辣木葉提取物對便秘小鼠潤腸通便的作用及機制研究

黨 玥 ，田夢媛 ，王承瀟 ，曲 媛 ，崔秀明 *，楊 野 *

1.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500

2.云南省三七資源可持續(xù)利用重點實驗室，云南 昆明 650500

便秘是由多種病因引起的常見病癥，排便次數(shù)減少、排便時間延長是便秘的常見癥型，是由胃腸功能紊亂導(dǎo)致的一種疾病[1]。長期便秘會造成腸道微生態(tài)失衡，還有可能誘發(fā)腸梗阻或腸道惡性腫瘤。此外，長期便秘還易引發(fā)神經(jīng)衰弱、心腦血管等疾病。目前，促進(jìn)胃腸運動的西藥通常伴隨著臨床不良反應(yīng)，長期使用潤腸通便的中藥可能出現(xiàn)藥物依賴、損傷脾胃等癥狀。因此，尋找出一種不良反應(yīng)小并能改善便秘癥狀的藥物至關(guān)重要。

辣木Moringa oleiferaLam.為辣木科辣木屬常綠或半落葉植物，最早記錄于公元前印度醫(yī)學(xué)寫本《妙聞本集》和《遮羅迦本集》中[2]。在印度，辣木葉用途最為廣泛，可以降低膽固醇、改善便秘、治療糖尿病、抑制腫瘤細(xì)胞并誘導(dǎo)其凋亡；其根、花、莖、豆莢、籽也可以治療潰瘍、抗氧化、降血糖、抗菌、抑制肝損傷等[3]。在南亞、南非等國家，辣木全株可以治療瘧疾、頭痛、糖尿病等疾病。我國于100多年前引種印度辣木，如今云南、廣東、海南等地均有栽培。因辣木葉產(chǎn)量大，目前對辣木的研究多集中在葉上。研究表明，辣木葉水提物可以降血糖、提高抗氧化酶活性、降低脂質(zhì)過氧化水平等[4]；辣木葉甲醇提取物具有抗氧化、抗癌等作用[5]；辣木葉乙醇提取物具有護(hù)肝、降血壓、保護(hù)心臟等功效[6]。因辣木含有黃酮、生物堿、皂苷、多糖等多種成分[7]，以辣木葉提取物作為考察對象更能反映出辣木在臨床的應(yīng)用效果。

本研究通過失水燥結(jié)法建立小鼠便秘模型，探討辣木葉提取物對便秘小鼠的潤腸通便作用及其作用機制，為辣木葉治療便秘提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SPF級昆明種小鼠90只，雌雄各半，8周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自湖南斯萊克景達(dá)動物實驗有限公司，動物許可證號SCXK（湘）2019-0004。動物于實驗動物中心（恒溫25 ℃，12 h光/暗周期）適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。動物實驗經(jīng)昆明理工大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號PZWH（滇）K。

1.2 藥材

辣木葉采自于云南省元謀縣熱作所，經(jīng)昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院崔秀明研究員鑒定為辣木M.oleiferaLam.的干燥葉。

1.3 藥品與試劑

對照品紫云英苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號AF20063001）、異槲皮苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號AF9030801）購自成都埃法生物科技有限公司；酚酞片（批號180413，50 mg/片）購自山西亨瑞達(dá)制藥有限公司；胃動素ELISA試劑盒（批號1903M09）、胃泌素ELISA試劑盒（批號1903M15）、內(nèi)皮素ELISA試劑盒（批號1903M17）、一氧化氮ELISA試劑盒（批號1903M33）購自武漢酶免生物科技有限公司；胃動素抗體（批號GR42490-50）、內(nèi)皮素抗體（批號GR3227037-1）、胃泌素抗體（批號GR475102-41）購自英國Abcam公司；內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitrieoxide synthase，eNOS）抗體（批號HN0824）購自杭州華安生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體（批號GB0207）購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.4 儀器

AX124ZH電子分析天平（奧豪斯儀器有限公司）；酶標(biāo)儀（德國BMG Labtech公司）；LC-20A高效液相色譜儀（日本島津公司）；TDZ5-WS臺式低速離心機（湖南湘儀實驗儀器設(shè)備有限公司）；Nikon DS-U3顯微鏡（日本尼康公司）。

2 方法

2.1 辣木葉提取物成分測定

2.1.1 色譜條件[8]YMC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為0.05%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～35 min，18% B；35～40 min，18%～45% B；40～50 min，45%～100% B；50～75 min，100%～18% B；體積流量為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；柱溫為30 ℃；檢測波長為360 nm。

2.1.2 對照品溶液的制備 稱定異槲皮苷和紫云英苷對照品1.6 mg至量瓶中，以甲醇溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度為1.6 mg/mL的對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備

（1）辣木葉醇提物：取辣木葉10 g，加入300 mL 70%乙醇回流提取40 min，濃縮。用甲醇超聲溶解并過微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得辣木葉醇提物。

（2）辣木葉水提物：取辣木葉10 g，加入500 mL純水，85～95 ℃反復(fù)浸提3次，合并濾液后濃縮。用甲醇超聲溶解并過微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得辣木葉水提物。

2.1.4 線性關(guān)系考察 對照品溶液用甲醇分別稀釋成質(zhì)量濃度分別為1.6、0.8、0.4、0.2、0.1 mg/mL的對照品儲備液，進(jìn)樣檢測，記錄峰面積并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：紫云英苷Y＝3×107X－5×106（r2＝0.999 5）；異槲皮苷Y＝3×107X－82 784（r2＝0.999 9），表明線性關(guān)系良好。

2.1.5 方法學(xué)考察 取同一批次的辣木葉提取物供試品和對照品，進(jìn)樣檢測，進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性以及加樣回收率試驗。

（1）精密度試驗：取對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，以峰面積計算紫云英苷和異槲皮苷的RSD值分別為0.49%、0.87%，表明儀器精密度良好。

（2）穩(wěn)定性試驗：取對照品溶液分別于0、4、6、8、12、24、48 h進(jìn)樣，以峰面積計算紫云英苷和異槲皮苷的RSD值分別為0.89%、1.37%，表明對照品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

（3）重復(fù)性試驗：制備6份供試品溶液，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計算RSD值為1.07%、0.69%，表明此測定方法重現(xiàn)性良好。

（4）加樣回收率試驗：取6份已測定的供試品溶液，按藥材中紫云英苷和異槲皮苷的120%的量加入對照品溶液，計算加樣回收率分別為99.58%、98.98%，RSD值分別為0.48%、0.90%。

2.2 碳末混懸液的制備

在800 mL水中加入100 g阿拉伯樹膠，煮沸，溶解后再加入50 g活性炭；煮沸3次，冷卻后定容至1 L備用。

2.3 造模、分組與給藥

根據(jù)參考文獻(xiàn)報道[9]以及預(yù)實驗探索，將小鼠隨機分為對照組、模型組、酚酞（0.05 g/kg）組以及辣木葉醇提物低、中、高劑量（0.5、1.0、2.0 g/kg）組和辣木葉水提物低、中、高劑量（0.5、1.0、2.0 g/kg）組，每組10只。按照文獻(xiàn)方法[10]，第1～4天，對照組以常規(guī)飼料喂養(yǎng)，模型組和各給藥組喂食大米并禁水建立便秘模型。第5～8天，各組以常規(guī)飼料喂養(yǎng)，各給藥組ig相應(yīng)藥物（10 mL/kg），對照組和模型組ig等劑量的生理鹽水，1次/d。

2.4 辣木葉提取物對便秘小鼠排便參數(shù)的影響

第8天，各組小鼠ig碳末混懸液（10 mL/kg）再ig相應(yīng)藥物，記錄每只小鼠首粒黑便的時間、6 h內(nèi)排便總數(shù)和黑便數(shù)，測定糞便含水率。

2.5 辣木葉提取物對便秘小鼠胃腸運動的影響

各組小鼠脫頸椎處死，取全胃組織，稱定胃全質(zhì)量、凈質(zhì)量；分離腸系膜，剪取腸管，測量小腸總長度和碳末推進(jìn)長度[11]，并計算胃排空率和小腸推進(jìn)率。

胃排空率＝1－(胃全質(zhì)量－胃凈質(zhì)量)/0.6

小腸推進(jìn)率＝墨汁推進(jìn)長度/小腸總長度

2.6 辣木葉提取物對便秘小鼠小腸組織病理變化的影響

各組小鼠取距離盲腸部位2 cm處的回腸1～2 cm，用固定液固定24 h以上，進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.7 辣木葉提取物對便秘小鼠血清中胃動素、內(nèi)皮素、胃泌素和一氧化氮水平的影響

小鼠眼球取血1.5 mL，4 ℃、3500 r/min離心10 min，取上層血清，按照ELISA試劑盒測定血清中胃動素、內(nèi)皮素、胃泌素和一氧化氮水平。

2.8 辣木葉提取物對便秘小鼠小腸組織胃動素、內(nèi)皮素、胃泌素和eNOS表達(dá)的影響

取各組小鼠小腸組織石蠟切片，脫蠟至水，抗原修復(fù)，阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶，血清封閉，加入胃動素、內(nèi)皮素、胃泌素和eNOS抗體孵育，再加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體，DAB顯色，復(fù)染細(xì)胞核，脫水封片，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.9 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 19.0軟件中單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行處理。

3 結(jié)果

3.1 辣木葉提取物成分測定

辣木葉提取物的HPLC色譜見圖1，因紫云英苷和異槲皮苷作為辣木葉中的黃酮類成分，含量高并易檢測，因此以其作為檢測指標(biāo)。辣木葉醇提物中紫云英苷和異槲皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.361 3%、0.348 0%，辣木葉水提物中紫云英苷和異槲皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.284 6%、0.040 1%。

圖1 辣木葉提取物的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of extract from Moringa oleifera leaves

3.2 辣木葉提取物對便秘小鼠排便參數(shù)的影響

如表1所示，與對照組比較，模型組小鼠體質(zhì)量顯著降低（P＜0.01），小鼠活動次數(shù)減少、毛色暗淡，首粒黑便時間顯著增加（P＜0.01），6 h排便數(shù)與黑便數(shù)明顯減少（P＜0.01），糞便含水率顯著降低（P＜0.01），表明失水燥結(jié)模型制備成功。與模型組比較，各給藥組小鼠首粒黑便時間顯著降低（P＜0.01），糞便含水率顯著升高（P＜0.05、0.01）；辣木葉醇提物中、高劑量組及水提物高劑量組小鼠6 h排便數(shù)明顯增加（P＜0.05）；辣木葉醇提物中、高劑量組及辣木葉水提物各劑量組小鼠黑便數(shù)明顯增加（P＜0.05、0.01）。

表1 辣木葉提取物對便秘小鼠排便參數(shù)的影響 (±s , n=10)Table 1 Effect of extract of M.oleifera leaves on defecation parameters of constipated mice (±s , n=10)

表1 辣木葉提取物對便秘小鼠排便參數(shù)的影響 (±s , n=10)Table 1 Effect of extract of M.oleifera leaves on defecation parameters of constipated mice (±s , n=10)

與對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01##P ＜ 0.01 vs control group; *P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 vs model group

組別 劑量/(g·kg-1) 體質(zhì)量/g 首粒黑便時間/min 糞便總數(shù)/粒 黑便數(shù)/粒 糞便含水率/%對照 — 33.20±3.48 113.10±7.00 55.80±1.46 54.00±2.38 53.26±2.88模型 — 24.27±2.19## 210.80±3.91## 43.70±2.12## 40.00±2.26## 35.87±2.20##酚酞 0.05 23.39±1.54 117.80±7.05** 49.40±1.26* 44.80±1.57 41.41±2.65*辣木葉醇提物 0.5 25.66±3.04 138.90±9.33** 44.70±3.36 42.50±1.52 38.21±2.51*1.0 23.66±2.95 131.20±9.15** 52.20±0.60* 48.00±2.40** 45.36±1.92*2.0 25.33±1.79 125.60±5.32** 56.00±2.40* 53.90±1.64** 53.50±4.09*辣木葉水提物 0.5 23.32±1.76 134.60±3.29** 42.80±1.94 39.60±1.25* 42.71±4.14*1.0 23.33±1.74 121.50±18.29** 45.03±1.04 44.30±1.70* 48.80±3.06*2.0 24.64±2.03 128.50±13.87**54.40±1.77* 50.50±1.23* 57.77±4.87**

3.3 辣木葉提取物對便秘小鼠胃腸運動的影響

如圖2所示，與對照組比較，模型組小鼠胃排空率和碳末推進(jìn)率顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠胃排空率和碳末推進(jìn)率均顯著升高（P＜0.05、0.01），表明辣木提取物可以加速便秘小鼠胃排空和腸道蠕動。

圖2 辣木葉提取物對便秘小鼠胃腸運動的影響 (±s , n=10)Fig.2 Effect of extract of M.oleifera leaves on gastrointestinal motility of constipated mice (±s , n=10)

3.4 辣木葉提取物對便秘小鼠小腸組織病理變化的影響

如圖3所示，對照組小鼠小腸絨毛密集且排列整齊，未發(fā)現(xiàn)病理變化；模型組小腸絨毛明顯變短，斷裂嚴(yán)重，柱狀細(xì)胞嚴(yán)重受損，細(xì)胞核脫落，黏膜層、肌層存在病理變化；各給藥組小鼠小腸絨毛斷裂減少、柱狀細(xì)胞受損減輕，表明辣木葉提取物能夠修復(fù)便秘小鼠小腸損傷。

圖3 辣木葉提取物對便秘小鼠小腸組織病理變化的影響 (HE, ×200)Fig.3 Effect of extract of M.oleifera leaves on pathological changes of small intestine of constipated mice (HE, × 200)

3.5 辣木葉提取物對便秘小鼠血清中胃動素、內(nèi)皮素、胃泌素和一氧化氮水平的影響

如圖4所示，與對照組比較，模型組小鼠血清中胃動素、內(nèi)皮素和胃泌素水平顯著降低（P＜0.05、0.01），一氧化氮水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠血清中胃動素、內(nèi)皮素和胃泌素水平顯著升高（P＜0.05、0.01），辣木葉醇提物及水提物中、高劑量組一氧化氮水平顯著降低（P＜0.05、0.01），表明辣木葉提取物能夠通過調(diào)節(jié)血清因子水平，從而緩解便秘。

圖4 辣木葉提取物對便秘小鼠血清中胃動素、內(nèi)皮素、胃泌素和一氧化氮水平的影響 (±s , n=10)Fig.4 Effect of extract of M.oleifera leaves on levels of motilin, endothelin, gastrin and nitric oxide in serum of constipated mice (±s , n=10)

3.6 辣木葉提取物對便秘小鼠小腸組織胃動素、內(nèi)皮素、胃泌素和eNOS表達(dá)的影響

如圖5所示，胃動素、內(nèi)皮素、胃泌素和eNOS在小鼠小腸黏膜胞質(zhì)中表達(dá)，呈淡黃、黃色或棕黃色。與對照組相比，模型組小鼠小腸eNOS陽性表達(dá)增加，胃動素、內(nèi)皮素、胃泌素陽性表達(dá)減少；與模型組相比，各給藥組小腸eNOS陽性表達(dá)減少，胃動素、內(nèi)皮素、胃泌素陽性表達(dá)增加。

圖5 辣木葉提取物對便秘小鼠小腸組織胃動素、內(nèi)皮素、胃泌素和eNOS表達(dá)的影響 (×200)Fig.5 Effect of extract of M.oleifera leaves on expressions of motilin, endothelin, gastrin and eNOS in small intestine of constipated mice (× 200)

4 討論

消化功能紊亂的癥狀之一是便秘，表現(xiàn)為胃腸運動和功能障礙。目前，促進(jìn)胃腸運動的西藥以西沙比利、莫沙必利和嗎丁啉等為主，此類藥物雖然見效快，但伴隨著消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等不良反應(yīng)。中藥中也有潤腸通便的藥材，如番瀉葉、大黃、芒硝等能夠直接刺激腸黏膜或提高腸內(nèi)滲透壓，使腸蠕動增加而產(chǎn)生瀉下效應(yīng)，但長期使用會出現(xiàn)藥物依賴、結(jié)腸黑病變等不良反應(yīng)[12]。辣木不僅具有降血糖、抗氧化、抑制腫瘤細(xì)胞并誘導(dǎo)其凋亡、調(diào)節(jié)胃腸運動等作用[2]，還有富含蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)等，于2012年被列為“新資源食品”[13]。

本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組小鼠的首粒黑便時間明顯延長，6 h內(nèi)排便數(shù)量、胃排空率顯著降低，表明便秘可致小鼠胃腸運動障礙。張維英等[14]用生白術(shù)的提取液和揮發(fā)油治療便秘小鼠，發(fā)現(xiàn)給藥后小鼠排便粒數(shù)增多，糞便水分明顯增加，首次排黑便時間縮短，與本研究結(jié)果一致；表明辣木葉提取物能夠改善小鼠排便狀況，緩解便秘。小腸是消化和吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要場所，與動物的健康生長密切相關(guān)。模型組小鼠小腸絨毛斷裂，柱狀細(xì)胞受損嚴(yán)重；辣木葉提取物高劑量組腸絨毛形態(tài)結(jié)構(gòu)趨于完整，表明辣木葉提取物能夠保護(hù)便秘對小鼠造成的腸道結(jié)構(gòu)損傷，這可能由于辣木中的多酚、黃酮、皂苷等活性成分能夠調(diào)控小腸生長因子，并修復(fù)便秘小鼠引起的小腸絨毛和結(jié)構(gòu)的損傷，進(jìn)一步提高小腸的吸收消化功能[15]。

胃腸道的運動和分泌主要受胃腸內(nèi)分泌細(xì)胞分泌的激素和中樞腸神經(jīng)系統(tǒng)釋放的神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)，并受相應(yīng)受體興奮和抑制平衡的調(diào)節(jié)[16]。其中胃泌素和胃動素刺激胃酸分泌，促進(jìn)胃收縮并促進(jìn)胃排空。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，辣木葉醇提物和水提物高劑量組小鼠血清中胃泌素和胃動素水平顯著升高，與文獻(xiàn)報道一致[17]。一氧化氮是一種新型信號分子，能夠通過抑制胃腸道興奮性，減緩胃腸運動及胃排空，引發(fā)便秘；內(nèi)皮素是調(diào)節(jié)心血管功能的重要因子，便秘還是多種心腦血管疾病的誘發(fā)因素，因此維持體內(nèi)內(nèi)皮素正常水平對于預(yù)防心腦血管疾病有重要作用[18]。右歸丸能夠降低便秘大鼠血清中一氧化氮、5-羥色胺水平，從而改善大鼠便秘癥狀[19]。本研究結(jié)果顯示，辣木葉醇提取物和水提物高劑量組小鼠血清中內(nèi)皮素水平顯著升高，一氧化氮水平顯著降低，與免疫組化結(jié)果趨勢相同。表明辣木葉提取物對津虧燥結(jié)所致胃腸功能障礙小鼠具有調(diào)節(jié)作用，其作用機制可能為通過提高小鼠血清中內(nèi)皮素水平從而維持心腦血管的正常功能，通過增加小鼠血清中胃泌素和胃動素水平、降低一氧化氮水平，從而改善胃腸吸收、運動功能，緩解便秘。

綜上所述，辣木葉提取物能夠加快小鼠胃腸運動，可能與修復(fù)便秘引起的腸道損傷、調(diào)節(jié)胃腸相關(guān)激素及相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突