響應(yīng)面法優(yōu)化秋葵總黃酮的提取工藝

王文婷，馮 凡，韓方凱，張文娟，劉 穎

（宿州學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽 宿州 234000）

秋葵，又稱毛茄、咖啡葵等，不僅可以入藥，還能夠作為蔬菜供人食用。秋葵富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素以及鋅、硒等重要的微量元素，同時(shí)還含有多糖、黃酮等生物活性成分，具有緩解疲勞、延緩衰老、保護(hù)腸胃以及降糖降脂等功效[1-3]。

黃酮類化合物是維持人體健康必不可少的物質(zhì)。由于人自身不能合成，因此，必須從外界攝取才能滿足機(jī)體需要。許多研究表明，生物黃酮具有很好的藥理功效，其中，抗氧化作用尤為突出[4-5]。同時(shí)，黃酮類化合物還能降血糖、改善血液循壞、減少人體膽固醇、抑制炎性生物酶滲出、加快傷口愈合、增加人體免疫力等[6-9]。作為富含黃酮的秋葵，關(guān)于其活性物質(zhì)的研究將越來(lái)越多。所以，采用超聲波輔助法從秋葵中提取總黃酮，然后經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化得到最佳工藝，以期為提高秋葵的綜合應(yīng)用價(jià)值，以及黃酮類化合物活性分析提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秋葵（購(gòu)于超市），蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（合肥博美生物科技有限責(zé)任公司），CH2CH3OH（AR，安徽安特食品股份有限公司），NaNO2、NaOH、Al(NO3)3（AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

臺(tái)式離心機(jī)（M400D，上海邁皋科學(xué)儀器有限公司），粉碎研磨機(jī)（JYS-M01，九陽(yáng)股份有限公司），電子天平（T 系列，上海越平科學(xué)儀器有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE 52-86A，上海亞榮生化儀器廠），電熱鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9245A，上海一恒科學(xué)儀器有限公司），超聲波儀（KQ-500GDV，昆山市超聲儀器有限公司），紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-5300，上海元析儀器有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 秋葵總黃酮的提取

流程：秋葵原料→篩選→清洗→干燥→粉碎→提取→離心→收集上清液[9-11]。

秋葵前處理：選取新鮮無(wú)病蟲害的秋葵，清洗干凈后，置于60 ℃干燥箱中烘干處理，干燥后粉碎、過(guò)篩，收集秋葵粉備用。

樣品總黃酮提取：稱取適量秋葵粉，以一定濃度的乙醇溶液作為提取溶劑，在超聲波功率250 W的條件下進(jìn)行輔助提取，待提取完畢后離心，收集上清液，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用[11]。

1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

單因素試驗(yàn)中，每組5 份秋葵粉，每份準(zhǔn)確稱取1.0 g。在乙醇濃度65%、料液比（g?mL-1）1:15、超聲溫度60 ℃條件下，分別經(jīng)20 min、25 min、30 min、35 min、40 min 提取，探索提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響；在乙醇濃度65%、料液比1:15、提取時(shí)間25 min 條件下，分別于40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃進(jìn)行秋葵中的總黃酮提取，探索超聲溫度對(duì)提取效果的影響；在料液比1:15、提取時(shí)間25 min、超聲溫度60 ℃條件下，分別加入濃度為45%、55%、65%、75%、85%的乙醇，對(duì)秋葵中的總黃酮進(jìn)行提取，探索乙醇濃度對(duì)提取效果的影響；在乙醇濃度65%、提取時(shí)間25 min、超聲溫度60 ℃條件下，分別設(shè)定料液比1:5、1:10、1:15、1:20、1:25，對(duì)秋葵中的總黃酮進(jìn)行提取，探索料液比對(duì)提取效果的影響[10-12]。

1.3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以提取時(shí)間、超聲溫度、乙醇濃度、料液比為考察因素，借助響應(yīng)面法優(yōu)化秋葵總黃酮提取工藝。

試驗(yàn)因素與水平如表1 所示。

表1 試驗(yàn)因素與水平表

1.3.4 秋葵總黃酮提取率計(jì)算

以60%乙醇溶液為溶劑，配制0.5 mg?mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。取6 支25 mL 比色管，各加入0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后加入5%的NaNO2溶液0.7 mL，混勻并放置5 min后各加入Al(NO3)3溶液0.7 mL，其濃度為10%，同樣混勻，放置6 min，再各加入5 mL 4%的NaOH溶液，以60%乙醇溶液補(bǔ)充到25 mL，混勻并放置15 min，以0 號(hào)管作對(duì)照，于510 nm 處測(cè)得吸光度值，記錄數(shù)據(jù)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線[10,11]。

準(zhǔn)確移取10 mL 1.3.1 中的上清液，至潔凈的25 mL 比色管中，測(cè)定樣液吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出秋葵總黃酮含量，并按照下式計(jì)算秋葵總黃酮的提取率：

總黃酮提取率/%=提取液中總黃酮含量/秋葵粉質(zhì)量×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 秋葵總黃酮提取效果的單因素影響

2.1.1 提取時(shí)間的影響

由圖1 可以看出，隨提取時(shí)間的增加，秋葵總黃酮提取率先增加后減少，且于25 min 時(shí)提取率達(dá)到最大值。當(dāng)時(shí)間增加至25 min 后，延長(zhǎng)時(shí)間對(duì)提取率不再產(chǎn)生積極影響?？赡芴崛r(shí)間過(guò)長(zhǎng)，黃酮類化合物穩(wěn)定性變差或者出現(xiàn)其它雜質(zhì)[13]。因此，響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)中，提取時(shí)間確定為20 min、25 min、30 min。

圖1 提取時(shí)間對(duì)秋葵總黃酮提取效果的影響

2.1.2 超聲溫度的影響

由圖2 可以看出，在超聲溫度40 ℃～60 ℃范圍內(nèi)，超聲溫度越高，秋葵總黃酮提取率越高，于60 ℃達(dá)到最大值。然后，提取率隨溫度升高呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，可能溫度過(guò)高破壞了黃酮類化合物的穩(wěn)定性[11]。因此，響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)中，超聲溫度確定為50 ℃、60 ℃、70 ℃。

圖2 超聲溫度對(duì)秋葵總黃酮提取效果的影響

2.1.3 乙醇濃度的影響

由圖3 可以看出，秋葵總黃酮提取率隨乙醇濃度的增加先逐漸升高，于乙醇濃度65%處達(dá)到最大值。隨后，秋葵總黃酮提取率隨乙醇濃度的增加反而降低?？赡艿脑蚴?，隨著乙醇濃度增加，溶質(zhì)溶出量逐漸達(dá)到飽和，且乙醇濃度越大，其極性相對(duì)降低，對(duì)提取物的作用越小[11,14]。因此，響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)中，乙醇濃度確定為55%、65%、75%。

圖3 乙醇濃度對(duì)秋葵總黃酮提取效果的影響

2.1.4 料液比的影響

由圖4 可以看出，同樣質(zhì)量的秋葵原料，隨提取劑乙醇溶液的增加，秋葵總黃酮的提取率隨之升高，在料液比(g/mL)1:15 時(shí)達(dá)到峰值。之后，隨提取劑增加，提取率基本維持不變，說(shuō)明秋葵總黃酮已提取完全。因此，從節(jié)約試劑的角度綜合考慮，響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)中，料液比確定為1:10、1:15、1:20。

圖4 料液比對(duì)秋葵總黃酮提取效果的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 試驗(yàn)結(jié)果及建模有效性分析

以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，根據(jù)Box-Benhnken 原理并借助Design-Expert V8.0.6 軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)表2 中的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得回歸方程：

表2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

為驗(yàn)證該方程模型是否有效，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3 所示。模型的P值小于0.000 1（差異極顯著），失擬項(xiàng)P值為0.070 3，大于0.05（差異不顯著），表明該模型對(duì)實(shí)際測(cè)量值的擬合度較好[9]。由數(shù)據(jù)得出R2值為0.983 5，大于0.9，說(shuō)明響應(yīng)值和因素相關(guān)度好，且回歸模型能很好地解釋兩者之間的關(guān)系[11]。同時(shí)，方差分析結(jié)果表明，提取時(shí)間、超聲溫度、乙醇濃度和料液比對(duì)秋葵總黃酮提取率都有極顯著的影響；交互作用中，提取時(shí)間與超聲溫度、提取時(shí)間與乙醇濃度交互作用對(duì)提取率的影響也均極顯著。

表3 方差分析結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面分析

借助Design-Expert V8.0.6 軟件，得到不同因素交互作用對(duì)秋葵總黃酮提取率影響的響應(yīng)面，如圖5 至圖10 所示。曲面陡峭程度能夠體現(xiàn)考察因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度，并且陡峭程度越大，對(duì)響應(yīng)值的影響越大，反之越小[15]。曲面上相同響應(yīng)值在底面上形成等高線圖，等高線越趨近橢圓表明兩因素交互作用越大，越趨近正圓，表明兩因素交互作用越小[16]。據(jù)此，觀察圖5 至圖10，可以看出，在秋葵總黃酮提取過(guò)程中，各因素對(duì)提取率的影響程度為：料液比（D）>乙醇濃度（C）>超聲溫度（B）>提取時(shí)間（A），而提取時(shí)間與超聲溫度、提取時(shí)間與乙醇濃度的交互作用明顯，即對(duì)提取率有極顯著影響，這與方差分析結(jié)果吻合。

圖5 提取時(shí)間與超聲溫度交互作用對(duì)提取率的影響

圖6 提取時(shí)間與乙醇濃度交互作用對(duì)提取率的影響

圖7 提取時(shí)間與料液比交互作用對(duì)提取率的影響

圖8 超聲溫度與乙醇濃度交互作用對(duì)提取率的影響

圖9 超聲溫度與料液比交互作用對(duì)提取率的影響

圖10 乙醇濃度與料液比交互作用對(duì)提取率的影響

另外，從圖中還可見(jiàn)響應(yīng)面存在最高點(diǎn)，說(shuō)明響應(yīng)值存在最大值，由此得到秋葵總黃酮最佳提取工藝參數(shù)：提取時(shí)間25.14 min、超聲溫度59.03℃、乙醇濃度66.95%、料液比(g/mL)1:16.85，提取率為4.75%。

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

從可操作角度考慮，將上述得到的工藝參數(shù)進(jìn)行微調(diào)。微調(diào)后的試驗(yàn)條件為：提取時(shí)間25 min、超聲溫度59 ℃、乙醇濃度67%、料液比1:17。在該實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行3 組平行試驗(yàn)，得到秋葵總黃酮提取率為4.71%±0.09%。試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)值近似，說(shuō)明采用響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果是可行的。

3 結(jié)論

采用超聲波輔助法提取秋葵總黃酮，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)條件，探究提取時(shí)間、超聲溫度、乙醇濃度、料液比以及不同因素交互作用對(duì)秋葵中總黃酮提取率的影響。確定的最佳提取工藝為：提取時(shí)間25 min、超聲溫度59 ℃、乙醇濃度67%、料液比(g/ml) 1:17，該條件下秋葵總黃酮提取率為4.71%±0.09%。