一株侵染黃桃果實(shí)的葡萄座腔菌菌株鑒定

虞凡霜，強(qiáng) 遙，秦雙林，張凱東，劉 冰，熊桂紅，蔣軍喜*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，江西 南昌 330045；2.上海市崇明區(qū)長(zhǎng)興鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)中心，上海 201913）

【研究意義】“錦繡”黃桃是我國(guó)南方鮮食與加工兼用的晚熟桃品種，因其品質(zhì)優(yōu)良、香甜可口、外觀美麗而深受廣大消費(fèi)者的喜愛[1-3]。近年來，江西省井岡山市大力推進(jìn)“錦繡”黃桃種植，但在種植過程中出現(xiàn)嚴(yán)重的果實(shí)腐爛現(xiàn)象，使當(dāng)?shù)毓r(nóng)種植黃桃積極性受到嚴(yán)重影響。2020 年7 月下旬，筆者對(duì)當(dāng)?shù)馗癄€病果進(jìn)行病菌分離，分離到疑似葡萄座腔菌的菌落。本文擬對(duì)該分離菌株進(jìn)行系統(tǒng)鑒定和致病性測(cè)定，以明確葡萄座腔菌對(duì)桃果實(shí)的致病作用，這對(duì)促進(jìn)桃侵染性流膠病研究和有效防治桃果實(shí)腐爛具有重要的理論和實(shí)際意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】葡萄座腔菌是桃侵染性流膠病的主要病原，長(zhǎng)期以來人們僅研究其對(duì)桃枝干的為害，而很少關(guān)注其對(duì)桃果實(shí)的為害。Britton[4]研究表明，引起美國(guó)佐治亞地區(qū)桃枝干流膠病的葡萄座腔菌有Botryosphaeria dothidea，B.obtuse和B.rhodina，以B.dothidea為主要致病菌。有關(guān)國(guó)內(nèi)桃枝干流膠病菌，廣東、江蘇、山東、重慶的為B.dothidea[5-9]，湖北的主要為B.dothidea，極少數(shù)為B.obtuse和B.rhodina[10]，有B.dothidea和B.obtuse2 種[11]。然而，對(duì)葡萄座腔菌在桃果實(shí)上的為害情況并不了解?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】研究擬從分離獲得的葡萄座腔菌中選擇一個(gè)菌株，對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征觀察以及多基因序列分析，同時(shí)對(duì)其致病性進(jìn)行測(cè)定?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究不僅旨在明確該菌株的種類歸屬，而且表明葡萄座腔菌在為害桃枝干的同時(shí)，也能為害桃果實(shí)而導(dǎo)致桃果實(shí)發(fā)病。

1 材料與方法

1.1 供試病果

2020 年7 月從江西省井岡山市拿山鄉(xiāng)羅仚“錦繡”黃桃種植基地采后預(yù)藏的果實(shí)中采集病果，病果采回后立即進(jìn)行病菌分離。

1.2 病原菌的分離純化

參照文獻(xiàn)[12]對(duì)桃病果進(jìn)行病菌分離。將桃果實(shí)病斑表面用75%酒精擦洗后經(jīng)火焰灼燒滅菌，用無菌鑷子撕去病斑表皮后，將內(nèi)部果肉移入PDA 平板上，并置于30 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)到適宜大小后挑取菌落邊緣菌絲體進(jìn)行純化，獲得的菌株用PDA斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病菌的培養(yǎng)特性及形態(tài)學(xué)觀察

將供試菌株接種于PDA 平板中央，30 ℃培養(yǎng)，逐日觀察菌落形態(tài)特征，7 d后用十字交叉法[13]測(cè)量菌落直徑大小，計(jì)算菌落生長(zhǎng)速率。鑒于該菌在人工培養(yǎng)基上不易產(chǎn)生子實(shí)體，將該菌接種桃枝干于24 ℃、12 h 光照/12 h 黑暗交替的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 d，促其產(chǎn)生子實(shí)體，在光學(xué)顯微鏡下觀察分生孢子器和分生孢子的形態(tài)特征，并隨機(jī)測(cè)量50個(gè)分生孢子器和100個(gè)分生孢子大小。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，參照相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)病原菌種類歸屬進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.4 分子生物學(xué)鑒定

1.4.1 病菌基因組DNA 提取 將供試菌株接種于PDB 液體培養(yǎng)基中，26 ℃、160 r/min 搖床培養(yǎng)3 d，收集菌絲體，在液氮中迅速研磨呈粉末狀。采用Ezup 柱式真菌基因組DNA 提取試劑盒提取其基因組DNA，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量。

1.4.2 病菌rDNA-ITS、EF-1 和β-tubulin 基因序列分析 以提取的基因組DNA 為模板，用引物對(duì)ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）/ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）、EF1-728F（5'-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3'）/EF1-986R（5'-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3'）和T1（5'-AACATGCGTGAGATTGTAAGT-3'）/BT2b（5'-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3'）[14-17]分別對(duì)rDNA-ITS、EF-1 和β-tubulin 基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)總體系25 μL，包含ddH2O 8.5 μL、2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL、正反向引物各1 μL（10 μmol/L）和模板DNA 2 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；最后一次循環(huán)結(jié)束后，72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，委托生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.4.3 序列比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 將測(cè)得的原始序列用DNA Star（Madison Wisconsin，USA）分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并將獲得的序列遞交至GenBank獲得序列登錄號(hào)。在NCBI中使用BLAST程序搜索同源性序列，并下載相關(guān)序列，利用MEGA 5.2軟件中的鄰位加入法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，根據(jù)序列同源性大小及系統(tǒng)發(fā)育樹中的親緣關(guān)系，對(duì)待鑒定菌株進(jìn)行分子鑒定。

1.5 病菌致病性測(cè)定

選取健康的黃桃成熟期果實(shí)和一年生枝條，經(jīng)75%酒精擦拭消毒后，在待接種處用滅菌針頭刺傷，隨即將剛打取的直徑5 mm 菌餅的菌絲面緊貼傷口進(jìn)行接種，以接種空白PDA 培養(yǎng)基塊作對(duì)照，每處理重復(fù)6次。接種處用無菌濕棉球保濕，被接種的果實(shí)和枝條置于30 ℃恒溫箱中保濕培養(yǎng)，逐日觀察發(fā)病情況，待發(fā)病后對(duì)接種病斑進(jìn)行病菌再分離，以完成柯赫氏證病律。

2 結(jié)果與分析

2.1 病果癥狀

2020 年，江西省井岡山市拿山鄉(xiāng)多個(gè)種植基地的“錦繡”黃桃發(fā)生一種新的果實(shí)病害。該病主要發(fā)生于7、8月黃桃果實(shí)成熟及貯藏期，果實(shí)出現(xiàn)淡褐色圓形或不規(guī)則形病斑，病健交界不明顯，病斑果皮較完好，果肉變軟腐爛（圖1a）。

2.2 病菌培養(yǎng)性狀及形態(tài)特征

從各病果中分離到形態(tài)特征一致的菌落，隨機(jī)挑選一株菌株（JGT01）進(jìn)行培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征觀察，該菌株在PDA 平板上菌落圓形，初期白色，培養(yǎng)3 d 后菌落開始轉(zhuǎn)變?yōu)榛揖G色，菌落背面為墨綠色，菌落生長(zhǎng)速度為35.5 mm/d，具有發(fā)達(dá)的氣生菌絲（圖1b，圖1c，圖1d）。在PDA 平板上培養(yǎng)30 d，未產(chǎn)生子實(shí)體。將病菌轉(zhuǎn)接桃樹一年生枝條，枝條發(fā)病后病部可產(chǎn)生分生孢子器，分生孢子器球形，平均大小為221.2（214.2～244.8）μm×225.9（204～255）μm（圖1e），內(nèi)部著生分生孢子，分生孢子呈長(zhǎng)梭形、無色、單胞、薄壁、外壁光滑、偶有1～2 個(gè)隔膜，平均大小為22.6（18.7～28.6）μm×5.1（3.9～5.2）μm（圖1f）。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，以上形態(tài)特征與Slippers 等[17]描述的“七葉樹殼梭孢（Fusicoccum aesculiCorda）”形態(tài)特征相一致。

圖1 “錦繡”黃桃果實(shí)腐爛病癥狀及菌株JGT01的形態(tài)特征Fig.1 Symptoms of fruit rot disease on“Jingxiu”yellow peach and morphology of strain JGT01

2.3 分子生物學(xué)鑒定

以供試菌株JGT01 的基因組DNA 為模板，對(duì)其rDNA-ITS、EF-1 和β-tubulin 基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，均獲得符合預(yù)期大小的DNA 條帶（圖2），經(jīng)測(cè)序，其條帶大小依次為583，297，681 bp。將序列提交至Gen-Bank，獲得的基因登錄號(hào)分別為MW202368、MW202401 和MW 202404；通過BLAST 搜索，發(fā)現(xiàn)這3 個(gè)序列與GenBank 中葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）對(duì)應(yīng)序列有最高的同源性，均為100%。將本菌株JGT01 的3 個(gè)序列按rDNA-ITS、EF-1 和β-tubulin 順序拼接成一個(gè)大的串聯(lián)序列，同時(shí)在GenBank 中下載相關(guān)菌株的對(duì)應(yīng)序列（表1）并進(jìn)行拼接，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示，JGT01與B.dothidea的各菌株聚類成一個(gè)分支，而其他種類的菌株各構(gòu)成獨(dú)立的分支（圖3）。依據(jù)同源性大小和系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，將菌株JGT01鑒定為葡萄座腔菌（B.dothidea）。

圖2 菌株JGT01的不同基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis of PCR products amplified from different genes of strain JGT01

圖3 基于rDNA-ITS、EF-1和β-tubulin基因串聯(lián)序列構(gòu)建的葡萄座腔菌屬真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of fungi in Botryosphaeria based on the concatenated sequences of genes ITS，EF-1 and β-tubulin

表1 從GenBank中下載的葡萄座腔菌屬內(nèi)各種真菌的基因序列信息Tab.1 Gene sequence information of various fungi in the genus Botryosphaeria downloaded from GenBank

2.4 病菌致病性測(cè)定

將供試菌株JGT01 分別接種健康黃桃果實(shí)及枝條，結(jié)果接種部位均發(fā)病。果實(shí)接種后36 h 出現(xiàn)明顯癥狀（圖4a），接種后48 h病斑顯著擴(kuò)大，呈褐色圓形，病健交界不明顯（圖4b），其癥狀與自然發(fā)病癥狀相同，接種后60 h病斑進(jìn)一步擴(kuò)大，病斑表面產(chǎn)生白色稠密的菌絲體（圖4c）。枝條接種后第3天開始發(fā)病，產(chǎn)生褐色橢圓形凹陷的病斑（圖5a），隨后病斑進(jìn)一步擴(kuò)展（圖5b）。接種5～7 d 病斑處逐漸溢出黃色透明的粘液（圖5c），粘液逐漸變?yōu)楹谏z體（圖5d），接種后21 d 病斑表面密生黑色小點(diǎn)（圖5e）。用純PDA 接種，無論是接種果實(shí)（見果實(shí)的右半部）還是接種枝條（圖5f）均未發(fā)病。對(duì)接種病斑進(jìn)行病菌再分離，再分離的病菌與原接種菌的培養(yǎng)性狀及形態(tài)特征一致，完成了柯赫氏證病律。

圖4 菌株JGT01在黃桃果實(shí)上的致病性測(cè)定Fig.4 Pathogenicity test of the strain JGT01 on fruits of yellow peach

圖5 菌株JGT01在桃枝上的致病性測(cè)定結(jié)果Fig.5 Pathogenicity test of the strain JGT01 on trunks of yellow peach

3 結(jié)論與討論

本文對(duì)一株分離自井岡山市黃桃病果的真菌進(jìn)行了培養(yǎng)性狀觀察、形態(tài)和分子生物學(xué)測(cè)定，其菌落形態(tài)特征和菌落生長(zhǎng)速率符合對(duì)葡萄座腔菌（B.dothidea）的描述，分生孢子器和分生孢子形態(tài)大小與葡萄座腔菌的無性態(tài)七葉樹殼梭孢（Fusicoccum aesculi）的分生孢子器和分生孢子形態(tài)大小相吻合，測(cè)定的rDNA-ITS、EF-1 和β-tubulin 3 個(gè)基因序列與葡萄座腔菌對(duì)應(yīng)序列具有最高的同源性，在構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育上與葡萄座腔菌也聚于一個(gè)分支，基于以上結(jié)果，本文將該菌株的種類鑒定為葡萄座腔菌（B.dothidea）。

B.dothidea是葡萄座腔菌屬中最常見的種類，其寄主范圍廣，可使20 科34 屬50 余種植物致病，蘋果、梨、桃、葡萄、獼猴桃等多種果樹常遭受B.dothidea的侵染而分別發(fā)生蘋果和梨輪紋病、桃侵染性流膠病、葡萄潰瘍病、獼猴桃果實(shí)熟腐病等病害[18-21]。B.dothidea屬于弱寄生菌，主要為害寄主植物的枝干和成熟果實(shí)，并具有潛伏侵染特性。蘋果、梨輪紋病和葡萄潰瘍病對(duì)枝干和果實(shí)的危害并重，造成枝干斑痕累累、樹勢(shì)衰弱直至枯死和果實(shí)貯藏期間的嚴(yán)重腐爛[22-24]；獼猴桃果實(shí)熟腐病主要為害獼猴桃近成熟和貯藏期果實(shí)，并且是獼猴桃貯藏期腐爛病害的主要病原，但在獼猴桃枝干上發(fā)生較少，僅在枝條剪口處發(fā)生為害[25]。B.dothidea一直被認(rèn)為是桃樹枝干的重要病原菌，而很少有人去關(guān)注其對(duì)果實(shí)的為害，本文則清楚地表明B.dothidea對(duì)桃果實(shí)的為害，未來筆者擬對(duì)“錦繡”黃桃爛果進(jìn)行大樣本病原鑒定，以明確B.dothidea是否是造成其爛果的重要原因。