大孔樹脂純化買麻藤總茋化合物的工藝研究

袁紅宇， 歐 寧， 朱 璇， 吳婷婷

（南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，江蘇南京 210029）

買麻藤Caulis Gnetum為買麻藤科植物買麻藤Gnetum montanumMarkgr.或小葉買麻藤Gnetum parvifoliumWarb.的干燥藤莖，主要分布于兩廣、云南、海南、福建等地，有平喘、抗過敏、抗蛇毒等藥理作用，民間用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)痛、腰肌勞損、刀槍傷、蛇咬傷、支氣管哮喘和潰瘍出血等癥［1］。買麻藤中主要含有茋類、生物堿、揮發(fā)油、黃酮等化合物，以茋類化合物如白藜蘆醇、異丹葉大黃素及其苷類含量最高［2，3］。近年來大量的研究表明異丹葉大黃素、白藜蘆醇為代表的茋類化合物有明顯的抗腫瘤作用［4，5］。為了得到純度較高的買麻藤總茋類化合物，筆者采用大孔吸附樹脂技術(shù)對其進(jìn)行分離純化，報道如下。

1 儀器和試藥

島津UV－2401型紫外分光光度計;Sartorius－BP211型電子天平;791 型磁力加熱攪拌器;HZ－801、HZ－806、HZ－816 型大孔樹脂，上海華震科技有限公司提供;HPD－100、HPD－450、HPD－600型大孔樹脂，滄州寶恩化工有限公司提供;ADS－8、ADS－5型大孔樹脂，天津南開和成科技有限公司提供;白藜蘆醇苷（批號111575－200502），購于中國藥品生物制品檢定所;買麻藤藥材購于安徽省亳州市藥材公司。

2 方法和結(jié)果

2.1 總茋化合物的含量測定方法

2.1.1 白藜蘆醇苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取白藜蘆醇苷標(biāo)準(zhǔn)品5.10 mg，用80%的乙醇溶解定容至250 mL棕色量瓶中，得到濃度為20.4 μg/mL的白藜蘆醇苷標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.1.2 樣品測定液的制備

稱取買麻藤藥材10 g，加入60%乙醇液60 mL回流1.5 h，濾過，濾液用60%乙醇補(bǔ)足至60 mL作為醇提液。精密吸取上述醇提液0.5 mL，用80%乙醇溶液稀釋定容至100 mL作為樣品測定液，避光冷藏待測。

2.1.3 紫外吸收光譜掃描

分別將白藜蘆醇苷標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品測定液在200～600 nm范圍內(nèi)做全波長掃描，得白藜蘆醇苷對照液和樣品液的紫外吸收光譜，樣品液與白藜蘆醇苷標(biāo)準(zhǔn)液在321 nm處均有吸收峰，因此可以選擇白藜蘆醇苷為對照溶液，測定波長為321 nm。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別精密移取白藜蘆醇苷標(biāo)準(zhǔn)液2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、20.0 mL置25 mL棕色量瓶中，用80%乙醇稀釋定容，得濃度為 2.04、4.08、6.12、8.16、10.20、12.24、16.32 μg/mL的系列白藜蘆醇苷對照液。分別在321 nm處測定其吸光度，并以濃度作為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。得出回歸方程為:A=0.045 1+0.059 6C，r=0.999 9;線性范圍為2.04 ～16.32 μg/mL。

2.1.5 精密度實驗

取樣品測定液，連續(xù)測定吸光度6次。測定結(jié)果A=0.609±0.001，RSD=0.09%。

2.1.6 穩(wěn)定性實驗

取樣品測定液，分別在 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h時測定吸光度。測定結(jié)果A=0.614±0.04，RSD=0.50%，說明樣品在3小時內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 加樣回收率實驗

精密吸取2.0 mL已知含量的樣品測定液6份，分別加入濃度為12.24 μg/mL的白藜蘆醇苷對照液2.0 mL，混勻，用80%乙醇溶液適當(dāng)稀釋后測定吸光度，計算回收率。結(jié)果平均回收率為（100.4±1.1）%。

2.1.8 總茋化合物的含量測定

樣品測定液在321 nm波長處測定吸光度，外標(biāo)法計算總茋化合物含量。

2.2 大孔吸附樹脂的篩選

2.2.1 吸附母液的制備

稱取買麻藤藥材1 000 g，加入6倍量的60%乙醇液回流提取3次，每次1.5 h，合并回流液，減壓濃縮至無醇味，冷藏放置48 h，冷藏液離心（4 000 r/min×30 min）、抽濾，蒸餾水定容至5 000 mL，作為吸附母液（每1 mL含0.2 g生藥量）。經(jīng)測定，母液中總茋化合物濃度為1.84 mg/mL，純度11.9%。

2.2.2 樹脂的預(yù)處理

將8種型號的大孔吸附樹脂先用95%乙醇浸泡24 h，然后乙醇以2 BV/h流速通過樹脂層，至流出液加水不呈白色渾濁為止，用蒸餾水沖洗樹脂至無醇味，備用。

2.2.3 靜態(tài)吸附實驗

將預(yù)處理好的8種大孔吸附樹脂1.0 g分別置具塞三角瓶中，各加入50 mL買麻藤吸附母液，室溫放置12 h，每小時磁力攪拌1次，每次2 min。抽濾，并用50 mL蒸餾水沖洗含藥樹脂，洗液并入濾液中，測定吸附前后買麻藤濃縮液中總茋化合物濃度的變化，計算各樹脂的靜態(tài)比吸附量，靜態(tài)比吸附量=（母液含量－殘液含量）/濕樹脂重量。將抽濾至干的含藥樹脂分別置具塞三角瓶中，各加入60%乙醇溶液50 mL，室溫放置，同法攪拌，4 h后測定解吸液中總茋化合物的含量，計算解吸率，靜態(tài)解吸率=解吸量/吸附量×100%。結(jié)果見表1。

表1 8種樹脂對買麻藤總茋化合物的靜態(tài)比吸附量和解吸率結(jié)果（n=3）

靜態(tài)比吸附量結(jié)果可以看出，HPD－100，HZ－816，HPD－600吸附總茋化合物能力較強(qiáng)，其它型號的樹脂吸附能力較差，而從解吸率來看，有5種樹脂的解吸率超過了90%，洗脫比較完全，在比吸附量前3位的樹脂中，僅有HPD－100解吸率超過了90%。因此綜合比吸附量和解吸率結(jié)果，選擇HPD－100型樹脂分離純化買麻藤總茋化合物。

2.3 HPD－100型樹脂吸附工藝研究

2.3.1 正交設(shè)計

根據(jù)總茋化合物的性質(zhì)和大孔樹脂的吸附特性以及有關(guān)文獻(xiàn)報道［6－7］，選取樹脂柱徑高比、上柱液濃度、pH 值以及流速作為考察因素，每個因素各取3個水平進(jìn)行L9（34）正交實驗，正交因素水平表見表2。每克濕樹脂上柱量為20 mL上柱母液，吸附完成后用上柱液同體積的蒸餾水按2 BV/h流速沖洗。測定上柱母液、流出液、水洗液中總茋化合物濃度，計算動態(tài)比吸附量。動態(tài)比吸附量=（上柱量－流出液量－水洗液量）/濕樹脂重量。

表2 L9（34）正交設(shè)計因素水平表

2.3.2 正交實驗結(jié)果

正交結(jié)果見表3，用直觀分析法比較四個因素的極差，RD＞RA＞RB＞RC，表明流速是影響結(jié)果的最主要因素。由同一因素的三個水平得知 A1＞A2＞A3，B3＞B1＞B2，C2＞C3＞C1，D1＞D2＞D3，故最佳工藝為 A1B3C2D1，即徑高比 1 ∶3，濃度 0.92 mg/mL，pH 4.5、流速 1 BV/h。

表3 L9（34）正交實驗結(jié)果

2.3.3 驗證試驗

取0.92 mg/mL的上柱液360 mL，按最佳吸附工藝A1B3C2D1進(jìn)行3次重復(fù)實驗。3次實驗的動態(tài)比吸附量測定結(jié)果為（33.17±0.17）mg/g，均處于正交實驗表較高水平，表明優(yōu)選的吸附工藝合理、穩(wěn)定、具有可行性。

2.3.4 泄漏曲線

稱取經(jīng)預(yù)處理的HPD－100型樹脂9 g（徑高比為1∶3，樹脂床體積為15 mL），濕法裝柱，上柱液濃度為0.92 mg/mL，以1 BV/h的流速過柱，每25 mL為1份，收集流出液，測定流出液中總茋化合物濃度。以收集份數(shù)為橫坐標(biāo)，流出液濃度為縱坐標(biāo)，繪制穿透曲線，以流出液中的濃度等于上柱液濃度的10%處為泄漏點(diǎn)，計算飽和比吸附量。

穿透曲線見圖1，可以看出在流出液在300 mL時，流出液濃度接近上柱液濃度的10%，表明樹脂可吸附300 mL上柱液，樹脂的飽和比吸附量為30.7 mg/g濕樹脂。

圖1 買麻藤總茋化合物穿透曲線

2.4 HPD－100型樹脂洗脫工藝研究

2.4.1 蒸餾水洗去水溶性雜質(zhì)

將買麻藤上柱液300 mL以最佳吸附工藝條件進(jìn)行吸附后，用蒸餾水按2 BV/h的速度洗去含藥樹脂柱上的水溶性雜質(zhì)，以2 BV（30 mL）為1單位，收集10份流出液，測定流出液中固含物的重量，以收集份數(shù)為橫坐標(biāo)，流出液中水溶性雜質(zhì)重量的累積洗脫百分率為縱坐標(biāo)，繪制曲線見圖2。

圖2 蒸餾水對水溶性雜質(zhì)的洗脫曲線

從圖2可以看出，隨著蒸餾水用量的增加，水溶性雜質(zhì)被逐步洗脫下來，當(dāng)蒸餾水用量為10BV（150 mL）時，雜質(zhì)累積洗脫率達(dá)到88.4%，可認(rèn)為水溶性雜質(zhì)基本洗脫干凈。故蒸餾水用量確定為10 BV。

2.4.2 正交實驗優(yōu)選洗脫工藝

2.4.2.1 洗脫工藝參數(shù)的優(yōu)化

根據(jù)總茋化合物的性質(zhì)和大孔樹脂的吸附特性，我們選擇乙醇濃度、乙醇用量及洗脫速度作為考察因素，每個因素各取3個水平進(jìn)行L9（34）正交實驗，因素水平表見表4，測定各次試驗洗脫液中總茋化合物濃度和固含率，計算比洗脫量Y1（比洗脫量=總茋洗脫量/濕樹脂重量）和總茋化合物純度Y2（總茋化合物純度=總茋化合物含量/總固含物重×100%）。將比洗脫量和總茋化合物純度結(jié)果進(jìn)行轉(zhuǎn)化評分，把比洗脫量和總茋化合物純度最高值定為100，其余按照公式Y(jié)′1=Y1/Y1max×100，Y′2=Y2/Y2max× 100 計算相應(yīng)得分，再按公式Y(jié)=0.7Y′1+0.3Y′2計算加權(quán)綜合評分。再將綜合評分進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果見表5。

2.4.2.2 結(jié)果分析

用直觀分析法比較四個因素的極差，可得RA＞RB＞RD＞RC，即乙醇濃度對總茋化合物洗脫影響最大，其次是乙醇用量，洗脫速度影響最小。以空白組作為誤差參照組，對其他3個因素水平進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表6。可以看出，因素A（乙醇濃度）各水平間有極顯著性差異（P＜0.01），因素B（乙醇用量）、因素C（洗脫速度）各水平間沒有有顯著性差異（P＞0.05）。根據(jù)實驗結(jié)果，因素A選擇最好水平3，因素B選擇最好水平3，因素C選擇最好水平2，但在實驗中我們發(fā)現(xiàn)用60%乙醇洗脫時至6 BV時，洗脫液已基本無色，考慮到洗脫液用量過大會增加成本，并給后續(xù)工藝帶來困難，確定乙醇洗脫用量為6倍柱體積。因此，買麻藤總茋化合物洗脫的最佳工藝為A3B2C2，即乙醇濃度為60%，用量為6 BV，洗脫速度為2 BV/h。

表4 L9（34）正交設(shè)計洗脫工藝因素水平表

表5 洗脫工藝正交實驗結(jié)果

表6 方差分析

2.4.3 驗證實驗

按照優(yōu)化的洗脫工藝A3B2C2，同法對買麻藤吸附柱依次進(jìn)行洗脫，測定各次試驗洗脫液中總茋化合物濃度和固含率，計算比洗脫量和總茋化合物純度。3次重復(fù)試驗結(jié)果比洗脫量為（28.91±0.91）mg/g，純度為（41.5±0.4）%，在正交實驗表中均處于較高水平。表明優(yōu)化的洗脫工藝重現(xiàn)性良好。

3 討論

大孔吸附樹脂是一種不溶于酸、堿及各種有機(jī)溶劑的有機(jī)高分子聚合物，具有物理化學(xué)穩(wěn)定性高、比表面積大、吸附容量大、選擇性好、吸附速度快、解吸條件溫和、再生處理方便、使用周期長、宜于構(gòu)成閉路循環(huán)、節(jié)省費(fèi)用等諸多優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已被廣泛用于天然產(chǎn)物的分離和富集。我們應(yīng)用HPD－100型大孔樹脂，在所確定的純化工藝條件下對買麻藤醇提液進(jìn)行純化，買麻藤總茋化合物保留率為94.3%，總茋純度提高了3.5倍。

洗脫正交實驗優(yōu)選的洗脫的最佳工藝結(jié)果為乙醇洗脫劑濃度為60%，洗脫液體積為6 BV，洗脫流速為2 BV/h?？紤]到乙醇濃度是影響洗脫的最主要因素，而最佳水平又處于正交設(shè)計的最大值，為此，我們又以70%乙醇進(jìn)行洗脫，其他因素按最優(yōu)水平進(jìn)行實驗，結(jié)果比洗脫量與純度結(jié)果均與60%乙醇洗脫相似，考慮到60%乙醇洗脫所需成本較低，故仍選擇60%乙醇。

按照我們篩選出的工藝參數(shù)，可以將洗脫液中買麻藤總茋的純度顯著提高，但純度仍低于50%。為了提高總茋化合物的純度，我們嘗試多種方法，如:上柱液先用殼聚糖澄清、洗脫液加入活性炭吸附，但效果都不很明顯。我們通過分步洗脫研究，發(fā)現(xiàn)用低濃度的乙醇預(yù)洗脫除去部分雜質(zhì)后，再用60%的乙醇洗脫，可以得到純度大于65%的總茋類有效部位，但總茋化合物的保留率明顯下降，該工藝是否值得應(yīng)用，尚需進(jìn)一步研究探討。

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