，說明中國長江中下游麥區(qū)當前大面積推廣品種的PPO活性普遍偏高，急需導入低PPO活性基因，進行小麥面粉白度品質(zhì)的遺傳改良。前人報道的低PPO活性品種寧麥9號、阿夫和江東門等均為長江中下游麥區(qū)的種質(zhì)。本研究中鑒定出的寧麥13、寧麥16、揚輻麥4號、鎮(zhèn)麥6號、揚輻麥2166和寧麥資66的PPO活性相對較低或中等偏低，它們的系譜中都含有寧麥9號，而寧麥資69的系譜中含有引自美國的極低PPO活性種質(zhì)IDO580，它的PPO活性僅為23.67 U。說明種質(zhì)資源在新品種選育中非常重要。同時也說明有意識地利用低PPO活性種質(zhì)可以降低小麥籽粒的PPO活性。目前，國內(nèi)鑒定出的低PPO活性種質(zhì)與國外引進的低PPO活性種質(zhì)IDO580相比，其PPO活性普遍要高出8～9倍，因此在小麥低多酚氧化酶活性的遺傳改良上，IDO580可能會有更好地利用前景。

本研究運用Ppo-A1與Ppo-D1基因的功能標記對145份長江中下游麥區(qū)小麥種質(zhì)以及1份美國種質(zhì)和1份意大利種質(zhì)進行檢測。結(jié)果表明： 攜等位基因H1和L1種質(zhì)PPO活性具有極顯著的差異（P<0.000 1），攜等位基因H2和L2種質(zhì)PPO活性也存在極顯著差異（P<0.000 1）。但是，攜等位基因Ppo-A1b（L2）平均PPO活性（69.02 U）要低于攜等位基因Ppo-D1a（L1）種質(zhì)平均PPO活性（72.83 U）。因此，Ppo-A1和Ppo-D1這2個控制小麥PPO活性的主效基因中，Ppo-A1基因?qū)π←溩蚜PO活性的影響要大于Ppo-D1基因，此結(jié)果也印證了前人對Ppo-A1和Ppo-D1這2個基因的研究結(jié)果[7-12]。然而，L1L1L2L2基因型小麥種質(zhì)的平均PPO活性雖然低至55.66 U，但是變幅較大（4.56～113.01 U），其中，IDO580的PPO活性僅為4.56 U，而湘1629和蘇麥3號2個品種的PPO活性接近或高于100 U。相同基因型品種間PPO活性差異仍然較大，說明可能還存在其他影響小麥籽粒PPO活性的基因，因此仍需進一步發(fā)掘影響小麥PPO活性的新基因，并明確這些基因?qū)π←溩蚜PO活性的影響。本研究中發(fā)現(xiàn)的極低PPO活性的品種就是引自美國的IDO580，該品種的Ppo-A1基因的等位基因為L2，用STS01標記檢測為無條帶Ppo-D1基因的等位基因為Ppo-D1b（H1），然而，用PPO16標記檢測結(jié)果為等位基因Ppo-D1a（L1）。因此，STS01標記與PPO16標記的檢測結(jié)果并不完全一致，以這2個標記相互替換能夠更加準確地檢測Ppo-D1的等位基因。此外，IDO580的PPO活性極低，只有公認的低PPO活性種質(zhì)寧麥9號PPO活性的1/9，說明該種質(zhì)可能存在其他未經(jīng)報道的主效基因或等位變異，值得進一步研究。

通過對PPO活性基因等位基因的檢測，發(fā)現(xiàn)等位基因頻率在不同省份間的差異較大。低PPO活性等位基因Ppo-D1a（L1）和Ppo-A1b（L2）出現(xiàn)的頻率范圍均為33.33%～60.00%，L1、L2同時出現(xiàn)的頻率范圍為18.18%～33.33%。因此，在培育低PPO活性小麥品種（系）中，不同省份在選育策略上應該因地制宜。其中，安徽省品種中低PPO活性基因Ppo-D1a（L1）出現(xiàn)的頻率最高（60.00%），其次是江蘇省品種中Ppo-D1a（L1），頻率為46.74%，比陳泠等[31]的報道低，而江蘇省品種中低PPO活性基因Ppo-A1b（L2）出現(xiàn)的頻率最高（54.35%），與陳泠等[31]的報道較為一致。長江中下游麥區(qū)當前大面積推廣品種中L1L1L2L2基因型的比例仍然較低，PPO活性普遍偏高。在L1L1L2L2基因型的品種中，湖北省的分布頻率最低（18.18%），其平均PPO活性高達94.57 U，說明該地區(qū)小麥品質(zhì)改良尤其應加強對低PPO活性的選育。湖南、江蘇和浙江3省的L1L1L2L2基因型頻率高于湖北省，其平均PPO活性也相對較低，分別為83.37 U、82.57 U和80.41 U，說明長江中下游麥區(qū)應進一步挖掘新的籽粒低PPO活性基因，并加速這些基因的聚合，從而增強長江中下游麥區(qū)品種的白度品質(zhì)。

雖然中國在本世紀初已經(jīng)開始了小麥籽粒低PPO活性種質(zhì)資源的篩選工作，但是，目前篩選的種質(zhì)在小麥白度品質(zhì)育種中仍然不足。本研究通過對長江中下游麥區(qū)145份小麥種質(zhì)以及1份美國種質(zhì)和1份意大利種質(zhì)進行PPO活性與功能標記檢測，初步篩選出了IDO580、寧麥資69、揚輻麥2054、寧麥13和農(nóng)豐88等13份低PPO活性種質(zhì)，其中，從美國引進的IDO580的PPO活性極低，豐富了國內(nèi)低多酚氧化酶活性種質(zhì)資源。

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（責任編輯：張震林）