吳茱萸HPLC指紋圖譜的建立及基原鑒別研究

戚華文，徐 鑫，高德嵩，王 引，金紅利, ，王超然, ，劉艷芳, ，梁鑫淼,

1.中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所中國醫(yī)藥城生物醫(yī)藥創(chuàng)新研究院，江蘇 泰州 225300

2.中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所, 遼寧 大連 116023

吳茱萸為常用溫里藥之一，具有散寒止痛、降逆止嘔、助陽止瀉的功效，臨床上常用于治療厥陰頭痛、寒疝腹痛、寒濕腳氣，經(jīng)行腹痛等癥[1]。吳茱萸所含的化學(xué)成分類型較多，包括生物堿、檸檬苦素、萜類、黃酮等，其中生物堿和檸檬苦素類化合物是其主要活性成分。目前《中國藥典》2020年版中收錄了蕓香科植物吳茱萸Euodia rutaecarpa(Juss.) Benth.、石虎Euodia rutaecarpa(Juss.) Benth.var.officinalis(Dode) Huang或疏毛吳茱萸Euodia rutaecarpa(Juss.) Benth.var.bodinieri(Dode) Huang的干燥近成熟果實(shí)作為吳茱萸的3種基原藥材[2-4]。這3種藥材在中國南部各地均有廣泛分布，是吳茱萸商品藥材中的主流品種，但吳茱萸的質(zhì)量品質(zhì)與不同基原的相關(guān)性還缺少充分的實(shí)驗(yàn)研究，不同產(chǎn)地的生長環(huán)境、氣候條件可能會(huì)造成不同基原吳茱萸藥材的質(zhì)量差異[5-6]。

對(duì)于吳茱萸藥材的質(zhì)量控制多集中于吳茱萸堿、吳茱萸次堿和檸檬苦素的含量測(cè)定，《中國藥典》2020版中將這三者的含量作為質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)，但3種吳茱萸藥材的化學(xué)成分極為相似，僅通過個(gè)別成分的含量測(cè)定很難實(shí)現(xiàn)吳茱萸藥材基原的鑒別，也難以對(duì)其內(nèi)在品質(zhì)進(jìn)行客觀評(píng)價(jià)，因此建立一種準(zhǔn)確全面的質(zhì)量控制方法尤為重要。定量指紋圖譜是目前中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的主要方向之一，將指紋圖譜與多指標(biāo)成分定量結(jié)合起來，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥質(zhì)量的有效全面控制[7-8]。目前有關(guān)吳茱萸指紋圖譜的研究已有部分報(bào)道[9-11]，而采用HPLC定量指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析吳茱萸基原的報(bào)道較少。

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC建立29批吳茱萸的定量指紋圖譜，并利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)共用峰的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，結(jié)合相似度評(píng)價(jià)和化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，對(duì)不同基原的吳茱萸進(jìn)行分析，為吳茱萸的質(zhì)量控制及科學(xué)的臨床使用提供更多依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters Alliance高效液相色譜系統(tǒng)，包括2695梯度泵，2998二極管陣列檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱恒溫系統(tǒng)，Empower色譜工作站。MS204TS電子分析天平（梅特勒-托利多有限公司），島津超高效液相色譜系統(tǒng)，SPD-20A紫外檢測(cè)器，AB SCIEX X500系列QTOF質(zhì)譜儀。

色譜柱：Tnature-ACCHROM C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm, 美國沃特世公司）和Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm, 美國安捷倫公司）

1.2 試藥

對(duì)照品吳茱萸堿（批號(hào)B266，規(guī)格20 mg，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.20%）、吳茱萸次堿（批號(hào)B935，規(guī)格20 mg，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.40%）、去氫吳茱萸堿（批號(hào)5451，規(guī)格20 mg，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%）、水仙苷（批號(hào)4016，規(guī)格20 mg，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%）購自上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司。對(duì)照藥材吳茱萸（批號(hào)120909-201510，0.5 g/支）購自中國食品藥品檢定研究院；吳茱萸藥材共29批，采自湖南、江西省峽江縣、江西省劉公廟等地，質(zhì)量符合《中國藥典》2015年版。經(jīng)中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所楊小平鑒定為蕓香科植物吳茱萸E.rutaecarpa(Juss.)Benth.、石虎E.rutaecarpa(Juss.) Benth.var.officinalis(Dode) Huang或疏毛吳茱萸E.rutaecarpa(Juss.) Benth.var.bodinieri(Dode) Huang的干燥近成熟果實(shí)。具體信息見表1。

表1 29批吳茱萸樣品信息Table 1 Samples information from 29 batches of Evodiae Fructus

乙腈（4 L，色譜級(jí)）、甲醇（4 L，色譜級(jí)）均購自Sigma-Aldrich。甲酸（500 mL，色譜級(jí)）購自Aladdin。實(shí)驗(yàn)室用水來自Milli-Q超純水凈化系統(tǒng)（Billerica公司，美國）。

2 方法

2.1 色譜和質(zhì)譜條件

2.1.1 HPLC-DAD色譜條件 色譜柱為Tnature-ACCHROM C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美國沃特世公司），流動(dòng)相乙腈（A）-0.5%甲酸溶液（B）洗脫，0～21 min，5%～27% A；21～24 min，27%～48% A；24～35 min，48%～55% A；35～50 min，55%～90% A；50～60 min，95% A；體積流量1.5 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長為252 nm。

2.1.2 HPLC-QTOF-MS質(zhì)譜條件 液相條件與上述相同。離子源：ESI離子源；正離子模式；氣簾氣241 kPa；Gas 1：448 kPa；Gas 2：448 kPa；溫度620 ℃；離子化壓力5500 V，去簇電壓80 V；全掃描范圍：m/z50～1500；裂解電壓40 V。CE Spread：20 eV。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取吳茱萸堿、吳茱萸次堿、去氫吳茱萸堿、去氫吳茱萸堿對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成含吳茱萸堿80 μg/mL、吳茱萸次堿80 μg/mL、去氫吳茱萸堿80 μg/mL和水仙苷80 μg/mL的混合溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取吳茱萸藥材粉末（過3號(hào)篩）約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）60 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用75%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取同一批（S1）次吳茱萸藥材，制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄特征圖譜。各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于1%，主要特征峰的相對(duì)峰面積RSD小于5%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批（S1）次吳茱萸藥材，制備供試品溶液，分別于0、6、12、18、24 h注入液相色譜儀，記錄特征圖譜。各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于1%，主要特征峰的相對(duì)峰面積RSD小于5%，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批（S1）次吳茱萸藥材，制備6份供試品溶液，進(jìn)樣，記錄特征圖譜。各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于1%，主要特征峰的相對(duì)峰面積RSD小于5%。

3 結(jié)果與分析

3.1 吳茱萸指紋圖譜的建立

取29批吳茱萸樣指紋圖譜供試品溶液，分別按“2.2.2”項(xiàng)制備供試品溶液，每份樣品平行2次，按“2.1.1”項(xiàng)的方法依次進(jìn)樣檢測(cè)，獲得吳茱萸藥材的HPLC指紋圖譜（圖1）。將統(tǒng)一積分后的數(shù)據(jù)全部導(dǎo)入《中藥色譜特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件》（2012版），以S1批藥材的圖譜為參照譜圖，使用中位數(shù)進(jìn)行自動(dòng)匹配，加以多點(diǎn)校正，確定13個(gè)共有色譜峰，建立吳茱萸藥材的對(duì)照譜圖（圖2）。

圖1 29批吳茱萸藥材的HPLC指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of 29 batches of Evodiae Fructus

圖2 吳茱萸HPLC指紋圖譜共有模式Fig.2 Common pattern of HPLC fingerprints of Evodiae Fructus

3.2 特征峰的確證與指認(rèn)

采用HPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)，通過分析化合物的保留時(shí)間、一級(jí)離子質(zhì)荷比以及二級(jí)離子碎片信息，并與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道信息進(jìn)行匹配，共鑒定出吳茱萸指紋圖譜中13個(gè)特征峰，包括4種葡萄糖酸，1種有機(jī)酸，2種黃酮類化合物、3種吲哚喹啉類生物堿和3種喹諾酮類生物堿（表2）。為進(jìn)一步研究吳茱萸的化學(xué)成分組成及闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考依據(jù)。

表2 吳茱萸指紋圖譜特征峰的鑒定Table 2 Identification of characteristic peaks of Evodiae Fructus fingerprint

3.3 指紋圖譜相似度計(jì)算

將29批吳茱萸譜圖數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件》（2012版），計(jì)算相似度，結(jié)果見表3。29批吳茱萸藥材的相似度大于0.917，不同基原的吳茱萸指紋圖譜輪廓相似，但存在一定差異。其中，吳茱萸的相似度范圍大于0.934；石虎吳茱萸相似度范圍為0.917～0.945；疏毛吳茱萸的范圍為0.920～0.952。

表3 29批吳茱萸樣品的相似度分析結(jié)果Table 3 Similarity evaluation of 29 batches of Evodiae Fructus

3.4 聚類分析

為了進(jìn)一步分析不同基原吳茱萸的遠(yuǎn)近關(guān)系，以吳茱萸指紋圖譜中13個(gè)共有峰峰面積為變量，導(dǎo)入SPSS 22.0軟件，采用組間均連法，選擇平方歐式距離為測(cè)度對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見圖3。由聚類結(jié)果可知29批樣品在平方歐式距離為5～10時(shí)，29批吳茱萸藥材分為3大類，不同產(chǎn)地不同批號(hào)的S1～S8（吳茱萸藥材）聚為一類，不同批號(hào)的S9～S24（石虎）聚為一類；S25～S29批（疏毛吳茱萸）聚為一類。由此可以看出，不同基原吳茱萸藥材具有較為明顯的分類趨勢(shì)。當(dāng)平方歐式距離為10～25時(shí)，吳茱萸和石虎可以進(jìn)一步聚為一類，這2種基原藥材的質(zhì)量概貌更為相似。

圖3 吳茱萸藥材聚類分析樹狀圖Fig.3 Cluster analysis dendrogram of 29 batches of Evodiae Fructus

3.5 正交偏最小二乘判別分析（partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）

以29批不同基原吳茱萸指紋圖譜中的13個(gè)共有峰峰面積為變量，將其導(dǎo)入SIMICA 14.0軟件，進(jìn)行OPLS-DA。如圖4，OPLS-DA分析結(jié)果表明，吳茱萸3個(gè)基原品種樣本群處于不同的空間聚落，可以實(shí)現(xiàn)較好地區(qū)分，說明3種基原吳茱萸的化學(xué)成分存在一定的差異。其中，石虎吳茱萸聚落更為集中緊湊，說明同一產(chǎn)地的石虎吳茱萸藥材質(zhì)量差異較??；相反，吳茱萸聚落較為分散，離散度大于疏毛吳茱萸樣本，可能是由于不同產(chǎn)地的生長環(huán)境、氣候條件造成吳茱萸藥材質(zhì)量差異較大。為了進(jìn)一步確認(rèn)對(duì)藥材分組貢獻(xiàn)較大的成分，將3種基原吳茱萸藥材進(jìn)行兩兩分組，根據(jù)變量重要性投影值（variable importance in project，VIP）篩選不同基原吳茱萸藥材之間的差異性質(zhì)量標(biāo)志物[12-14]，結(jié)果顯示，吳茱萸和石虎吳茱萸的差異性質(zhì)量標(biāo)志物為峰8、11、12、10；石虎吳茱萸和疏毛吳茱萸的差異性質(zhì)量標(biāo)志物為峰6、3、8、10、2、11；吳茱萸和疏毛吳茱萸的差異性質(zhì)量標(biāo)志物為峰6、3、2。

圖4 OPLS-DA分析Fig.4 OPLS-DA

3.6 含量測(cè)定

3.6.1 線性關(guān)系考察 精密吸取吳茱萸堿、吳茱萸次堿、去氫吳茱萸堿和水仙苷對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，配制成7個(gè)質(zhì)量濃度系列的混合對(duì)照品溶液，按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以各對(duì)照品質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)（R2）和線性范圍，結(jié)果見表4。

表4 4個(gè)指標(biāo)成分線性關(guān)系和線性方程Table 4 Linear relationship and linear range of four components

3.6.2 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄吳茱萸堿、吳茱萸次堿、去氫吳茱萸堿和水仙苷峰面積，并計(jì)算峰面積RSD，結(jié)果顯示吳茱萸堿、吳茱萸次堿、去氫吳茱萸堿和水仙苷的峰面積RSD值分別為0.21%、0.08%、0.29%、0.31%，表明儀器精密度良好。

3.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（批號(hào)S1），在制備后的0、6、12、18、24 h分別進(jìn)樣，記錄吳茱萸堿、吳茱萸次堿、去氫吳茱萸堿和水仙苷的峰面積，計(jì)算各指標(biāo)成分峰面積RSD為0.58%、0.01%、0.78%、1.20%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.6.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一吳茱萸樣品粉末6份（S1），按照“2.2.2”項(xiàng)下樣品處理方法制備，按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄吳茱萸堿、吳茱萸次堿、去氫吳茱萸堿和水仙苷的峰面積，計(jì)算峰面積RSD分別為1.98%、1.40%、1.82%、1.92%，表明本方法重復(fù)性較好。

3.6.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取吳茱萸粉末（批號(hào)S1）6份，每份0.05 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，分別加入?yún)擒镙菈A、吳茱萸次堿、去氫吳茱萸堿和水仙苷對(duì)照品1.6、0.45、0.33、0.33 mg，精密加入75%甲醇適量，定容至25 mL量瓶，后續(xù)處理同“2.2.2”項(xiàng)。按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，吳茱萸堿、吳茱萸次堿、去氫吳茱萸堿和水仙苷的回收率分別為96.94%、92.52%、91.79%、97.76%，RSD分別為3.19%、3.04%、4.28%、3.09%。

3.6.6 樣品含量測(cè)定 通過對(duì)29批吳茱萸藥材進(jìn)行分析，測(cè)定不同基原吳茱萸藥材中吳茱萸堿、吳茱萸次堿、去氫吳茱萸堿和水仙苷含量，含量測(cè)定結(jié)果見表5。結(jié)果顯示，29批吳茱萸藥材中吳茱萸堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1.10%～4.51%，吳茱萸次堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.21%～0.99%，去氫吳茱萸堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.60%～0.91%，水仙苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.14%～0.65%。

表5 吳茱萸中4種成分定量結(jié)果Table 5 Quantitative result of four components in Evodiae Fructus

4 討論

4.1 柱溫的選擇

在相同色譜柱上，比較30、35、40、45、50 ℃5個(gè)柱溫條件對(duì)同一吳茱萸樣品的分離效果。結(jié)果表明，在柱溫30 ℃條件下，特征圖譜的整體分離效果最佳。隨著柱溫升高，20 min左右主要色譜峰的分離度不斷減小，因此，選定吳茱萸藥材特征圖譜的柱溫為30 ℃。

4.2 體積流量的選擇

在1 mL/min條件下，吳茱萸藥材特征圖譜的分析時(shí)間較長（80 min），考慮到減小特征圖譜分析時(shí)間，提高檢測(cè)效率，考察1.5 mL/min條件下特征圖譜的分離效果。結(jié)果表明，在1.5 mL/min條件下，分析時(shí)間縮短至60 min，且色譜峰的數(shù)目和分離度基本相同。因此，選定吳茱萸藥材特征圖譜的體積流量為1.5 mL/min。

吳茱萸具有散寒止痛、助陽止瀉的功效，在治療和預(yù)防心血管疾病、抗菌消炎、抗過敏、抗腫瘤收縮血管等方面有顯著療效，其活性成分主要包括生物堿、黃酮、有機(jī)酸等[2]。因此，比較甲醇、75%甲醇、50%甲醇、70%乙醇對(duì)吳茱萸藥材的提取效果。從峰的數(shù)目和峰面積等方面綜合比較色譜圖發(fā)現(xiàn)，75%甲醇作為提取溶劑得到的樣品，其色譜峰數(shù)較多，峰面積相對(duì)較高，基線平穩(wěn)，較好地反映吳茱萸藥材的質(zhì)量概貌。綜合考慮，選定75%甲醇作為吳茱萸藥材特征圖譜的提取溶劑。

在相同色譜條件下，比較Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Tnature C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）等2種色譜柱對(duì)同一吳茱萸樣品的分離效果。結(jié)果表明，吳茱萸樣品在兩根不同品牌C18色譜柱上的分離效果差別較大，其中在Tnature C18色譜柱上的峰形和分離度相對(duì)較好。這主要是由于吳茱萸樣品中含有吳茱萸堿和吳茱萸次堿等生物堿類化合物，而Tnature C18色譜柱表面帶有一定量的正電荷，有利于生物堿類化合物的分離。綜合考慮，選定吳茱萸藥材特征圖譜的分析色譜柱為Tnature C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)收集的29批不同基原吳茱萸藥材進(jìn)行了研究，建立了3種基原吳茱萸藥材的定量指紋圖譜，標(biāo)定了13個(gè)共有峰，并通過液質(zhì)聯(lián)用進(jìn)行峰指認(rèn)，明確了吳茱萸藥材的物質(zhì)基礎(chǔ)。在指紋圖譜的基礎(chǔ)上，通過聚類分析和正交偏最小二乘判別分析對(duì)3種基原吳茱萸進(jìn)行了區(qū)分。結(jié)果顯示：兩種方法的分類效果均較為明顯；OPLS-DA結(jié)果中，不同基原吳茱萸藥材之間的差異性質(zhì)量標(biāo)志物也存在差異。此外，對(duì)吳茱萸藥材中4種指標(biāo)性成分同時(shí)進(jìn)行測(cè)定。由定量結(jié)果可知，3種基原吳茱萸藥材中，去氫吳茱萸堿的含量較為接近；石虎吳茱萸中吳茱萸堿、吳茱萸次堿和水仙苷的含量最高，其次是吳茱萸藥材，疏毛吳茱萸最低。由此看出，吳茱萸各化學(xué)成分的含量與基原品種密切相關(guān)，不同基原的吳茱萸藥材質(zhì)量具有明顯差異。本實(shí)驗(yàn)建立的吳茱萸定量指紋圖譜簡(jiǎn)單可靠，可為吳茱萸藥材質(zhì)量的綜合評(píng)價(jià)提供一定的參考依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突