長(zhǎng)期施肥對(duì)紅壤稻田土壤微生物生物量和酶活性的影響*

夏文建，柳開樓，張麗芳，劉 佳，葉會(huì)財(cái)，鄧國(guó)強(qiáng)，李大明，李祖章，王 萍，李 瑤，楊成春，彭春瑞，陳 金?

（1. 江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與資源環(huán)境研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長(zhǎng)江中下游作物生理生態(tài)與耕作重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家紅壤改良工程技術(shù)研究中心，南昌 330200；2. 江西省紅壤研究所，南昌 330046）

在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分循環(huán)中，土壤胞外酶活性（extracellular enzyme activities，EEAs）與土壤功能密切相關(guān)，能夠反映土壤養(yǎng)分狀況，是表征土壤肥力和土壤質(zhì)量的重要指標(biāo)之一[1-2]。同時(shí)，土壤胞外酶活性與土壤微生物活動(dòng)密切相關(guān)，可以較為全面地反映土壤微生物群落的功能特征，在土壤生態(tài)系統(tǒng)和土壤質(zhì)量評(píng)價(jià)中受到廣泛關(guān)注[3]。施肥[4-5]，特別是氮[6-7]、磷[8]等養(yǎng)分投入對(duì)土壤酶活性的影響已有較多研究，一般認(rèn)為養(yǎng)分的投入會(huì)增加土壤微生物生物量，刺激微生物產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的酶，引起土壤胞外酶活性的增加，尤其以化肥和有機(jī)肥配施的效果最佳[9-11]。

魏亮等[12]研究了水稻不同生育期根際與非根際EEAs對(duì)施氮的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)根際和非根際影響胞外酶活性的因素不同，土壤酶活性與多種環(huán)境因子存在復(fù)雜關(guān)系。在長(zhǎng)期不同比例有機(jī)肥替代化肥的試驗(yàn)條件下，土壤碳氮比是影響EEAs的主要因素之一[13]。而長(zhǎng)期施用化肥和不同有機(jī)肥處理?xiàng)l件下，EEAs與水溶性有機(jī)碳之間有更強(qiáng)的相關(guān)性[14]。調(diào)控物質(zhì)循環(huán)的水解酶或氧化還原酶活性受到了對(duì)應(yīng)的土壤養(yǎng)分狀況影響[14-15]。然而，由于供試土壤和試驗(yàn)環(huán)境的差異，不同研究者所獲得的研究結(jié)果不盡一致?，F(xiàn)有研究更關(guān)注長(zhǎng)期施肥對(duì)土壤養(yǎng)分和微生物群落的影響[16]，對(duì)于土壤生物活性和功能研究相對(duì)較少，或者僅選擇2～3種土壤胞外酶描述土壤功能[8，12]，關(guān)于長(zhǎng)期施肥對(duì)土壤碳、氮、磷等養(yǎng)分物質(zhì)循環(huán)相關(guān)胞外酶活性總體分布特征的研究不多。土壤胞外酶活性可以較為全面地指示土壤生境變化和生態(tài)功能特征，且對(duì)土壤環(huán)境變化敏感[1，17]。因此，開展長(zhǎng)期施肥土壤胞外酶活性特征及與環(huán)境因子的關(guān)系研究，對(duì)于深入理解碳、氮、磷等養(yǎng)分物質(zhì)循環(huán)過程具有重要意義[17-18]。

為了研究長(zhǎng)期施肥對(duì)紅壤稻田土壤胞外酶活性（EEAs）的影響及其驅(qū)動(dòng)因子，本文利用持續(xù)了37 a的長(zhǎng)期定位試驗(yàn)，采用微孔板熒光法測(cè)定了土壤α-葡萄糖苷酶（AG）、β-葡萄糖苷酶（BG）、纖維素水解酶（CBH）、乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAG）、酸性磷酸酶（ACP）和酚氧化酶（POX）等6種酶，涵蓋了土壤C、N、P等養(yǎng)分循環(huán)和有機(jī)物氧化，同時(shí)分析了土壤化學(xué)指標(biāo)和土壤微生物生物量碳氮，通過主成分分析和冗余分析探討土壤胞外酶分布特征及其與土壤養(yǎng)分和微生物生物量的關(guān)系，以期解析長(zhǎng)期施肥影響EEAs特征的關(guān)鍵因子，為紅壤稻田肥力培育提供微生物酶學(xué)方面的理論參考。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

紅壤稻田長(zhǎng)期定位試驗(yàn)位于進(jìn)賢縣張公鎮(zhèn)江西省紅壤研究所（116°20′24″N、28°15′30″E）。平均海拔30 m，屬中亞熱帶季風(fēng)氣候，年均氣溫17.6 ℃，有效積溫5 528 ℃；年降水量1 785 mm，無霜期約280 d，日照時(shí)數(shù)1 950 h。

長(zhǎng)期定位試驗(yàn)始于1981年[19]，種植制度為雙季稻。供試土壤為第四紀(jì)紅色黏土發(fā)育的水稻土。試驗(yàn)前土壤耕層基礎(chǔ)肥力狀況為：土壤pH 6.9，有機(jī)碳16.3 g·kg-1，全氮1.49 g·kg-1，全磷0.48 g·kg-1，全鉀10.39 g·kg-1，堿解氮150.4 mg·kg-1，有效磷4.15 mg·kg-1，速效鉀80.52 mg·kg-1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究選擇長(zhǎng)期定位試驗(yàn)中的4個(gè)處理，分別為：不施肥（CK）、化肥（NPK）、2倍氮磷鉀（HNPK）和氮磷鉀+有機(jī)肥（NPKM）。小區(qū)面積46.67 m2，3次重復(fù)。每季施肥量：氮肥純N 90 kg·hm-2，磷肥P2O545 kg·hm-2，鉀肥K2O 75 kg·hm-2，有機(jī)肥22 500 kg·hm-2。肥料品種氮肥為尿素，磷肥為鈣鎂磷肥，鉀肥為氯化鉀。有機(jī)肥早稻為紫云英，晚稻為豬糞。根據(jù)多年結(jié)果計(jì)算[19-20]，紫云英和豬糞帶入的純氮、P2O5、K2O分別為27 kg·hm-2、17.0 kg·hm-2、28.5 kg·hm-2和 33.8 kg·hm-2、58.0 kg·hm-2、33.9 kg·hm-2。氮肥60%作基肥，剩下的40%于水稻返青后作追肥施用；鉀肥全部于水稻返青后作追肥施用；磷肥和有機(jī)肥全部作基肥。所有小區(qū)的播種、移栽、灌溉和打藥等日常管理措施與當(dāng)?shù)亓?xí)慣相同。

1.3 研究方法

2017年晚稻收獲后，每小區(qū)S型采集0～20 cm耕層土壤樣品。按四分法分出1/2鮮樣分析土壤胞外酶活性和微生物生物量，剩余1/2樣品攤勻風(fēng)干，磨細(xì)過篩分析土壤理化性質(zhì)。水稻產(chǎn)量為周年早稻和晚稻產(chǎn)量之和，由小區(qū)實(shí)測(cè)產(chǎn)量換算。

土壤化學(xué)性質(zhì)采用常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定[21]：土壤pH（2.5︰1）采用酸度計(jì)電位法；土壤有機(jī)碳（SOC）采用重鉻酸鉀外加熱法測(cè)定。全氮（TN）用半微量凱氏法測(cè)定；全磷（TP）用堿熔－鉬銻抗比色法測(cè)定；堿解氮（AN）用堿解擴(kuò)散法測(cè)定；有效磷（AP）用Olsen法測(cè)定；速效鉀（AK）用1 mol·L-1NH4OAc浸提－火焰光度法測(cè)定。土壤微生物生物量碳（MBC）和微生物生物量氮（MBN）采用氯仿熏蒸培養(yǎng)法測(cè)定[22]。

土壤胞外酶活性采用96微孔酶標(biāo)板熒光分析法測(cè)定[23]。AG、BG和CBH催化葡萄糖和纖維素水解，是與土壤碳循環(huán)有關(guān)的酶；NAG催化幾丁質(zhì)和肽聚糖水解，是與土壤氮循環(huán)有關(guān)的酶；ACP催化有機(jī)磷水解，是與土壤磷循環(huán)有關(guān)的酶；POX催化酚類物質(zhì)氧化，是與土壤腐殖化過程等相關(guān)的酶[16，24]。用甲基傘形酮（4-methylumbelliferyl，4-MUB）作為底物標(biāo)示水解酶活性，用 L-二羥苯丙氨酸（L-3,4-dihydroxyphenylalanine，L-DOPA）為底物標(biāo)示酚氧化酶（POX）活性，利用多功能酶標(biāo)儀在激發(fā)波長(zhǎng)365 nm、發(fā)射波長(zhǎng)450 nm的條件下測(cè)定。測(cè)定的6種土壤胞外酶的名稱、縮寫、功能、底物和國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)編碼（EC編碼）見表1。

表1 土壤胞外酶名稱、縮寫、所用底物和國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)編碼Table 1 Names，abbreviations，substrates used and International Enzyme Commission number of the soil extracellular enzymes involved in the study

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2016整理、計(jì)算和繪圖，圖表數(shù)據(jù)為平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤（SE），運(yùn)用SPSS 17.0進(jìn)行相關(guān)性分析、單因素方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)（最小顯著差異（LSD）法，P＜0.05）。采用Canoco 5.0軟件進(jìn)行主成分分析（PCA）和冗余分析（RDA）。

2 結(jié) 果

2.1 長(zhǎng)期施肥對(duì)土壤化學(xué)性質(zhì)和水稻產(chǎn)量的影響

經(jīng)過37 a的長(zhǎng)期不同施肥處理，土壤化學(xué)性質(zhì)和水稻產(chǎn)量發(fā)生了顯著變化（表2）。與CK處理相比，NPK處理顯著提高了土壤SOC、AN和AP含量，HNPK處理顯著提高了土壤SOC和氮、磷、鉀養(yǎng)分含量；與NPK處理相比，HNPK處理顯著提高了土壤TP、AP和AK；而NPKM處理與HNPK處理相比，顯著提高了SOC和氮、磷、鉀等養(yǎng)分含量。與CK處理相比，施肥處理土壤pH均有所下降，但未達(dá)到顯著水平。各施肥處理周年水稻產(chǎn)量較CK處理增加了81.4%～158.4%。

表2 長(zhǎng)期施肥下的土壤化學(xué)性質(zhì)和水稻產(chǎn)量Table 2 Soil chemical properties and rice yield of the paddy fields under long-term fertilization

2.2 長(zhǎng)期施肥對(duì)土壤微生物生物量的影響

長(zhǎng)期施肥土壤MBC和MBN呈增加的趨勢(shì)（圖1）。NPK處理土壤MBC和MBN較CK處理增加了20.8%和33.6%；與CK相比，HNPK和NPKM處理顯著提高了土壤MBC和MBN（P＜0.05），其中，HNPK處理土壤MBC和MBN分別增加了41.1%和42.9%，NPKM處理則分別增加了60.2%和60.4%。

2.3 長(zhǎng)期施肥對(duì)土壤胞外酶活性的影響

長(zhǎng)期施肥改變了土壤EEAs狀況（表3），不同土壤胞外酶對(duì)施肥的響應(yīng)存在差異。與不施肥（CK）相比，NPK處理顯著提高了AG和NAG活性；HNPK處理顯著提高了AG和NAG活性，顯著降低了ACP和POX活性；NPKM處理AG、BG、NAG和ACP活性分別提高12.7%、41.1%、36.2%和50.0%，POX活性顯著下降29.7%（P＜0.05）。各施肥處理CBH活性略有增加，但處理之間差異均不顯著。

表3 長(zhǎng)期施肥下的土壤胞外酶活性Table 3 Activities of soil extracellular enzyme as affected by long-term fertilization

2.4 土壤胞外酶活性與土壤化學(xué)性質(zhì)、微生物生物量和水稻產(chǎn)量的相互關(guān)系

土壤EEAs與土壤化學(xué)性質(zhì)、微生物生物量和水稻產(chǎn)量的相關(guān)分析（表4）結(jié)果顯示，土壤NAG活性與土壤微生物生物量（MBC和MBN）和水稻產(chǎn)量之間相關(guān)性達(dá)到顯著水平，但與土壤養(yǎng)分之間相關(guān)性不顯著；土壤BG活性與土壤SOC和氮、磷養(yǎng)分（TN、TP、AN和AP）之間相關(guān)性達(dá)顯著水平；土壤CBH活性與土壤TN、MBC和速效養(yǎng)分（AN、AP和AK）之間相關(guān)性達(dá)顯著水平；土壤ACP活性與土壤TN、AN、AP之間相關(guān)性達(dá)顯著水平；土壤POX活性與除pH外的各指標(biāo)均呈極顯著負(fù)相關(guān)，而AG與各指標(biāo)間相關(guān)性均不顯著?？梢姡寥繣EAs受到了土壤養(yǎng)分和微生物影響，但不同胞外酶對(duì)土壤養(yǎng)分的響應(yīng)存在較大差異。

2.5 土壤胞外酶活性分布特征及關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因子

通過對(duì)6種土壤EEAs進(jìn)行主成分分析，前兩個(gè)主成分共包含了土壤EEAs分布特征的87.8%（圖2）。長(zhǎng)期不同施肥使EEAs分布產(chǎn)生差異，CK處理分布于上方中間部位，NPK處理分布在中心原點(diǎn)附近，HNPK處理主要分布在右下方，而NPKM處理主要分布在左下方。以土壤EEAs為響應(yīng)變量，土壤化學(xué)性質(zhì)、微生物生物量為解釋變量進(jìn)行RDA分析（圖3）。RDA前兩個(gè)排序軸保留了土壤胞外酶活性數(shù)據(jù)總方差的86.8%，即9個(gè)環(huán)境因子在前兩軸中累計(jì)解釋了土壤胞外酶活性特征的86.8%。響應(yīng)變量與解釋變量之間的箭頭夾角的余弦值可以表示兩者之間的相關(guān)性[25]，RDA排序圖可以看出TN、AN、AP與BG、CBH、ACP之間呈正相關(guān)關(guān)系，MBC和MBN與NAG相關(guān)性較高，而土壤養(yǎng)分和微生物生物量與POX之間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，該結(jié)果與相關(guān)分析（表4）的結(jié)果一致。

表4 土壤胞外酶活性與土壤化學(xué)性質(zhì)、微生物生物量和水稻產(chǎn)量的相關(guān)性Table 4 Correlations analysis of soil extracellular enzyme activities with soil chemical properties，microbial biomass and grain yield

各試驗(yàn)處理點(diǎn)在RDA圖上的分布及與響應(yīng)變量（EEAs）的位置關(guān)系可以看出，不施肥（CK）處理POX活性較高，NPKM處理主要提高了ACP、BG和CBH活性，HNPK處理主要提高了AG和NAG活性，而NPK處理胞外酶活性處于居中的位置。土壤EEAs的變化主要由土壤養(yǎng)分狀況驅(qū)動(dòng)，其中土壤全氮（TN）和微生物生物量碳（MBC）分別解釋了方差變異的34.3%和20.9%，達(dá)到顯著水平，表明長(zhǎng)期施肥引起土壤酶活性的變化可以由TN和MBC這兩個(gè)參數(shù)來解析。

3 討 論

3.1 長(zhǎng)期施肥對(duì)紅壤稻田土壤養(yǎng)分和微生物生物量的影響

稻田長(zhǎng)期均衡施用氮磷鉀肥以及氮磷鉀肥與有機(jī)肥配施有利于土壤肥力的提升，長(zhǎng)期化肥配施有機(jī)肥使土壤SOC、TN、TP、AN和AP等養(yǎng)分顯著增加[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，與低量氮磷鉀肥（NPK）相比，提高化肥用量（HNPK）對(duì)SOC、TN和AN的增加不顯著，而有機(jī)無機(jī)配施（NPKM）顯著提高了土壤有機(jī)碳和氮、磷、鉀養(yǎng)分含量（表2），表明有機(jī)無機(jī)配施對(duì)于提升土壤養(yǎng)分具有更佳效果。Meta大數(shù)據(jù)分析也有相似的結(jié)論，與化肥處理相比，有機(jī)肥或有機(jī)無機(jī)配施處理作物產(chǎn)量平均增加27%、SOC增加38%、TN增加20%[11]。

土壤微生物生物量代表了參與土壤中養(yǎng)分循環(huán)和有機(jī)物質(zhì)轉(zhuǎn)化的微生物數(shù)量[27]，土壤MBC和MBN轉(zhuǎn)化迅速，是敏感的土壤質(zhì)量指標(biāo)[27-28]，施用化肥可以提高土壤MBC和MBN。在不同利用方式土壤中的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與不施肥相比，長(zhǎng)期施用化肥農(nóng)田土壤MBC增加15.1%[2]，稻田土壤MBC和MBN分別增加26%和13%[10]；而有機(jī)肥投入具有更加顯著的提升效果，與化肥處理相比MBC和MBN分別增加51%和24%[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，與CK相比，NPK、HNPK和NPKM處理MBC分別增加20.8%、41.1%和60.2%，MBN分別增加33.6%、42.9%和60.4%（圖1），表明土壤微生物生物量隨化學(xué)肥料投入量在一定用量范圍內(nèi)呈遞增趨勢(shì)，而有機(jī)無機(jī)配施（NPKM）提升效果更為明顯。

3.2 長(zhǎng)期施肥對(duì)紅壤稻田土壤胞外酶活性的影響

土壤胞外酶是土壤生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分循環(huán)和代謝的主要驅(qū)動(dòng)力，胞外酶活性反映了土壤的生物活性和生化反應(yīng)的活躍程度[1-3]。土壤胞外酶活性對(duì)土壤環(huán)境因素敏感，不同研究者在不同區(qū)域和土壤上的研究結(jié)果存在較大差異。紅壤旱地長(zhǎng)期施用化肥或化肥與有機(jī)肥配施可以顯著提高參與碳循環(huán)（BG、CBH）和氮循環(huán)（NAG）相關(guān)的水解酶活性[29-30]；稻田土壤施用化肥使參與碳循環(huán)水解酶BG活性較對(duì)照提高了35%～118%，參與氮循環(huán)水解酶NAG活性較對(duì)照提高了9%～30%[31]；而化肥配施有機(jī)肥可以進(jìn)一步提高BG和NAG活性[31-32]。Meta分析也有相似的結(jié)論，化肥投入可增加AG、BG、CBH、NAG等酶活性[6，9]，有機(jī)肥投入促使相關(guān)酶活性大幅增加[11]。本研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期施用化肥（NPK和HNPK）或有機(jī)無機(jī)配施（NPKM）提高了稻田土壤SOC和MBC（表2，圖1），從而促進(jìn)了AG、BG和CBH等碳循環(huán)相關(guān)水解酶的活性（表3）；施用化肥增加了土壤氮素養(yǎng)分含量（TN、AN和MBN）（表2，圖1），提高了氮循環(huán)有關(guān)的NAG活性（表3），而有機(jī)無機(jī)配施（NPKM）處理土壤有效氮含量大幅增加，消減了土壤微生物代謝對(duì)氮素限制，使氮水解酶的分泌降低，導(dǎo)致NAG活性較高量化肥（HNPK）處理有所降低；低量氮磷鉀（NPK）處理提高了土壤ACP活性，而高量氮磷鉀（HNPK）處理降低了土壤ACP活性（表3），這可能由于高量無機(jī)磷投入抑制了解磷菌活性和酸性磷酸酶的合成與分泌，從而導(dǎo)致ACP活性下降[33-34]，而有機(jī)無機(jī)配施（NPKM）處理施用紫云英和豬糞，提供了豐富的碳源和有機(jī)磷，顯著提高了ACP活性[35-36]。酚氧化酶（POX）參與木質(zhì)素的降解與腐殖化過程[17]，榮勤雷等[32]長(zhǎng)期有機(jī)培肥的數(shù)據(jù)顯示不同肥料品種對(duì)土壤POX的影響存在差異，與不施肥相比，化肥配施畜禽糞便POX活性略有提高，單施化肥及化肥與綠肥或秸稈配施土壤POX活性均顯著降低。長(zhǎng)期定位研究發(fā)現(xiàn)，施用化肥或有機(jī)肥顯著降低POX活性[14，16]；而Zhang等[37]在稻田短期試驗(yàn)的研究結(jié)果卻顯示增施有機(jī)肥提高了POX的活性，這可能與稻田有機(jī)物料腐解產(chǎn)生的還原物質(zhì)短期內(nèi)引起土壤微生物的響應(yīng)有關(guān)。本研究中POX活性隨化肥用量增加而下降，有機(jī)無機(jī)配施POX活性最低（表3），與前人研究結(jié)果[32-36]基本一致。

3.3 紅壤稻田土壤胞外酶活性分布特征及其驅(qū)動(dòng)因子

本研究通過對(duì)碳（AG、BG、CBH）、氮（NAG）、磷（ACP）循環(huán)相關(guān)的水解酶和氧化酶（POX）進(jìn)行主成分分析，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期不同施肥處理造成土壤養(yǎng)分發(fā)生顯著變化，從而顯著影響了土壤EEAs的分布特征（圖2）。土壤EEAs與養(yǎng)分之間存在典型相關(guān)關(guān)系[31]，EEAs的變化趨勢(shì)與微生物生物量、有機(jī)碳和全氮的變化趨勢(shì)基本一致[30]。Allison和Vitousek[38]研究認(rèn)為微生物胞外酶的合成符合經(jīng)濟(jì)學(xué)理論，當(dāng)微生物營(yíng)養(yǎng)受到限制時(shí)會(huì)激發(fā)相應(yīng)酶的分泌，而且土壤胞外酶活性與對(duì)應(yīng)的功能基因數(shù)量有很強(qiáng)的相關(guān)性，兩者之間的關(guān)系受到了土壤微生物結(jié)構(gòu)、土壤有機(jī)碳、pH等調(diào)控[3]，但在不同土壤環(huán)境條件下，土壤EEAs的主要影響因素存在一定差異。本研究通過土壤EEAs與環(huán)境因子的RDA分析發(fā)現(xiàn)，EEAs的變化主要由土壤TN和MBC驅(qū)動(dòng)，分別解釋了酶活性變異的34.3%和20.9%（圖3），表明氮素和有機(jī)物投入是影響紅壤性稻田土壤EEAs的關(guān)鍵因素。

4 結(jié) 論

長(zhǎng)期施肥顯著影響了紅壤性水稻土養(yǎng)分狀況和微生物生物量碳氮，從而影響土壤胞外酶活性（EEAs），其中土壤全氮（TN）和微生物生物量碳（MBC）是關(guān)鍵的決定因子，分別解釋了酶活性變異的34.3%和20.9%?；逝涫┯袡C(jī)肥有利于水稻增產(chǎn)，并提高土壤養(yǎng)分、微生物生物量和土壤碳、氮、磷循環(huán)相關(guān)水解酶活性，是維持作物高產(chǎn)和提升土壤質(zhì)量最優(yōu)的施肥管理措施。土壤胞外酶活性EEAs是土壤質(zhì)量的敏感指標(biāo)，但土壤EEAs與環(huán)境因子之間關(guān)系、長(zhǎng)期施肥對(duì)EEAs特征的影響及有關(guān)機(jī)制尚待進(jìn)一步研究，特別是深入研究不同培肥措施引起的土壤胞外酶活性與土壤微生物數(shù)量、結(jié)構(gòu)和功能變化之間的關(guān)系。

致 謝 感謝江西農(nóng)業(yè)大學(xué)榮勤雷博士和江蘇太湖地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所施林林博士在數(shù)據(jù)分析上給予的幫助。