DEPDC1在肺腺癌中高表達(dá)并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖

沈健 郗萌萌

肺癌是中國(guó)乃至世界發(fā)病率和死亡人數(shù)最高的腫瘤之一，根據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)的數(shù)據(jù)[1‐3]統(tǒng)計(jì)，近年來肺癌的發(fā)病和死亡人數(shù)仍在持續(xù)增加。而根據(jù)組織學(xué)特征，肺癌分為兩種亞型：小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（non‐small cell lung cancer,NSCLC）[4]。NSCLC進(jìn)一步分為3種主要的組織學(xué)亞型：肺腺癌（lung adenocarcinoma, LUAD）、肺鱗狀細(xì)胞癌和大細(xì)胞癌[5]。目前針對(duì)肺癌的治療包括靶向治療和免疫療法與傳統(tǒng)手術(shù)，放療和化學(xué)療法相結(jié)合，為提高患者的生存率做出了巨大貢獻(xiàn)。然而，由于診斷的局限性，大多數(shù)NSCLC患者已經(jīng)處于晚期[6]，其5年生存率很低。因此，為了提高患者的預(yù)后和生存率，發(fā)現(xiàn)一種新的生物標(biāo)志物，提高肺腺癌的診斷率，尋找到新的藥物治療靶點(diǎn)已迫在眉睫。

DEPDC1（DEP domain containing 1）是一種蛋白質(zhì)編碼的基因，除睪丸外，正常人體組織中均未檢測(cè)到它的表達(dá)[7]。DEPDC1已經(jīng)被證實(shí)與多個(gè)腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，例如前列腺癌[8]、乳腺癌[9]、胃癌[10]、結(jié)直腸癌[11]、肝細(xì)胞癌[12]。并且在這些腫瘤中高度表達(dá)，并且與臨床預(yù)后不良密切相關(guān)。以上的研究均表明，DEPDC1在大多數(shù)腫瘤中過表達(dá)，具有成為生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的潛力。DEPDC1在肺腺癌中過表達(dá)也被初步證實(shí)，有研究[13]證實(shí)靶向DEPDC1會(huì)激活核因子κB（nuclear factor kappa‐B, NF‐κB）信號(hào)通路介導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞的凋亡。但是他們的研究并沒有用免疫組化驗(yàn)證DEPDC1的組織表達(dá)水平，也沒有進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，論證完整性欠缺，關(guān)于二者的機(jī)制仍需要進(jìn)一步探討。

本研究旨在通過探究肺腺癌組織與癌旁正常組織中DEPDC1的表達(dá)量及其臨床預(yù)后的差異，并且通過體外實(shí)驗(yàn)去進(jìn)一步探究敲低DEPDC1對(duì)癌細(xì)胞增殖的影響。這將有助于我們進(jìn)一步理解DEPDC1在肺腺癌的發(fā)生發(fā)展中所發(fā)揮的重要作用，為探索肺腺癌的生物標(biāo)記物提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 樣本資料 本研究共納入錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院收治的65例肺腺癌手術(shù)患者，所有標(biāo)本組織均經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)。根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（American Joint Committee on Cancer, AJCC）腫瘤原發(fā)灶‐淋巴結(jié)‐轉(zhuǎn)移（tumor‐node‐metastasis, TNM）2010分類系統(tǒng)評(píng)估腫瘤分期。

本研究以1964年赫爾辛基宣言和隨后所有修訂案中規(guī)定的道德標(biāo)準(zhǔn)為基礎(chǔ)。所有案例的數(shù)據(jù)和標(biāo)本采集工作均獲得患者本人的知情同意，并簽署知情同意書。

1.2 試劑 DEPDC1抗體（ab197246, IHC 1:200, WB 1:1,000），DEPDC1二抗（PV6000），Trizol試劑（Thermo Fisher Scienti fic，美國(guó)馬薩諸塞州沃爾瑟姆），SuperSilencing? shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體套裝（吉瑪公司，中國(guó)，上海C01001），Cell Counting Kit‐8（CCK‐8, Dojindo Molecular Technologies, Gaithersburg, MD）。

1.3 免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果評(píng)定 腫瘤組織和鄰近的正常組織石蠟切片在我院采集。從石蠟塊上切下切片（4 μm），進(jìn)行脫蠟和抗原修復(fù)后，與DEPDC1抗體（ab197246, Abcam plc, Cambridge, UK. 1:200）一起在4oC下孵育過夜。然后，在室溫下應(yīng)用通用性（小鼠/兔聚合物法檢測(cè)系統(tǒng)）PV‐6000二步法檢測(cè)試劑盒（PV‐6000，中杉金橋生物有限公司，北京）進(jìn)行二抗染色30 min。使用DAB顯色試劑盒（ZLI‐9018，優(yōu)寧維生物科技股份有限公司，上海）進(jìn)行后續(xù)染色。應(yīng)用蘇木素（G1080，百泰克生物科技有限公司，北京）進(jìn)行最后的細(xì)胞核染色，后續(xù)進(jìn)行梯度酒精脫水和二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察和照相采圖。染色強(qiáng)度評(píng)分如下：無染色為0分；弱染色為1分；中高度染色為2分。染色陽(yáng)性細(xì)胞的百分比分類如下：無染色，0分：1%‐24%的染色細(xì)胞；1分：25%‐50%；2分：51%‐84%；3分：85%‐100%。由兩名病理學(xué)家評(píng)估免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry, IHC）染色。最終分?jǐn)?shù)是通過將比例和強(qiáng)度相乘得出的。根據(jù)最終分?jǐn)?shù)的分布，我們將DEPDC1的表達(dá)分為高表達(dá)組（3分‐8分）和低表達(dá)組（0分‐3分）。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺腺癌細(xì)胞株A549和H1975來自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)（中國(guó)上海）。在37oC、95%空氣和5%CO2的培養(yǎng)箱中，將細(xì)胞維持在10%胎牛血清（FBS, Gibco）的RPMI‐1640 （Gibco）中。以經(jīng)攜帶shRNA質(zhì)粒處理的細(xì)胞為shRNA組，以攜帶無效靶點(diǎn)的shRNA的細(xì)胞為對(duì)照組。

1.5 穩(wěn)定的敲低細(xì)胞系 為了建立穩(wěn)定敲低DEPDC1的細(xì)胞系，我們選擇了有效的shRNA序列，shRNA的序列是5'‐AAACATCGCTGTCGTTTCAAGAG‐3'。選用SuperSilencingTM shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體套裝，使用pGPH1/Neo載體，構(gòu)建質(zhì)粒經(jīng)大腸桿菌擴(kuò)增后使用lipo3000轉(zhuǎn)染，3 d后使用新霉素篩選。逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription‐quantitative polymerase chain reaction, RT‐qPCR）和Western blot用于檢測(cè)兩種細(xì)胞系的敲低效率。選擇穩(wěn)定敲低細(xì)胞并用于以后的實(shí)驗(yàn)。

1.6 RT‐qPCR 按照制造商的說明，用Trizol試劑（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)馬薩諸塞州沃爾瑟姆）提取細(xì)胞的總RNA。通過cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Fisher Scientific，具體同上）將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。DEPDC1引物（上海生工，中國(guó)）：DEPDC1‐正向引物：5'‐ヰヰGGTCCTGAAGヰACAAGGC‐3'和DEPDC1‐反向引物：5'‐TGGATACCTTCGTGGTAGA GヰT‐3'。

1.7 Western blot 提取蛋白后，按照試劑盒說明書制膠，加樣后，設(shè)置電壓為60 V時(shí)間為15 min，隨后設(shè)置為100 V，時(shí)間為110 min。取出SDS‐PAGE膠，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。取出PVDF膜，經(jīng)TBST溶液清洗，用10%脫脂牛奶進(jìn)行封閉。TBST清洗3次，每次3 min后，將膜放入一抗中，4oC搖床過夜。第二天室溫下TBST清洗PVDF膜，每次10 min共3次后，加入二抗，搖床孵育1 h，再經(jīng)TBST清洗3次，每次5 min后，顯影。

1.8 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 將A549和H1975細(xì)胞接種于6孔板中，每孔500個(gè)細(xì)胞。第2天用DMSO或BMP受體拮抗劑處理細(xì)胞2周。集落用Diff‐Quick（IMEB Inc.San Marcos,CA）染色，計(jì)數(shù)每孔菌落總數(shù)。

1.9 細(xì)胞增殖試驗(yàn) 采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒‐8 （cell counting kit‐8, CCK‐8）法，按照制造商說明書檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。每孔加入10 μL細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒‐8（CCK‐8, Dojindo Molecular Technologies, Gaithersburg, MD）的溶液，將這些細(xì)胞放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。最后，使用酶標(biāo)儀（Bio‐Rad, Hercules, CA, USA）在450 nm處測(cè)量吸光度。

1.10 GEIPA書數(shù)據(jù)庫(kù) GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)在線生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)（http://gepia.cancer‐pku.cn/detail.php?gene=DEPDC1），提供有關(guān)不同癌癥的生物學(xué)信息分析。我們從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載了LAUD患者的臨床數(shù)據(jù)和mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)。然后比較DEPDC1在肺腺癌組織和癌旁對(duì)照組的表達(dá)差異。分析了DEPDC1在LAUD患者的總生存期（overall survival, OS）和無病生存期（disease‐free survival, DFS）中的預(yù)后價(jià)值。

1.11 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，在定量分析時(shí)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，同時(shí)使用t檢驗(yàn)對(duì)兩組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。用χ2分析探討臨床病理特征與蛋白表達(dá)水平的關(guān)系。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DEPDC1在肺腺癌組織生物信息學(xué)分析 通過GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中在線分析了350個(gè)臨床樣本（其中包含483個(gè)肺腺癌臨床樣本和347個(gè)正常肺組織樣本，http://gepia.cancer‐pku.cn/detail.php?gene=DEPDC1）。結(jié)果顯示DEPDC1的表達(dá)量在肺腺癌組織中明顯高于正常肺組織（P<0.05）（圖1A）。為了進(jìn)一步探討DEPDC1的表達(dá)與肺腺癌患者的預(yù)后之間的潛在關(guān)系，通過使用Kaplan-Meier繪制DEPDC1與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果顯示，在DEPDC1表達(dá)量高的患者中，OS率和DFS率都比較低（圖1B），高表達(dá)組與低表達(dá)組的預(yù)后差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。以上結(jié)果顯示DEPDC1在肺腺癌組織中的表達(dá)水平高，并與肺腺癌的預(yù)后生存緊密相關(guān)。

圖 1 DEPDC1在肺腺癌組織中的生物信息學(xué)分析。A：肺腺癌組織與正常組織DEPDC1表達(dá)量對(duì)比；B：DEPDC1高低表達(dá)組總體生存率與無病生存率對(duì)比（P<0.05）。Fig 1 Bioinformatics analysis of DEPDC1 in lung adenocarcinoma tissue. A: Comparison of the expression level of DEPDC1 in lung adenocarcinoma tissues and normal tissues; B: Comparison of overall survival rate and disease-free survival rate between the high and low expression group of DEPDC1 (P<0.05).

2.2 DEPDC1在腫瘤組織中的表達(dá)情況 通過GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析了DEPDC1在腫瘤中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，在大多數(shù)腫瘤的中的表達(dá)是陽(yáng)性的，在甲狀腺癌、頭頸部鱗癌、尿路上皮癌、黑色素瘤中高度表達(dá)（https://www.proteinatlas.org/ENSG00000024526‐DEPDC1/pathology）。而在淋巴瘤中未見明顯表達(dá)。我們進(jìn)一步探究了DEPDC1在結(jié)直腸癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其在乳腺癌、結(jié)直腸癌中明顯高表達(dá)，且發(fā)現(xiàn)DEPDC1主要表達(dá)在細(xì)胞核（圖2）。

圖 2 DEPDC1在多種腫瘤中的表達(dá)情況Fig 2 Expression of DEPDC1 in a variety of tumors

2.3 DEPDC1在肺腺癌組織中高表達(dá) 為了探究DEPDC1在肺腺癌中的表達(dá)情況，我們運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色來檢測(cè)65例肺腺癌組織中的DEPDC1的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，DEPDC1在肺腺癌組織中高度表達(dá)，并且DEPDC1主要定位于細(xì)胞核（圖3A）。根據(jù)染色的強(qiáng)度，我們?nèi)藶榈貙⒎蜗侔┗颊叻譃楦弑磉_(dá)組和低表達(dá)組，用正常的肺組織來設(shè)立對(duì)照組，發(fā)現(xiàn)DEPDC1在癌旁的正常肺組織的表達(dá)量顯著低于肺腺癌組織（圖3B）。

圖 3 DEPDC1在肺腺癌組織中高表達(dá)。A：肺腺癌組織，分為高表達(dá)組與低表達(dá)組；B：癌旁正常組織。分別于×100與×200光鏡下觀察，肺腺癌組織染色強(qiáng)度顯著高于癌旁組織。Fig 3 DEPDC1 was highly expressed in lung adenocarcinoma tissues. A: lung adenocarcinoma tissue, divided into high and low expression group; B:It is normal tissue adjacent to the cancer. The staining intensity of lung adenocarcinoma tissues was significantly higher than that of adjacent tissues under ×100 and ×200 microscopes, respectively.

2.4 DEPDC1高表達(dá)與肺腺癌的腫瘤大小及臨床分期相關(guān) 對(duì)上述的65例肺腺癌患者標(biāo)本組織的DEPDC1表達(dá)量與病理參數(shù)的關(guān)系進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（表1）。選取了性別、年齡、是否吸煙、腫瘤大小、分化和臨床分期6個(gè)臨床病理特征進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示，DEPDC1與腫瘤大?。≒=0.002）和臨床分期（P=0.008）具有相關(guān)性，與性別、年齡、是否抽煙、腫瘤分化均無顯著相關(guān)性（P>0.05）。

表 1 DEPDC1的表達(dá)量與腫瘤臨床特點(diǎn)的關(guān)系（n=65）Tab 1 Correlation of expression of DEPDC1 with clinical features of tumors (n=65)

2.5 敲低DEPDC1可抑制A549和H1975細(xì)胞增殖 通過RT‐qPCR和Western blot檢測(cè)DEPDC1在shRNA組和對(duì)照中的表達(dá)，以確認(rèn)DEPDC1的敲低效率。shRNA組中的DEPDC1在mRNA和蛋白質(zhì)水平上均得到顯著抑制（圖4）。因此，在A549和H1975細(xì)胞系中成功構(gòu)建了有效的DEPDC1敲低細(xì)胞模型。為了探索DEPDC1在A549和H1975細(xì)胞增殖中的作用，進(jìn)行了細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)和CCK‐8實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，敲低DEPDC1顯著抑制了A549和H1975細(xì)胞增殖（圖5）。

圖 4 在A549和H1975細(xì)胞系中穩(wěn)定敲低DEPDC1。A：使用RT-qPCR檢測(cè)DEPDC1 mRNA的表達(dá)；B：使用Western blot檢測(cè)DEPDC1蛋白表達(dá)。*P<0.05。Fig 4 Stably knock down DEPDC1 in A549 and H1975 cell lines. A: Detected the mRNA expression using RT-qPCR; B: Detected the protein expression using Western blot .*P<0.05. RT-qPCR: reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction.

圖 5 DEPDC1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。A：正常和敲低組A549和H1975細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)；B：正常和敲低組A549和H1975 CCK-8實(shí)驗(yàn)。*P<0.05。Fig 5 DEPDC1 promotes the proliferation of tumor cells. A: Cell colony formation assay in shRNA and scramble cells of A549 and H1975; B: CCK-8 assay in shRNA and scramble cells of A549 and H1975. *P<0.05.

3 討論

肺癌已經(jīng)對(duì)當(dāng)今世界各地的人們?cè)斐闪藝?yán)重的健康威脅，發(fā)現(xiàn)肺癌新的治療靶標(biāo)和藥物勢(shì)在必行。部分患者可能僅有咳嗽和咳痰[14]的癥狀，常常易被斷為呼吸道疾病、咽炎、氣道過敏等，早期診斷和精確治療是防治肺腺癌的有效手段。但是，肺腺癌的早期檢測(cè)非常困難，早期的篩查方法是低劑量計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography, CT）。肺腺癌的各種生物標(biāo)志物已被用于臨床診斷，如癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA）、癌抗原125（cancer antigen 125, CA125）等，這些標(biāo)志物對(duì)肺腺癌[15]的早期診斷具有重要意義，但這些生物標(biāo)志物仍不具備早期特異性地檢測(cè)肺腺癌的能力。

DEPDC1在多數(shù)腫瘤中被證實(shí)高表達(dá)，Amisaki等[12]發(fā)現(xiàn)與正常肝臟相比，肝細(xì)胞癌患者的癌組織的DEPDC1上調(diào)，DEPDC1在腫瘤組織中的高表達(dá)與腫瘤進(jìn)展和不良預(yù)后有關(guān)。Feng等[16]發(fā)現(xiàn)，與正?；蚍悄[瘤組織相比，DEPDC1在鼻咽癌組織中的mRNA和蛋白水平均過表達(dá)，siRNA介導(dǎo)的DEPDC1缺失顯著抑制了鼻咽癌細(xì)胞系CNE‐1和HNE‐1的增殖。Gong等[10]也發(fā)現(xiàn)了，與相鄰正常胃組織相比，DEPDC1在胃腺癌組織中過表達(dá)，并且DEPDC1表達(dá)水平與癌癥轉(zhuǎn)移和分化顯著相關(guān)。上述研究與我們所發(fā)現(xiàn)的“DEPDC1在肺腺癌中的高度表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)”的結(jié)論是一致的，我們通過對(duì)收集到的65例樣本進(jìn)行分析后，發(fā)現(xiàn)DEPDC1在癌組織中的表達(dá)量比正常肺組織顯著增高，并且經(jīng)過敲低DEPDC1后，癌細(xì)胞系克隆增殖明顯受到抑制。

關(guān)于DEPDC1在腫瘤中的作用機(jī)制已有部分研究。Guo等[17]研究表明，DEPDC1通過CCL20/CCR6通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和血管生成。Kikuchi等[18]發(fā)現(xiàn)了在小鼠膠質(zhì)瘤模型中，DEPDC1在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和組織中表達(dá)增加。小干擾RNA （siRNA）抑制內(nèi)源性DEPDC1表達(dá)可通過NF‐κB信號(hào)通路抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。上述研究均表明，DEPDC1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演了重要角色，而關(guān)于DEPDC1在肺腺癌中的作用機(jī)制，Wang等[19]研究表明DEPDC1在肺腺癌組織中上調(diào)，并且DEPDC1通過RAS‐ERK1/2信號(hào)傳導(dǎo)抑制A549、HCC827和H1993細(xì)胞的自噬。前文提到的Wang等[19]研究表明DEPDC1通過抑制A20表達(dá)來調(diào)節(jié)NF‐κB活性，從而抑制A549細(xì)胞的凋亡。關(guān)于二者之間的具體作用機(jī)制有待我們進(jìn)一步去探究。

綜上所述，我們的研究初步證明了DEPDC1在肺腺癌中高表達(dá)與臨床分期、腫瘤大小相關(guān)，并與OS存在顯著相關(guān)性，故DEPDC1可能是肺腺癌的一項(xiàng)新的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。我們的結(jié)果有助于進(jìn)一步理解DEPDC1與肺腺癌之間的關(guān)系，鑒于二者的關(guān)系，通過深入的機(jī)制探究，DEPDC1有可能成為肺腺癌的一個(gè)潛在的生物標(biāo)志物。但是我們的研究中所納入的病例數(shù)量較少，可能存在一些統(tǒng)計(jì)誤差。此外GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)的樣本數(shù)據(jù)也可能存在一定的誤差。我們未能對(duì)其具體機(jī)制進(jìn)行探究，這是我們下一步將去完成的工作。下一步我們將構(gòu)建小鼠模型，并通過基因芯片、高通量測(cè)序等技術(shù)，以探究二者間具體作用機(jī)制。

Author contributions

Shen J conceived and designed the study, and performed the experiments. Xi MM collected and analyzed the data. All the authors had access to the data. All authors read and approved the final manuscript as submitted.