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    基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討禾腎丸治療腎病綜合征蛋白尿的作用機(jī)制*

    2021-07-23 11:02:34張偉寧周陽揚(yáng)胡爽劉艷楊何澤云
    河南中醫(yī) 2021年7期
    關(guān)鍵詞:沙苑子網(wǎng)絡(luò)圖大棗

    張偉寧,周陽揚(yáng),胡爽,劉艷楊,何澤云

    1.湖南中醫(yī)藥大學(xué),湖南 長沙 410000;2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,湖南 長沙 410000

    腎病綜合征(nephrotic syndrome,NS)是以高蛋白尿、低蛋白血癥、高脂血癥和不同程度的水腫為主要表現(xiàn)的臨床綜合征[1]。蛋白尿是NS患者的初始病因,是其進(jìn)展為慢性腎功能不全的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2]。因此,降低尿蛋白是NS患者治療的目標(biāo)之一。

    中醫(yī)學(xué)無NS的記載,根據(jù)其癥狀,在疾病的不同階段可歸屬為“水腫”“虛勞”“尿濁”等范疇。禾腎丸是何澤云教授根據(jù)蛋白尿?qū)倨⒛I虧虛、精微下泄的基本病機(jī),由清代名方金鎖固精丸加減化裁而來,蓮子易蓮須取其健脾固腎之功,加山藥取治虛勞之薯蕷丸意,通補(bǔ)肺脾腎三焦,加大棗顧護(hù)中焦胃氣,稍佐黃柏瀉相火、清濕熱,使全方補(bǔ)而不滯。其由沙苑子、山藥、牡蠣(醋炙)、龍骨(醋炙)、蓮子、芡實(shí)、大棗、黃柏組成,是何澤云教授臨證30余年治療各種腎小球性蛋白尿的經(jīng)驗(yàn)方。前期臨床研究證明,禾腎丸可減少24 h尿蛋白量,升高血漿白蛋白,糾正脂代謝紊亂,改善NS患者臨床癥狀[3-6]。此外,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明,禾腎丸能減少大鼠24 h尿蛋白排泄,保護(hù)受損的足細(xì)胞,減輕腎組織纖維化[7-10]??梢?,禾腎丸可明顯降低蛋白尿,延緩病情,但其作用機(jī)制仍未完全清楚。

    本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究禾腎丸治療NS蛋白尿的藥理機(jī)制和分子作用靶點(diǎn),旨在深入探討禾腎丸減輕NS蛋白尿的作用機(jī)理,為其臨床及科研提供更充分的理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 禾腎丸化學(xué)成分研究使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)數(shù)據(jù)庫(TCMSP,http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)[11]和BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)[12],分別以“沙苑子(SHA YUAN ZI)”“山藥(SHAN YAO)”“牡蠣(MU LI)”“龍骨(LONG GU)”“蓮子(LIAN ZI)”“芡實(shí)(QIAN SHI)”“大棗(DA ZAO)”和“黃柏(HUANG BAI)”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索,獲取其主要化學(xué)成分。

    1.2 禾腎丸活性化合物篩選及靶點(diǎn)研究口服利用度(oral availability,OB)是藥物在體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄的重要參數(shù)之一;類藥性(druglikeness,DL)表示與已知化合藥相比成分的相似性。中藥相關(guān)化合物是否具備較高的活性取決于OB值和DL值,值越高,表明中藥相關(guān)化合物具備更高的活性[13-14]。本研究通過查閱現(xiàn)有相關(guān)研究文獻(xiàn),選取OB≥30%、DL≥0.18作為活性化合物的篩選閥值,獲取相關(guān)活性化合物的靶點(diǎn)蛋白。

    1.3 NS和蛋白尿靶點(diǎn)研究通過Genecards(https://www.genecards.org/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)、OMIM(https://omim.org/)、Drugbank(https://www.drugbank.ca/)、Digsee(http://210.107.182.61/geneSearch/)等疾病數(shù)據(jù)庫檢索與NS和蛋白尿相關(guān)的基因。以“nephrotic syndrome”和“proteinuria”為關(guān)鍵詞在上述疾病數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索,下載或?qū)С雠cNS和蛋白尿有關(guān)的全部基因。

    1.4 靶點(diǎn)蛋白基因名標(biāo)準(zhǔn)化及禾腎丸治病靶點(diǎn)研究為了便于后續(xù)分析及確定靶點(diǎn)蛋白的標(biāo)準(zhǔn)化簡寫,使用PubMed(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)和UniProt(https://www.uniprot.org)對(duì)禾腎丸活性化合物靶點(diǎn)、NS靶點(diǎn)和蛋白尿靶點(diǎn)進(jìn)行校正及標(biāo)準(zhǔn)化。通過Venn 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)將標(biāo)準(zhǔn)化的禾腎丸活性化合物靶點(diǎn)、NS靶點(diǎn)和蛋白尿靶點(diǎn)進(jìn)行整合,取交集得到三者共同靶點(diǎn)(簡稱禾腎丸治病靶點(diǎn))。

    1.5 禾腎丸-活性化合物-治病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建為了解禾腎丸中單味中藥的活性化合物和治病靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的重要性,本研究采用Cytoscape 3.2.1軟件構(gòu)建禾腎丸-活性化合物-治病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

    1.6 蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction network,PPI)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建使用STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/),設(shè)置條件“minimum required interaction score=0.9”和“hide disconnected nodes in the network”,并運(yùn)用Cytoscape 3.2.1軟件構(gòu)建禾腎丸治病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖。探究禾腎丸治療NS蛋白尿的主要作用靶點(diǎn)。

    1.7 GO富集和KEGG通路富集分析為探究禾腎丸治療NS蛋白尿在生物學(xué)角度的科學(xué)內(nèi)涵,本研究將“1.6”中靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入David v 6.8數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/),限定物種和背景均為“Homo sapiens”。

    2 結(jié)果

    2.1 禾腎丸候選化合物的篩選通過TCMSP和Batman-TCM數(shù)據(jù)庫收集禾腎丸中藥物的化學(xué)成分,分別為沙苑子8個(gè)、山藥12個(gè)、牡蠣4個(gè)、龍骨2個(gè)、蓮子4個(gè)、芡實(shí)1個(gè)、大棗18個(gè)、黃柏44個(gè),共74個(gè)活性化合物。

    2.2 禾腎丸活性化合物、NS、蛋白尿靶點(diǎn)和禾腎丸治病靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果經(jīng)過PubMed和Uniprot校正所有靶點(diǎn)名稱,沙苑子、山藥、牡蠣、龍骨、蓮子、芡實(shí)、大棗和黃柏潛在靶點(diǎn)個(gè)數(shù)分別為166、59、334、472、35、21、179、92(不包含重復(fù)靶點(diǎn))。應(yīng)用Genecards、TTD、OMIM(https://omim.org/)、Drugbank、Digsee等疾病數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索并整合,分別得到NS和蛋白尿靶點(diǎn)基因分別為1 179個(gè)和3 354個(gè)。用Venn 2.1軟件將禾腎丸活性化學(xué)成分靶點(diǎn)與NS作用靶點(diǎn)及蛋白尿作用靶點(diǎn)進(jìn)行整合,得到禾腎丸治病靶點(diǎn)共112個(gè),見圖1。

    圖1 禾腎丸治病靶點(diǎn)

    2.3 禾腎丸-活性化合物-治病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建通過Cytoscape 3.2.1軟件構(gòu)建禾腎丸-活性化合物-治病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖,該網(wǎng)絡(luò)由191個(gè)節(jié)點(diǎn)和538條邊組成,其中紅色代表單味中藥(8個(gè)),深藍(lán)色代表活性化合物(74個(gè)),藍(lán)色代表治病靶點(diǎn)(112個(gè)),見圖2。

    圖2 禾腎丸-活性化合物-治病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

    2.4 禾腎丸治病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)將112個(gè)禾腎丸治病靶點(diǎn)蛋白輸入STRING(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫,得出97個(gè)靶點(diǎn)蛋白,見圖3。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)指標(biāo)度值繪制出排名前30位的相關(guān)蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)的條形圖,見圖4。

    圖3 禾腎丸治病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

    圖4 禾腎丸治病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)條形圖(前30位)

    2.5 GO富集與KEGG通路富集分析對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中的97個(gè)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行GO富集分析,設(shè)定P<0.05。禾腎丸治病靶點(diǎn)在生物過程(biological process,BP)、細(xì)胞組分(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)主要富集在藥物反應(yīng)、細(xì)胞外空間蛋白質(zhì)結(jié)合等方面。結(jié)果表明,禾腎丸治病靶點(diǎn)可能通過上述不同的過程參與了NS的病理和生理過程,見圖5。對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中的97個(gè)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行KEGG通路分析,設(shè)定P<0.05,并去掉無關(guān)通路,如錐蟲病、乙肝、HTLV-I感染等,見圖6。禾腎丸治病靶點(diǎn)主要參與PI3K-Akt信號(hào)通路、MAKP信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路等,表明禾腎丸可能介導(dǎo)上述通路發(fā)揮治療NS作用。

    圖5 禾腎丸治病靶點(diǎn)GO富集結(jié)果可視化(BP、CC、MF僅列出前10位)

    圖6 禾腎丸治病靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

    3 討論

    中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,NS的發(fā)病機(jī)制與素體不足,脾腎虧虛,肺衛(wèi)不固,復(fù)感風(fēng)、濕、瘡毒之邪有關(guān)。風(fēng)濕相搏、衛(wèi)氣郁閉、肺失通調(diào)、脾氣不足、傳輸統(tǒng)攝不利、腎氣虛怯、封藏開闔無權(quán)、則水濕泛溢,精微下泄,發(fā)為水腫、蛋白尿。何澤云教授認(rèn)為,蛋白尿?qū)偃梭w的精微物質(zhì),為脾氣所統(tǒng)攝,腎氣所封藏,若脾腎虧虛,則統(tǒng)攝、封藏?zé)o力,發(fā)為蛋白尿,故蛋白尿形成的核心病機(jī)是脾腎虧虛,而健脾益腎固精則是蛋白尿的根本治法。

    禾腎丸中沙苑子甘、溫,具有補(bǔ)腎助陽、固精縮尿之功,山藥甘、平,可通補(bǔ)肺、脾、腎,又兼澀性,二者共為君藥;龍骨甘、澀、平,有收斂固澀之功,牡蠣咸、微寒,功同龍骨,二者為常用藥對(duì),共具固腎澀精之功;芡實(shí)甘、澀、平,偏于補(bǔ)腎,有健脾化濕、固腎澀精之功,蓮子甘、澀、平,偏于補(bǔ)脾,亦有健脾止瀉、益腎澀精,二者相須為用,共具健脾化濕、補(bǔ)腎澀精之功,其四者共為臣藥;黃柏苦、寒,善瀉相火、清濕熱,為佐藥,與君臣藥配伍,使其補(bǔ)而不滯,且可防相火、濕熱下擾腎精所致精微下泄;大棗甘、溫,具有健脾益氣養(yǎng)血之功,為使藥,脾胃之氣充足則受納運(yùn)化強(qiáng)健,則統(tǒng)攝精微之力增強(qiáng)。全方以健脾益腎固精為主,祛濕清熱為輔,既可固腎精、補(bǔ)脾氣,又可瀉相火、清濕熱、補(bǔ)中有瀉、補(bǔ)而不滯,對(duì)NS屬脾腎虧虛,精微不固,尿蛋白久久不消者療效顯著。

    由“禾腎丸-活性化合物-治病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖”可知,從化合物角度,度值排名前5的化合物分別為quercetin-大棗、沙苑子(槲皮素),aluminum-牡蠣,beta-carotene-大棗、芡實(shí)(β-胡蘿卜素),beta-sitosterol-大棗、沙苑子(β-谷甾醇),kaempferol-沙苑子(山柰酚)。藥理研究表明,槲皮素主要存在于大棗和沙苑子中[15-16];牡蠣中含有鎂、鐵、硅、鋁等多種人體必需的微量元素[17];β-胡蘿卜素是大棗和芡實(shí)的活性成分[18-19];β-谷甾醇是大棗和沙苑子的已知活性成分[20-21];山奈酚是沙苑子主要成分[16],兩者結(jié)果相符,表明上述化合物可能是禾腎丸發(fā)揮治療NS的主要活性成分。此外,在排名前5的化合物中,沙苑子和大棗對(duì)應(yīng)化合物最多,其次是牡蠣和芡實(shí),該結(jié)果與禾腎丸“君臣佐使”大致相符。然而,大棗為使藥,該結(jié)果可能與不同單味中藥所含的成分含量不同有關(guān)。

    從靶點(diǎn)角度,度值排名前5的分別是PTGS2、PTGS1、ADRB1、LYZ、RXRA。PTGS2、PTGS1與腎臟發(fā)生炎癥反應(yīng)有關(guān)[22],PTGS2(即COX-2)在腎臟中主要表達(dá)于致密斑。發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí),COX-2表達(dá)急劇升高。研究表明,COX-2在大鼠及人類腎小球損傷中表達(dá)均上調(diào),選擇性COX-2抑制劑可減輕腎小球炎癥,減輕足細(xì)胞損傷及凋亡,減少尿蛋白漏出[23-28]。既往認(rèn)為,PTGS1(即COX-1)主要維持正常的生理功能。但近年來的研究表明,COX-1與多種炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[29],COX-1可能抑制腎小球腎炎大鼠單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)的產(chǎn)生,減輕腎小球內(nèi)單核細(xì)胞浸潤,緩解腎小球的炎癥[30]。故推測(cè)禾腎丸可能通過抑制COX-2及促進(jìn)COX-1基因或蛋白表達(dá),減少NS患者尿蛋白。

    PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果表明,白細(xì)胞介素(interleukin-6,IL-6)、Akt1、JUN等可能是禾腎丸治療NS的重要靶點(diǎn)群。其中IL-6的度值最大,表明其在禾腎丸治病靶點(diǎn)群中可能占據(jù)主要地位。IL-6是一種可介導(dǎo)多種炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子,可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮表達(dá)黏附分子,導(dǎo)致大量的炎癥細(xì)胞在腎組織中黏附、聚集。研究表明,血漿高水平的IL-6可促進(jìn)腎小球血管內(nèi)皮表面的糖蛋白脫落[31],導(dǎo)致腎小球毛細(xì)血管通透性增強(qiáng)。此外,IL-6可促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞增生和系膜基質(zhì)的生成,這些因素導(dǎo)致腎小球?yàn)V過功能受損,蛋白尿漏出。研究表明,NS患者血清IL-6水平明顯升高,且疾病緩解后又明顯下降[32-34]。表明禾腎丸可能通過降低IL-6的含量,緩解NS患者腎小球炎癥狀態(tài),抑制系膜細(xì)胞增生,緩解病情,該結(jié)果與禾腎丸-活性化合物-治病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖中PTGS2、PTGS1、ADRB1等炎性靶點(diǎn)處于核心地位的一致,表明禾腎丸在調(diào)節(jié)NS患者炎癥方面發(fā)揮重要作用,有待進(jìn)一步研究。

    GO富集分析結(jié)果顯示,禾腎丸治病靶點(diǎn)在BP、CC、MF主要涉及藥物反應(yīng)、細(xì)胞外空間蛋白質(zhì)結(jié)合等方面,表明禾腎丸治病靶點(diǎn)的多系統(tǒng)、多靶點(diǎn)、長期適應(yīng)性調(diào)節(jié)是治療NS可能作用機(jī)制。KEGG通路結(jié)果表明,禾腎丸治病靶點(diǎn)涉及通路包括:PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路等,表明禾腎丸可能通過上述通路發(fā)揮治療作用。PI3K是一種脂類第二信使,與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān),其可激活A(yù)KT發(fā)揮下游生理效應(yīng)[35]。研究表明,激活PI3K/Akt信號(hào)通路是減少腎小球足細(xì)胞凋亡、維持足細(xì)胞形態(tài)和功能完整性的重要途徑[36-37]。類似的研究也表明,在慢性腎臟病進(jìn)程中,激活A(yù)kt2有保護(hù)足細(xì)胞的作用[38]?;诖?,推測(cè)禾腎丸可能通過激活PI3K-Akt及其下游通路的表達(dá),而發(fā)揮對(duì)NS治療的藥理學(xué)作用。

    綜上所述,本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)禾腎丸治療NS的作用機(jī)制進(jìn)行初步理論探討,結(jié)果表明,禾腎丸的主要潛在活性成分及作用靶基因與NS作用通路相關(guān),為深入研究其作用機(jī)制提供了新思路。但由于當(dāng)前數(shù)據(jù)庫信息有限,且并非實(shí)驗(yàn)結(jié)果,缺乏實(shí)驗(yàn)結(jié)果的支持,存在一定的差異性和局限性,但其預(yù)測(cè)結(jié)果可作為今后研究的方向之一,有待進(jìn)一步的深入實(shí)驗(yàn)探討。

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