基于金納米顆粒修飾石墨烯紙電極用于大腸桿菌O157︰H7的免疫阻抗分析

樊凱 陳移平 陳晶晶 王劍平 王維琴

最近幾年中，食源性致病菌的爆發(fā)已經(jīng)成為了公眾普遍關(guān)注的重要公共安全問(wèn)題。在眾多的食源性致病菌中，大腸桿菌O157：H7尤為引起注意，主要是它能引起威脅生命的并發(fā)癥，如出血性結(jié)腸炎等。因此，開(kāi)發(fā)相應(yīng)的可有效檢測(cè)大腸桿菌O157：H7的方法顯得尤為重要。

目前被用于檢測(cè)大腸桿菌O157：H7的檢測(cè)方法主要有細(xì)菌分離培養(yǎng)法、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）以及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）法等。這些方法各有各的不足，有的方法耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低、成本高，需要實(shí)驗(yàn)室環(huán)境以及專(zhuān)業(yè)操作人員。最近，免疫傳感器（基于抗原抗體結(jié)合）在檢測(cè)大腸桿菌O157：H7中的作用顯得越來(lái)越重要。在眾多免疫傳感器中，阻抗免疫傳感器由于其免標(biāo)記、快速以及可便攜化的優(yōu)勢(shì)，在檢測(cè)大腸桿菌O157：H7中的優(yōu)勢(shì)也非常明顯。而在免疫傳感器方面，依然需要新的電極材料來(lái)構(gòu)建高靈敏度、低成本以及小型化的阻抗免疫傳感器。

石墨烯是一種單層碳原子的蜂窩狀二維納米結(jié)構(gòu)，被認(rèn)為是一種新型以及有效的電極材料。石墨烯材料的主要特性是有大的比表面積、優(yōu)異的生物相容性，最為重要的是它可以加速電解質(zhì)物質(zhì)和電極之間的電子傳遞。另外，金納米顆粒的獨(dú)特特性能夠?yàn)樯锓肿拥墓潭ㄌ峁┖线m的微環(huán)境，并加速生物分子與電極之間的電子傳遞。

在本研究中，我們開(kāi)發(fā)了一種新型的阻抗生物傳感器用于大腸桿菌O157：H7的檢測(cè)，主要基于納米金修飾的石墨烯紙電極。通過(guò)抗體的固定，新型的阻抗生物傳感器對(duì)于大腸桿菌O157：H7的檢測(cè)表現(xiàn)出了良好的分析特性。

一、試驗(yàn)部分

1.試劑及儀器。氧化石墨烯溶液（2mg/mL），購(gòu)買(mǎi)自先鋒納米（南京）；抗壞血酸、氫碘酸，購(gòu)買(mǎi)自阿拉丁試劑（上海）；大腸桿菌O157：H7、兔抗-大腸桿菌O157：H7、LB培養(yǎng)基、牛血清白蛋白，均購(gòu)買(mǎi)自生工生物（上海）。EDC、NHS，購(gòu)買(mǎi)自Sigma-Aldrich（美國(guó)）；電化學(xué)工作站，購(gòu)買(mǎi)自辰華儀器（上海）。

2.納米金/石墨烯紙復(fù)合電極的制備。使用抗壞血酸（2mg/mL）初步還原氧化石墨烯溶液，使用50mm直徑和0.22μm孔徑的濾紙進(jìn)行真空抽濾，加入氫碘酸進(jìn)行二次還原，并氮?dú)獯蹈色@得還原的石墨烯紙電極，最終在電化學(xué)沉積下實(shí)現(xiàn)納米金的修飾。

3.免疫傳感器的制備?？贵w的固定主要使用EDC/NHS體系來(lái)進(jìn)行修飾，然后把一系列的細(xì)菌溶液（9.2×10²-9.2×10⁷cfu mL-1）加入到溶液中，進(jìn)行檢測(cè)。

二、結(jié)果與討論

1.免疫傳感器的分析性能。為了定量評(píng)估免疫傳感器的性能，主要是動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍以及檢測(cè)限，主要記錄了9.2×10²-9.2×10⁷cfu mL-1細(xì)菌溶液的奈奎斯特圖。如圖1所示，阻抗譜的半圓直徑隨著大腸桿菌O157：H7濃度的增加而變大。并且，電子轉(zhuǎn)移阻抗（Ret）在9.2×10²-9.2×10⁷cfu mL-1的范圍內(nèi)表現(xiàn)出了良好的線性范圍。如圖1所示，將大腸桿菌O157：H7濃度的對(duì)數(shù)與傳感器阻抗擬合后的線性回歸方程為：Y（Ω）=355.24+106.43X（log cfu mL-1）（R2=0.995）。阻抗免疫傳感器的檢測(cè)限為4.6×10²cfu mL-1。

我們還對(duì)阻抗免疫傳感器針對(duì)大腸桿菌O157：H7的特異性進(jìn)行評(píng)價(jià)。主要測(cè)試了其他類(lèi)型的細(xì)菌，如大腸桿菌DH5α、金黃色葡萄球菌以及單核李斯特菌等。當(dāng)濃度均為10⁷cfu mL-1時(shí)，其他細(xì)菌沒(méi)有對(duì)傳感器造成相應(yīng)的干擾，表明了該傳感器對(duì)于大腸桿菌O157：H7的特異性。此外，該免疫傳感器的主要性能依賴于捕捉抗體的活性。將免疫傳感器放置在4℃的冰箱中，每天檢測(cè)免疫傳感器的性能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，免疫傳感器在一個(gè)月之后依然保持93.1%的性能。該免疫傳感器良好的特異性以及穩(wěn)定性很好地說(shuō)明了還原石墨烯紙以及金納米顆粒良好的生物相容性，從而能夠很好地保持抗體及其他生物分子的生物活性。

2.實(shí)際樣本檢測(cè)。我們同樣研究了基于還原石墨烯紙阻抗免疫傳感器用于實(shí)際食品樣品中的大腸桿菌O157：H7檢測(cè)的可行性。我們選取兩種食物樣本，包括牛肉和黃瓜。我們同樣繪制了在牛肉和黃瓜中檢測(cè)大腸桿菌的濃度曲線，得到了在黃瓜和牛肉中，傳感器的檢測(cè)限分別為4.6×10³cfu mL-1和4.6×10⁴cfu mL-1。結(jié)果表明，該傳感器可以用于復(fù)雜食品樣本中的大腸桿菌O157：H7的檢測(cè)。

在本研究中，我們開(kāi)發(fā)了一種簡(jiǎn)單靈敏的阻抗免疫傳感器用于大腸桿菌O157：H7檢測(cè)。該紙免疫傳感器的優(yōu)勢(shì)在于靈敏度高、選擇性好，以及良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性等，可用于大腸桿菌O157：H7的檢測(cè)中，值得大力推廣。