復(fù)方保肝寧減輕小鼠肝纖維化的機(jī)制：抑制肝臟組織中的IDO1進(jìn)而促進(jìn)樹突狀細(xì)胞表型成熟

莫 嬋，謝淑雯，高 磊，呂志平

南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州510515

現(xiàn)代醫(yī)家多認(rèn)為肝纖維化屬于中醫(yī)“癥瘕、黃疸、脅痛”等病癥范疇［1］。呂志平教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)提出其病因病機(jī)多為“濕熱余毒未盡，肝郁氣滯，淤熱互結(jié)阻絡(luò)”，其中濕熱疫毒與脾虛血瘀是關(guān)鍵［2,3］，并設(shè)計(jì)出新方保肝寧用于治療以此類病機(jī)為主的肝纖維化患者，療效顯著［4,5］。該方主要由白背葉根、丹參、莪術(shù)、黃芪、三七等組成，諸藥合用共奏清熱祛濕解毒、活血化瘀軟堅(jiān)、益氣疏肝健脾之效［6］。保肝寧復(fù)方對肝炎后肝纖維化患者的臨床癥狀、體征、主要理化指標(biāo)有明顯的改善作用，臨床使用安全，無明顯副作用，值得臨床大力推廣應(yīng)用［7］。為了推廣其臨床應(yīng)用及增加國際化應(yīng)用的可能性，使更多的臨床患者收益，亟需對保肝寧治療肝纖維化作用的分子機(jī)制展開深入研究。

研究表明免疫應(yīng)答紊亂是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的重要因素。樹突狀細(xì)胞作為抗原遞呈細(xì)胞，在肝臟免疫微環(huán)境中尤為重要［7-9］。有學(xué)者指出慢性乙型病毒性肝炎患者體內(nèi)的樹突狀細(xì)胞存在功能減弱，數(shù)量減少的病理變化［10,11］。作為一種關(guān)鍵的免疫微環(huán)境調(diào)控因子，吲哚胺2,3-雙加氧酶1（IDO1）與免疫系統(tǒng)的調(diào)控密切相關(guān)。抑制IDO1的活性可顯著降低免疫性肝炎小鼠肝組織中F4/80+巨噬細(xì)胞、LY6G+中性粒細(xì)胞、CD11b+單核細(xì)胞及CD3+T 細(xì)胞的浸潤［12］。IDO1的基因缺失可使肝纖維化小鼠肝組織中IL-17a、IL-6、TNF-α和TGF-β炎癥因子水平及Th17細(xì)胞浸潤減少［13］。我們前期的研究結(jié)果表明IDO1在肝纖維化小鼠肝組織中顯著上調(diào)且IDO1可與Nrf2相互拮抗調(diào)節(jié)肝纖維化小鼠樹突狀細(xì)胞的成熟［8］。然而，關(guān)于保肝寧復(fù)方是否也可以通過調(diào)控IDO1的表達(dá)繼而影響樹突狀細(xì)胞的成熟發(fā)揮抗肝纖維化作用仍然未知。因此，本研究擬構(gòu)建四氯化碳（CCL4）所致的小鼠化學(xué)性肝纖維化，觀察保肝寧復(fù)方對實(shí)驗(yàn)性肝纖維化的影響，并試圖探索IDO1的表達(dá)及樹突狀細(xì)胞的功能狀態(tài)在保肝寧復(fù)方抗肝纖維化過程中發(fā)揮的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 雄性C57BL/6小鼠60只，體質(zhì)量18～22 g，SPF級，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號：SYXK（粵）2013-0034。

1.1.2 藥物 中藥復(fù)方保肝寧各組成成份購于廣州康美藥業(yè)，經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)中藥鑒定與藥用植物教研室專家鑒定、水煎后，75 ℃水浴濃縮，制成高、中、低濃度組（含生藥量分別為3.51、1.76、0.88 g/mL，其中低劑量組相當(dāng)于成人等效劑量）。秋水仙堿（陽性對照藥），購自西雙版納版納藥業(yè)有限責(zé)任公司（國藥準(zhǔn)字號：H53021369），使用前12 h研碎制成0.01 mg/mL懸濁液。

1.1.3 主要試劑 四氯化碳溶液（SIGMA），EGTA（APExBIO），Ⅳ型膠原酶（Gibco），DNA酶（SIGMA），CD16/CD32（BD），CD11c-PE-CY7（BD），CD80-BV421（BD），CD86-BV605（BD），CD40-PE（BD），MHCIIAF488（BD），7-AAD（BD）。AST、ALT檢測試劑盒均購自南京建成生物工程技術(shù)研究所。天狼星紅苦味酸染色液（phygene）。IDO1 過表達(dá)腺相關(guān)病毒（AAV9-IDO1）購自上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司。免疫組化染色試劑盒（上?；蚩萍加邢薰荆?。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組、造模及給藥 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，根據(jù)小鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為對照組、模型組、秋水仙堿組和保肝寧低、中、高濃度組。參照參考文獻(xiàn)［8］，除對照組予以腹腔注射微量純橄欖油溶液0.6 mL/（kg·d）外，其余各組予以等體積CCl4 橄欖油溶液（CCl4∶橄欖油=1∶3）注射，3次/周，持續(xù)8 周。各組按照0.2 mL/10 g的灌胃體積予以相應(yīng)的受試藥物灌胃。對照組與模型組給予生理鹽水灌胃，陽性對照組予以2 mg/kg秋水仙堿灌胃，保肝寧低、中、高濃度組分別予以0.88、1.76、3.51 g/mL保肝寧灌胃，持續(xù)8周。另取正常野生型小鼠分為腺相關(guān)病毒陰性對照干預(yù)組、IDO1過表達(dá)腺相關(guān)病毒干預(yù)組及高濃度保肝寧+IDO1過表達(dá)腺相關(guān)病毒聯(lián)合干預(yù)組。將IDO1過表達(dá)腺相關(guān)病毒干預(yù)組及高濃度保肝寧+IDO1過表達(dá)腺相關(guān)病毒聯(lián)合干預(yù)組小鼠置于固定器內(nèi)，露出尾巴，選取尾部一條側(cè)靜脈，掐住尾巴根部，使靜脈充血膨脹，用75%酒精浸泡過的棉球反復(fù)擦拭尾部，在消毒的基礎(chǔ)上使靜脈進(jìn)一步膨脹。向上斜插針頭進(jìn)入靜脈，回抽有血，證明針頭進(jìn)入靜脈，緩慢將IDO1過表達(dá)腺相關(guān)病毒注射入小鼠體內(nèi)（3×1011v.g/只）。注射完畢后按壓3 min止血，觀察小鼠情況。另腺相關(guān)病毒陰性對照干預(yù)組注射等量空載病毒。高濃度保肝寧+IDO1過表達(dá)腺相關(guān)病毒聯(lián)合干預(yù)組小鼠同時(shí)給予3.51 g/mL保肝寧灌胃，其余各組給予等體積生理鹽水灌胃，4周后處死小鼠。所有動(dòng)物處理和程序均經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物保護(hù)和使用委員會批準(zhǔn)（S2017040，S2017043）。

1.3 指標(biāo)檢測方法

1.3.1 血清指標(biāo)AST、ALT的檢測 分離小鼠血清，嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行檢測。

1.3.2 肝組織病理學(xué)檢測 取小鼠肝左葉用4%多聚甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋、切片，分別做HE、天狼星紅染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理變化情況。

1.3.3 免疫組化法檢測小鼠肝組織α-SMA及IDO1的表達(dá) 肝臟石蠟切片常規(guī)烤片、封閉、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶后分別滴加α-SMA及IDO1一抗（稀釋濃度1∶250），4 ℃過夜孵育，后續(xù)步驟按照免疫顯色試劑盒進(jìn)行，中性樹膠封片后在光學(xué)顯微鏡下觀察蛋白表達(dá)情況。

1.3.4 Western blot檢測肝臟IDO1蛋白表達(dá)水平 將肝臟組織加入裂解液制成肝勻漿，離心取上清液。測定上清蛋白濃度，加入上樣緩沖液，10%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，BSA室溫封閉2 h，一抗（IDO1）4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌3次。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色曝光，分析。

1.3.4 肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的分離 根據(jù)參照文獻(xiàn)［6,14］分離肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞：小鼠麻醉后，取腹正中切口，逐層剪開，開腹暴露下腔靜脈及門靜脈，靜脈留置針在下腔靜脈穿刺，快速注入EGTA（190 mg/L）沖洗肝臟以避免紅細(xì)胞污染及肝臟血管凝血，再以1 mL/min 注入約50 mL濃度為0.5 mg/mL的Ⅳ型膠原酶（含1%2 mg/mL DNA酶）消化。取出肝臟，撕開肝臟表面包膜，搗碎肝組織，再以0.5 mg/mL 的Ⅳ型膠原酶（含1%2 mg/mL DNA酶）體外繼續(xù)消化20 min。消化后細(xì)胞混懸液經(jīng)70 μmol/L細(xì)胞濾網(wǎng)過濾。濾液以50 g離心3 min，收集上清備用。

1.3.5 肝臟DCs表型變化及T細(xì)胞增殖情況的檢測 將上述獲得的肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞懸液調(diào)整至細(xì)胞密度為1×106/mL；取100 μL 細(xì)胞懸液先加入0.5 μL CD16/32冰上孵育5 min 阻斷非特異性染色，350 g，5 min，棄上清。隨后，各管按照檢測類型加入相應(yīng)的抗體染色液，檢測肝臟DCs表型變化的抗體染色液配置：CD11C-PECY7，CD80-BV421，CD86-BV605，CD40-PE，MHCIIAF488 各1 μL；檢測T 細(xì)胞亞群的抗體染色液配置：CD-APC-CY7，CD4-PE，CD8a-FITC各1 μL。常溫孵育30 min后加入1 mL含2%FBS的PBS洗1次，1000 r/min，5 min，棄上清。再加入5 μL7-AAD孵育10 min標(biāo)記死細(xì)胞，隨后加入1 mL 含2%FBS的PBS洗1次，1000 r/min，5 min，棄上清。加500 μL含2%FBS的PBS重懸，上機(jī)待測。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 22.0軟件分析數(shù)據(jù)、Graph Pad Prism7.0作圖，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，若方差齊性，組間兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)；若方差不齊，組間比較采用Dunnett's T3法檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 保肝寧對CCl4所誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠的影響

對照組小鼠肝組織僅在匯管區(qū)見極少量紅色纖維增生，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，無假小葉形成（圖1A、B）。模型組小鼠肝組織匯管區(qū)及小葉間見大量紅色膠原纖維并形成纖維間隔，可見假小葉結(jié)構(gòu)，天狼星紅陽性染色面積較對照組明顯增多（P=0.003）。與模型組比較，保肝寧低濃度組小鼠肝組織膠原纖維明顯減少，假小葉結(jié)構(gòu)減少，肝小葉破壞程度減輕，但其差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.223）；其中保肝寧中、高濃度組小鼠肝組織僅在匯管區(qū)見少量膠原纖維形成，未見明顯假小葉結(jié)構(gòu)形成，肝小葉結(jié)構(gòu)較完整（P=0.001；P=0.028）。

與對照組比較，模型組小鼠血清AST（P=0.02）、ALT（P=0.001）水平均顯著升高（圖1C、D）。與模型組比較，秋水仙堿干預(yù)后可使肝纖維化小鼠血清AST、ALT水平明顯下降（P=0.011；P=0.012）。保肝寧低、中濃度組小鼠血清AST平均水平較模型組降低，但其差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.074；P=0.128），保肝寧高濃度組可顯著降低肝纖維化小鼠血清AST 水平（P=0.041）。保肝寧中、高濃度組小鼠血清ALT水平均較模型組顯著降低（P=0.003；P=0.001）。

圖1 保肝寧對CCL4所誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠的影響Fig.1 Effects of BGN on CCl4-induced liver fibrosis in mice.A:Histopathological changes in the liver shown by HE staining and Sirius Red staining(Original magnification:×100).B:Positive staining area for Sirius red measured using image J software and quantified in a bar graph.C,D:Serum concentrations ofAST andALT,respectively.Data are presented as Mean±SD.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

2.2 保肝寧對CCl4 所誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠肝臟中α-SMA、IDO1表達(dá)水平及肝臟DCs數(shù)量的影響

與對照組比較，模型組小鼠肝組織中α-SMA的表達(dá)明顯上升（P=0.002），表達(dá)的陽性物質(zhì)呈黃色，主要分布在匯管區(qū)、肝竇Disse間隙及纖維間隔等纖維區(qū)。與模型組相比，秋水仙堿組α-SMA 表達(dá)明顯降低（P=0.001），僅在肝竇Disse間隙見極少量表達(dá)；保肝寧低、中、高濃度組治療后，α-SMA的表達(dá)水平均較模型組顯著下降（P=0.004；P=0.003；P=0.002），在匯管區(qū)、肝竇間隙及纖維組織等見少量α-SMA表達(dá)（圖2A、B）。

Western blot結(jié)果顯示：與對照組比較，模型組小鼠肝組織中IDO1的蛋白表達(dá)水平明顯增多（P=0.024）。與模型組比較，保肝寧低、中濃度組小鼠肝組織IDO1平均表達(dá)水平均較模型組降低，但其差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.204；P=0.15，圖2C、D），保肝寧高濃度組可顯著降低肝纖維化小鼠肝臟中IDO1 蛋白水平（P=0.031，圖2C、D）。

本研究以CD11C+DCs標(biāo)記樹突狀細(xì)胞。模型組小鼠肝臟中CD11C+DCs細(xì)胞較對照組顯著下降（P=0.000，圖2E、F）。保肝寧低、中濃度組小鼠肝臟中CD11C+DCs細(xì)胞比例的平均水平均較模型組升高，但其差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.627；P=0.188），保肝寧高濃度組可顯著上調(diào)肝纖維化小鼠肝臟中CD11C+DCs細(xì)胞比例（P=0.003）。

圖2 保肝寧對肝纖維化小鼠肝臟中α-SMA、IDO1表達(dá)水平及肝臟CD11C+DCs數(shù)量的影響Fig.2 Effects of BGN on expression levels of α-SMA,IDO1 and frequencies of hepatic CD11c+DCs in the liver of the mice with liver fibrosis.A,B:Immunohistochemistry for hepatic α-SMA expression(×200)and positive staining area measured using image J software and quantified in a bar graph.C,D:Western blotting for hepatic IDO1 expression and semi-quantitative analysis of the results(GAPDH as the loading control).E,F:Flow cytometry and summary data showing the percentage of hepatic CD11C+DC cells in hepatic NPCs.Data are presented as Mean±SD.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

2.3 保肝寧對CCL4所誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠肝臟中DCs表型的影響

與對照組比較，模型組小鼠肝臟CD11C+CD80+DCs、CD11C+CD86+DCs細(xì)胞比例顯著降低（P=0.000；P=0.007）。保肝寧低、中濃度干預(yù)組小鼠肝臟中CD11C+CD80+DCs（P=0.153；P=0.69）、CD11C+CD86+DCs（P=0.254；P=0756）細(xì)胞比例的平均水平均較模型組小鼠升高，但其差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組比較，保肝寧高濃度干預(yù)組小鼠肝臟CD11C+CD80+DCs、CD11C+CD86+DCs 細(xì)胞比例顯著升高（P=0.01；P=0.008，圖3A、B、E、F）。

與對照組比較，模型組小鼠肝臟中CD11C+CD40+DCs細(xì)胞比例平均水平呈下降趨勢，但其差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.14）。保肝寧低、中濃度干預(yù)組小鼠肝臟中CD11C+CD40+DCs細(xì)胞比例的平均水平均較模型組小鼠升高，但其差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.354；P=0.182）。保肝寧高濃度干預(yù)組小鼠肝臟中CD11C+CD40+DCs細(xì)胞比例較模型組小鼠顯著升高（P=0.04，圖3C、G）。

與對照組比較，模型組小鼠肝臟CD11C+MHCII+DCs細(xì)胞比例平均水平明顯下降（P=0.019）。保肝寧低、高濃度干預(yù)組小鼠肝臟CD11C+MHCII+DCs 細(xì)胞比例均較模型組小鼠顯著升高（P=0.039；P=0.019，圖3D、H）。

圖3 保肝寧對肝纖維化小鼠肝臟中DCs表型的影響Fig.3 Effects of BGN on the phenotype of hepatic DCs in mice with liver fibrosis.A-D:Flow cytometry of hepatic CD11C+CD80+DCs,CD11C+ CD86+ DCs,CD11C+ CD40+ DCs and CD11C+ MHCII+ DCs in hepatic NPCs,respectively.E-H:The corresponding summary data of cell percentages.Data are presented as Mean±SD.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

2.4 保肝寧對CCL4所誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠肝臟中T細(xì)胞亞群的影響

模型組小鼠肝臟CD3+T細(xì)胞比例較對照組小鼠顯著降低（P=0.002）；保肝寧低、中濃度干預(yù)組小鼠肝臟CD3+T細(xì)胞比例平均水平均較模型組小鼠升高，但其差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=1.00；P=0.053）；保肝寧高濃度干預(yù)組小鼠肝臟CD3+T細(xì)胞比例較模型組小鼠顯著升高（P=0.002，圖4A、B）。

與對照組相比，模型組小鼠肝臟CD3+CD4+T細(xì)胞比例顯著降低（P=0.02）；保肝寧低濃度組小鼠肝臟CD3+CD4+T細(xì)胞比例平均水平較模型組小鼠升高，但其差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.996）；保肝寧中（P=0.033）、高濃度（P=0.001）干預(yù)組小鼠肝臟CD3+CD4+T細(xì)胞比例均較模型組小鼠顯著升高（圖4A、C）。

模型組小鼠肝臟中CD4+/CD8a+比值較對照組明顯降低（P=0.006）；保肝寧低（P=0.001）、高濃度（P=0.005）干預(yù)組小鼠肝臟CD4+/CD8a+比值較模型組小鼠顯著升高（圖4A、D）。

圖4 保肝寧對肝纖維化小鼠肝臟中T細(xì)胞亞群的影響Fig.4 Effects of BGN on hepatic T cell subsets in mice with liver fibrosis.A:Frequencies of CD3+,CD3+CD4+,and CD3+CD8+T cells in hepatic NPCs analyzed by flow cytometry and the summary data(B-D).Data are presented as Mean±SD.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

2.5 保肝寧對肝臟特異性過表達(dá)IDO1小鼠的肝組織中IDO1表達(dá)水平及DCs數(shù)量和表型的影響

免疫組化染色結(jié)果示：尾靜脈注射IDO1過表達(dá)腺相關(guān)病毒4周后，小鼠肝組織IDO1蛋白表達(dá)水平較注射空載病毒組顯著增多（P=0.000，圖5A、B）。高濃度保肝寧干預(yù)后可顯著降低IDO1過表達(dá)腺相關(guān)病毒干預(yù)小鼠肝臟中IDO1的表達(dá)水平（P=0.001，圖5A、B）。

IDO1 過表達(dá)腺相關(guān)病毒干預(yù)組小鼠肝臟中CD11C+DCs數(shù)量（P=0.026）及CD11C+CD86+DCs（P=0.002）、CD11C+CD40+DCs（P=0.001）、CD11C+MHCII+DCs（P=0.05，圖5C、G）細(xì)胞比例較腺相關(guān)病毒陰性對照干預(yù)組明顯降低，高濃度保肝寧干預(yù)后可明顯上調(diào)IDO1 過表達(dá)腺相關(guān)病毒干預(yù)小鼠肝臟中CD11C+CD40+DCs（P=0.017）、CD11C+MHCII+DCs（P=0.008）細(xì)胞比例。

圖5 保肝寧對肝臟特異性過表達(dá)IDO1小鼠的肝組織中IDO1表達(dá)水平及DCs數(shù)量和表型的影響Fig.5 Effects of BGN on the expression level of hepatic IDO1 and the number and phenotype of hepatic DCs in AAV-IDO1 infected mice.A,B:Immunohistochemistry for detecting hepatic IDO1(×100)and bar graph of the positive staining area.C-G:FACS plots(left)and summary data (right) showing the percentage of hepatic CD11C+ DCs,CD11C+ CD80+ DCs,CD11C+ CD86+ DCs,CD11C+ CD40+ DCs,and CD11C+MHCII+DCs in hepatic NPCs.Data are presented as Mean±SD.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

2.6 保肝寧對肝臟特異性過表達(dá)IDO1小鼠的肝組織中T細(xì)胞亞群的影響

IDO1過表達(dá)腺相關(guān)病毒干預(yù)組小鼠肝臟中CD3+CD4+T細(xì)胞比例較腺相關(guān)病毒陰性對照干預(yù)組顯著降低（P=0.006，圖6），高濃度保肝寧干預(yù)后可明顯上調(diào)IDO1過表達(dá)腺相關(guān)病毒干預(yù)小鼠肝臟中CD3+CD4+T細(xì)胞比例（P=0.03）。IDO1過表達(dá)腺相關(guān)病毒干預(yù)組小鼠肝臟中CD3+T（P=0.373）細(xì)胞比例、CD4+/CD8+（P=0.135）比值均較腺相關(guān)病毒陰性對照干預(yù)組降低，高濃度保肝寧干預(yù)后可上調(diào)IDO1過表達(dá)腺相關(guān)病毒干預(yù)小鼠肝臟中CD3+T細(xì)胞比例（P=0.516）、CD4+/CD8+（P=0.828）比值，但其差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖6 保肝寧對肝臟特異性過表達(dá)IDO1小鼠的肝組織中T細(xì)胞亞群的影響Fig.6 Effects of BGN on hepatic T cell subsets in AAV-IDO1-infected mice.A:Frequencies of CD3+,CD3+CD4+,and CD3+CD8+T cells in hepatic NPCs analyzed by flow cytometry and the summary data(B-D).Data are presented as Mean±SD.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

3 討論

本研究采用給小鼠腹腔注射具有肝毒性的化學(xué)物質(zhì)CCl4以誘導(dǎo)復(fù)制肝纖維化模型，是最早也是目前國內(nèi)外使用最廣泛的一種實(shí)驗(yàn)性肝纖維化模型［15］。CCl4進(jìn)入體內(nèi)可破壞線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和質(zhì)膜的滲透性，引起肝細(xì)胞的損傷與壞死［16］。我們采用單因素腹腔注射CCL4的造模方法，排除了其他復(fù)合因素的干擾，更有利于分析保肝寧的藥效作用。當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)，轉(zhuǎn)氨酶會釋放入血液，故血清中轉(zhuǎn)氨酶會升高。本研究結(jié)果示，保肝寧可顯著降低CCL4所致的肝纖維化小鼠血清中ALT、AST水平，表明保肝寧具有護(hù)肝、抑制肝細(xì)胞損傷的作用。肝纖維化的主要病理特征是活化的肝星狀細(xì)胞（HSC）產(chǎn)生大量的膠原纖維和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的過度沉積［17］。α-SMA的表達(dá)是HSC早期被激活的標(biāo)記。目前，以抑制肝星狀細(xì)胞活化為靶點(diǎn)的治療方法已成為肝纖維化的研究熱點(diǎn)［18］。本研究病理切片示模型組小鼠肝組織中見大量纖維結(jié)締組織，并形成纖維間隔把肝小葉分割成假小葉，說明本研究肝纖維化模型復(fù)制成功。保肝寧可以減少肝纖維化小鼠肝組織中膠原纖維的形成，改善肝組織病理結(jié)構(gòu)。表明保肝寧具有抑制膠原蛋白的沉積，減輕肝纖維化程度的作用。此外，模型組小鼠肝組織見大量α-SMA表達(dá)，表明HSC活化水平增多，予以保肝寧治療后可顯著降低肝組織中α-SMA的表達(dá)水平，即抑制了HSC 的活化，提示保肝寧可能通過抑制HSC的活化繼而延緩肝纖維化的病理進(jìn)程。

肝纖維化是組織細(xì)胞損傷和修復(fù)的免疫應(yīng)答過程［19］。IDO1是肝臟外唯一可以催化色氨酸分解代謝的限速酶，是一種抑制性免疫調(diào)節(jié)酶［13］。多項(xiàng)研究表明IDO1可在單核-巨噬細(xì)胞、DCs等免疫細(xì)胞中表達(dá)，負(fù)責(zé)各種免疫調(diào)節(jié)功能［20-22］。DCs是目前已發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)的專職抗原呈遞細(xì)胞，成熟DCs是體內(nèi)免疫反應(yīng)的重要媒介，進(jìn)一步激活T細(xì)胞并參與免疫應(yīng)答過程或通過免疫耐受來維持機(jī)體的免疫平衡狀態(tài)［23,24］。成熟DCs的表面高表達(dá)CD80、CD86、CD40和MHCII等黏附分子，對抗原加工提呈能力很強(qiáng)，而對抗原的攝取能力減弱［25-27］。因此，肝纖維化過程中可能伴隨著IDO1表達(dá)水平的變化及DCs表型和其下游T細(xì)胞的改變。已有臨床研究表明肝纖維化分級越高，慢性乙型肝炎患者外周血DCs的數(shù)量越低。DCs數(shù)目下降和功能減弱是慢性乙型肝炎患者重要的病理特征［10,11］。與臨床研究結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)肝纖維化小鼠肝臟中IDO1表達(dá)水平顯著升高的同時(shí)CD11C+DCs、CD11C+CD80+DCs、CD11C+CD86+DCs、CD11C+MHCII+DCs細(xì)胞比例較對照組顯著降低。更重要的是，保肝寧干預(yù)后可顯著降低肝纖維化小鼠肝組織中IDO1 表達(dá)水平，上調(diào)CD11C+DCs、CD11C+CD80+DCs、CD11C+CD86+DCs、CD11C+CD40+DCs、CD11C+MHCII+DCs細(xì)胞比例，說明保肝寧能有效的下調(diào)肝纖維化小鼠肝臟中IDO1表達(dá)、增加DCs數(shù)量和其表面成熟分子的表達(dá)。同時(shí)，模型組小鼠肝臟CD3+T、CD3+CD4+T細(xì)胞比例與對照組比較均呈低水平，予以保肝寧治療后可使肝纖維化小鼠肝臟中CD3+T、CD3+CD4+T細(xì)胞比例顯著上調(diào)。說明保肝寧可降低肝纖維化小鼠肝臟中IDO1表達(dá)水平，同時(shí)改變DCs的成熟表型，促進(jìn)DCs功能的恢復(fù)。研究表明，調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞的功能、抑制IDO1的表達(dá)均可抑制肝纖維化的進(jìn)展［28,29］。為了進(jìn)一步驗(yàn)證保肝寧的分子機(jī)制，本課題組利用保肝寧干預(yù)肝臟中特異性過表達(dá)IDO1的小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)保肝寧可有效降低IDO1過表達(dá)腺相關(guān)病毒干預(yù)組小鼠肝臟中IDO1 的表達(dá)水平、CD11C+CD40+DCs、CD11C+MHCII+DCs細(xì)胞比例和CD3+CD4+T細(xì)胞比例。因此，本實(shí)驗(yàn)不僅揭示了保肝寧能夠通過抑制IDO1的表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮促進(jìn)DCs成熟和刺激T細(xì)胞增殖的免疫調(diào)節(jié)作用，還證實(shí)了保肝寧具有治療抗肝纖維化的潛能。

保肝寧是以“活血化瘀”為基本治則，兼以“清熱解毒、軟堅(jiān)、益氣健脾、疏肝理氣”等多途徑發(fā)揮抗肝纖維化的藥效。本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)保肝寧能有效防治實(shí)驗(yàn)性小鼠肝纖維化的形成，其作用機(jī)制可能與保護(hù)肝細(xì)胞損傷、抑制膠原蛋白的形成、改善肝臟免疫應(yīng)答等相關(guān)，有助于詮釋保肝寧多途徑、多層次抗肝纖維化的科學(xué)內(nèi)涵，為保肝寧更好地應(yīng)用于臨床提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。