左金丸及類方的體外溶出行為研究

程丹紅， 趙艷玲， 楊宏博， 王伽伯 賈 雷， 肖小河

(1.解放軍中藥研究所解放軍302醫(yī)院，北京100039;2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川成都610015;3.昆明理工大學(xué)，云南昆明650224)

左金丸載于《丹溪心法》，由黃連6兩，吳茱萸1兩組成，清瀉肝火，降逆止嘔。主治胃熱證;甘露散載于《圣濟總錄·中喝門》，由黃連一兩，吳茱萸半兩組成，主治暑氣證;茱萸丸載于《太平圣惠方·治水瀉諸方》，由黃連2兩，吳茱萸2兩組成，主治虛寒下痢水瀉［1，2］;反左金丸出自《施今墨藥對》，由黃連1兩，吳茱萸6兩組成，主治胃寒證［3］。這4個復(fù)方僅僅由于用藥比例的不同，而主治病證相差甚異。其類方“形似而神不同”的特征，體現(xiàn)了中醫(yī)組方的精妙之處。目前，對左金丸及其類方的研究，主要以化學(xué)成分分析以及藥理研究為主［4-6］，孔維軍［3］等人對左金丸及其類方的藥性進行了研究，從寒熱藥性角度研究了類方之間的差異。作者則以主要活性成分小檗堿、藥根堿、巴馬汀作為檢測指標(biāo)，通過模擬體內(nèi)胃腸道溶出環(huán)境，對左金丸、甘露散、茱萸丸、反左金丸的體外溶出行為進行研究，比較類方在胃腸道的溶出規(guī)律，驗證左金丸及類方的客觀差異性，為中醫(yī)經(jīng)典類方的研究提供參考和依據(jù)。

1 儀器與試藥

ACQUITYTM超高效液相色譜儀(Waters公司)包括在線真空脫氣系統(tǒng)，四元泵，自動進樣器，DAD檢測器;KQ-500B型超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司);AL 204型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);DFT-200粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司);ZRS-8G溶出度儀(天津大學(xué)無線電廠)等。

鹽酸小檗堿(批號:11073-200609)、鹽酸藥根堿(批號:0733-200005)、鹽酸巴馬汀(批號:110732-200506)購自中國藥品生物制品檢定所。乙腈為色譜純(Fisher Scientific U.S.A)，試驗用水為Milli.Q超純水，其他試劑均為分析純。

黃連與吳茱萸均購于北京同仁堂藥房，經(jīng)中國人民解放軍302醫(yī)院全軍中藥研究所肖小河研究員鑒定;黃連為毛茛科植物黃連 Coptis chinensis Franch.的干燥根莖;吳茱萸為蕓香科植物Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth.的干燥近成熟的果實。

人工胃液(按中華人民共和國藥典2005版配制):量取稀鹽酸16.4 mL加水約800 mL，加胃蛋白酶10 g搖勻后加水稀釋成1 000 mL。

人工腸液(按中華人民共和國藥典2005版配制):取磷酸二氫鉀6.8 g加水500 mL使溶解，用0.4%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8，另取胰蛋白酶10 g加水適量溶解，將兩液混合后加水稀釋成1 000 mL。

2 方法與結(jié)果

2.1 左金丸及類方中3種生物堿測定方法的建立

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱取鹽酸小檗堿、藥根堿、巴馬汀對照品適量，置于50 mL量瓶中，加入一定量的甲醇超聲30 min，甲醇定容，即得濃度依次為 18.4 μg/mL、11.6 μg/mL、12.8 μg/mL 的對照品溶液。

2.1.2 樣品的制備 稱取一定量的黃連細(xì)粉、吳茱萸細(xì)粉，按相應(yīng)的比例:左金丸(黃連/吳茱萸6∶1)、甘露散(黃連/吳茱萸2∶1)、茱萸丸(黃連/吳茱萸1∶1)、反左金丸(黃連/吳茱萸1∶6)均勻混合，即可得所需樣品。

2.1.3 供試品溶液的制備 取不同時間溶出介質(zhì)溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.1.4 色譜條件 色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(50 mm ×2.1 mm，1.7 μm);

流動相組成為:流動相A為乙腈，流動相B為0.05%的H3PO4水。進行梯度洗脫，洗脫程序如表1所示。柱溫為22.5℃，檢測波長347 nm，進樣量為0.2 μL，全自動進樣。見圖1。

表1 梯度洗脫程序

圖1 左金丸及類方樣品和混合對照品溶液的UPLC圖譜

2.1.5 線性關(guān)系 精密量取各對照品溶液1、2、3、4、5 mL置于10 mL量瓶中，甲醇定容，搖勻即可。吸取一定量的對照品溶液經(jīng)過0.22 μm濾膜過濾，置于樣品瓶中，自動進樣，進樣量0.2 μL。測定峰面積。以各對照品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。小檗堿:Y=9×106X+9 735.2，r=0.999 8，巴馬汀:Y=1×107X+5 851.4，r=0.999 2，藥根堿:Y=2 ×107X+8 740.4，r=1.000。結(jié)果表明小檗堿在9.2～147.2 μg/mL，巴馬汀在6.4 ～102.4 μg/mL，藥根堿在 5.8～92.8 μg/mL時，與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.1.6 精密度試驗 精密吸取對照品溶液，按上述條件連續(xù)測定5次，記錄峰面積值，結(jié)果RSD值為1.8%，表明精密度良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 精密吸取左金丸及類方供試品溶液，分別在 0、2、4、8、16、24 h 測定。結(jié)果表明:供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定，RSD為2.2%。

2.2 左金丸及類方體外溶出試驗

2.2.1 溶出介質(zhì)的選擇 將已經(jīng)混合均勻的左金丸、甘露散、茱萸丸、反左金丸藥材細(xì)粉，置于溶出杯中，分別在以下4種不同的溶出介質(zhì)(pH=1.2的稀鹽酸溶液、pH=6.8的KH2PO4溶液、人工胃液、人工腸液)中進行。將所得樣品溶液在上述色譜條件下進行測定，記錄左金丸及其類方中小檗堿、藥根堿、巴馬汀的峰面積，計算溶出量。結(jié)果表明:不同的溶出介質(zhì)對左金丸、甘露散、茱萸丸、反左金丸中的3種生物堿的溶出影響較大。各復(fù)方中3種生物堿溶出量大小順序依次為:pH=1.2的鹽酸溶液>人工胃液>人工腸液>pH=6.8 KH2PO4溶液。依據(jù)溶出介質(zhì)選擇的標(biāo)準(zhǔn)，將pH=1.2的鹽酸溶液作為左金丸及類方的體外溶出介質(zhì)。

2.2.2 左金丸及類方最大溶出量的測定 參照中國藥典2005年版二部附錄ⅩC第三法(小杯法)，分別精密稱取左金丸、甘露散、茱萸丸、反左金丸0.7 g、0.6 g、0.6 g、0.7 g，置于溶出測試儀中，加 250 mL已脫氣的pH=1.2的鹽酸溶液作為溶出介質(zhì)，恒溫(37±0.5)℃，轉(zhuǎn)速為100 r/min，溶出3 h后，取樣5 mL，離心取上清液并用0.22 μm濾膜過濾，濾液置于樣品瓶中，在上述色譜條件下進行測定，計算最大溶出量。結(jié)果見表2、3、4。

表2 左金丸及類方中小檗堿體外溶出量

表3 左金丸及類方中巴馬汀體外溶出量

表4 左金丸及類方中藥根堿體外溶出量

結(jié)果表明:左金丸、甘露散、茱萸丸、反左金丸中小檗堿、巴馬汀、藥根堿在pH=1.2的鹽酸溶液中3 h的溶出量存在顯著差異。其中左金丸中3種生物堿的溶出量最多，依次為甘露散、茱萸丸、反左金丸。隨著類方配伍中黃連劑量的減少，吳茱萸劑量的增加，類方中3種生物堿的溶出量不斷減少，但黃連和吳茱萸主要生物堿的每克溶出率并沒有呈相同比例的減少或增加?？赡苁怯捎趦伤幣湮楹笊飰A成分相互作用形成新的化學(xué)物質(zhì)或吳茱萸中某些成分影響了黃連中生物堿的溶出。

2.2.3 左金丸及類方溶出速度的測定 分別精密稱取左金丸、甘露散、茱萸丸、反左金丸0.7 g、0.6 g、0.6 g、0.7 g，置于溶出測試儀中，加 250 mL 已脫氣處理的pH=1.2的HCl溶液作為溶出介質(zhì)，采用漿法，恒溫(37 ±0.5)℃，轉(zhuǎn)速為100 r/min，分別在1、2、3、4、5、10、30、45、60 min 時吸取溶液 5 mL(隨即補加同體積同溫介質(zhì))，離心，取上清液用0.22 μm濾膜濾過，濾液置于樣品瓶中，在上述色譜條件下測定峰面積，計算不同時間各復(fù)方中小檗堿、巴馬汀、藥根堿的溶出量。結(jié)果見表5、6、7。

表5 左金丸及類方中小檗堿體外溶出速度

表6 左金丸及類方中巴馬汀的體外溶出速度

結(jié)果表明:左金丸、甘露散、茱萸丸、反左金丸中小檗堿、巴馬汀、藥根堿的溶出非常快速，在5 min內(nèi)即可達(dá)到最大溶出速度。其中左金丸中3種生物堿都在2 min時達(dá)到最大溶出速度;甘露散與茱萸丸中的小檗堿和巴馬汀均在4 min時達(dá)到最大溶出速度，而反左金丸中的小檗堿和巴馬汀則在3 min時溶出速度最大。同時作者發(fā)現(xiàn)，隨著時間的延長，3種生物堿的溶出量逐漸減小，原因可能是由于吳茱萸中的某些成分影響了黃連中生物堿的溶出或者是生物堿自身結(jié)構(gòu)發(fā)生了分解，轉(zhuǎn)化成其他的化合物或不溶物［7-9］。對于真正的原因還需要進一步進行實驗研究。

表7 左金丸及類方中藥根堿體外溶出速度

3 討論

3.1 本實驗利用超高效液相色譜(UPLC)建立了左金丸、甘露散、茱萸丸、反左金丸中小檗堿、巴馬汀、藥根堿的測定方法。所建立的方法重現(xiàn)性好，精密度、準(zhǔn)確度高;與HPLC相比，可以有效的節(jié)約出峰時間和溶劑消耗。

3.2 通過對四個復(fù)方溶出介質(zhì)的選擇，作者發(fā)現(xiàn)不同的溶出介質(zhì)對小檗堿、巴馬汀、藥根堿的溶出影響較大。其中在pH=1.2的HCl溶液中，3種生物堿的溶出量較多，而在pH=6.8的KH2PO4溶液中，溶出則最少。

3.3 由于中藥的療效與其活性成分的溶出密切相關(guān)，各種活性成分的溶出是否具有同步性，直接影響到各成分之間的相互作用以及與機體的作用，最終影響該復(fù)方或單味中藥的藥效。因此左金丸及其類方主治病證差異的原因可能與活性成分的溶出有關(guān)。從溶出量來看，左金丸、甘露散、茱萸丸、反左金丸中的小檗堿、巴馬汀、藥根堿經(jīng)過溶出3 h后，最大溶出量存在顯著差異。其中甘露散、茱萸丸、反左金丸中小檗堿的溶出量僅為左金丸的78.88%、56.62%、11.18%;類方中3種生物堿的溶出速度也不盡相同，但差異很小，均在5min內(nèi)達(dá)到最大溶出。通過對實驗結(jié)果分析，作者發(fā)現(xiàn)隨著黃連比例的減少吳茱萸的增加，含吳茱萸比例較多的類方，這3種生物堿的溶出明顯減少，但并沒有按相同比例的減少?？赡苁怯捎趨擒镙侵械哪承┏煞钟绊懥它S連中生物堿的溶出，或者是兩味藥中的某些成分相互作用，產(chǎn)生了新物質(zhì)。另外，作者發(fā)現(xiàn)含有吳茱萸較多的類方，在放入溶出介質(zhì)后，由于吳茱萸為干燥的近成熟的果實，質(zhì)地較輕而易發(fā)生結(jié)塊，這可能也是影響黃連中生物堿溶出的一個原因。

3.4 通過模擬體內(nèi)胃腸道環(huán)境，以活性成分小檗堿、巴馬汀、藥根堿為檢測指標(biāo)，研究左金丸及類方在胃腸道的溶出規(guī)律，驗證了類方之間主要活性成分溶出行為的客觀差異性，對其“形似而神不同”的本質(zhì)進行了初步的研究，在以后的研究中還需對類方中活性成分的吸收以及代謝等體內(nèi)過程進行更深入的研究，以此了解類方發(fā)揮藥效的作用機制。

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