免疫親和層析柱純化大豆球蛋白多克隆抗體的研究

姚利利，席 俊，陳慧彬，陳 陽，皮江一，李 潘

大豆是人類食物過敏源之一[1]。調(diào)查表明，一般人群的大豆過敏患病率可能高達0.5%，而兒童高達13%[2]。據(jù)報道，至少有19 種大豆蛋白與大豆過敏患者的人血清IgE 結(jié)合，其中包含大豆球蛋白。大豆球蛋白結(jié)構(gòu)復雜，為六聚體結(jié)構(gòu)（兩層三聚體組成），三聚體內(nèi)部各多肽鏈通過二硫鍵和氫鍵配對交替連接在一起[3]。大豆球蛋白（Gly m 6）的變應原特性被廣泛描述[4]。研究發(fā)現(xiàn)86%大豆過敏的患者的IgE 與Gly m 6（大豆球蛋白）結(jié)合[5]。關于大豆過敏蛋白的致敏表位鑒定一直是國內(nèi)外學者研究的熱點，而純度高的目標抗體更有利于篩選和鑒定抗原表位。層析法和非層析法常用于抗體的純化，一般非層析法后再進行層析純化[6]。效果較佳的硫酸銨沉淀法為非層析法之一，收率達91%[7]。免疫親和層析利用抗體和抗原的相互作用來純化抗體[8]。該方法被用來促進低致敏性產(chǎn)品的開發(fā)[9-10]?？乖蛘呖贵w偶聯(lián)在柱填料上，具有高度選擇性和較好的純化效果[11-12]。本試驗將大豆球蛋白偶聯(lián)在免疫親和層析柱填料上作為配基，進樣的抗血清提前經(jīng)硫酸銨沉淀，待目標抗體與大豆球蛋白充分反應吸收后洗脫2 次。首次非特異性洗脫物主要為其它非特異性抗體和雜蛋白，經(jīng)特異性洗脫的為目標抗體。該親和層析具有純化過程簡單、快速、產(chǎn)品純度高等優(yōu)點。該方法的應用將有利于大豆球蛋白過敏原的深入研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆球蛋白、抗大豆球蛋白多抗血清，實驗室自制；CNBr activities sephrose 4B（免疫親和層析柱），美國GE 公司；親和層析柱、HRP 標記羊抗兔IgG、0.45 μm 濾膜，北京索萊寶科技有限公司；紫外檢測儀，上海青浦滬西儀器廠；Multiskan 酶標儀、Nanodrop ND-2000 超微量核酸蛋白測定儀，美國Thermo 公司。

1.2 試劑配制

試劑的配制參照文獻[13]，[14]的方法，試劑溶解均用超純水，1 mmol/L HCl：取16.424 μL 的濃鹽酸滴加入200 mL 超純水并混勻。偶聯(lián)液：取2.19 g NaHCO3，7.3 g NaCl 溶解并用2 mol/L HCl定容為250 mL，調(diào)pH 值至8.3。封閉液：取1.21 g Tris 溶解定容至100 mL 并調(diào)pH 值至8.0。平衡緩沖液：取1.45 g Na2HPO4·12H2O、0.1 g KH2PO4、4.0 g NaCl，0.1 g KCl 溶解并定容至500 mL。洗脫液：取0.75 g G1y，調(diào)pH 值至2.7 并定容至100 mL。再生A 液：取16.4 g 醋酸鈉，5.84 g NaCl，溶解后定容至200 mL，并調(diào)pH 值至4.0。再生B 液：取2.42 g Tris，5.84 g NaCl 定容至200 mL 并調(diào)pH 值至8.0。Tris 中和液：取Tris 6.09 g 溶解并調(diào)pH 值為9.0，定容至50 mL。

1.3 試驗方法

1.3.1 以大豆球蛋白為配基制備免疫親和層析柱試驗方法參照文獻[13，14]并改進，取CNBr-activitied-Sephrose-4B 干粉0.6 g，用1 mmol/L HCl溶脹20 min，并用50 mL 1 mmol/L HCl 沖洗，用偶聯(lián)液洗滌柱子，獲得柱材約2 mL。用偶聯(lián)緩沖液溶解大豆球蛋白粉末后過0.45 μm 水系濾膜（防止不溶性蛋白堵塞柱子），加入柱材與之充分混合，置于搖床上3 h，用偶聯(lián)液洗滌未偶聯(lián)蛋白，并收集全部沖洗液后測定蛋白濃度，計算柱容量。加入過量封閉液（含BSA），室溫搖晃2 h，充分封閉未結(jié)合活性位點。長時間不用時，可加入0.02%NaN3抑菌，4 ℃保存。

1.3.2 免疫親和層析純化大豆球蛋白多克隆抗體參照文獻[13]的方法并加以改進：（1）上樣，封閉后將介質(zhì)轉(zhuǎn)入3 mL 柱子，用平衡緩沖液洗滌平衡柱體，取硫酸銨分級沉淀后的兔抗血清0.77 mL，過0.45 μm 水系濾膜，將多抗緩慢加入柱子內(nèi)，充分混合；（2）洗滌和洗脫，用平衡緩沖液洗脫未結(jié)合的蛋白，自然流出，待非特異性洗脫至基線，用洗脫液特異性洗脫，同樣自然流出，收集洗脫液。由于較低pH 值會破壞抗體活性，因此加入少量中和緩沖液用于保護抗體；（3）柱子的再生，用再生A、B 液循環(huán)3 次洗滌，再用PBS 平衡緩沖液洗滌平衡（洗滌均5 倍柱床體積）。

1.3.3 純化前、后抗血清的純度鑒定 對原血清、硫酸銨沉淀后的血清和免疫親和層析后的血清樣品純度分析，將血清上樣質(zhì)量濃度調(diào)至2 mg/mL，參照文獻[15]配置蛋白電泳膠。取出凝膠室溫染色3 h，脫色液脫色后用Tanon 2500 凝膠成像儀分析。

1.3.4 純化后抗體的效價測定 酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）是一種快速，高度靈敏且特異的血清學檢測方法[16]。參照文獻[17]的方法進行間接ELISA 測定抗血清效價，設置試驗所需的孔板數(shù)，CBS（碳酸鹽緩沖液pH 9.6，0.05 mol/L）將大豆球蛋白稀釋為2.5 μg/mL，4 ℃包被過夜，100 μL/孔，用PBST 洗板，拍干、37 ℃封閉（1% BSA）2 h，洗板，拍干、一抗為洗脫峰收集液與穿透峰收集液依次倍比稀釋，孵育1 h，洗板，拍干、加酶標二抗（1∶5 000 倍稀釋），100 μL/孔，37 ℃孵育30 min，洗板，拍干、避光顯色15 min、加入50 μL/孔H2SO4終止反應；酶標儀測定每孔OD450值。

1.3.5 間接競爭ELISA 測定純化前、后抗體特異性 參考文獻[18]的方法進行純化前、后抗體特異性的鑒定，通過分析原血清、硫酸銨初步純化血清、硫酸銨初步純化再過柱3 種血清進行特異性對比，分析半數(shù)抑制率IC50（抗血清的敏感性）和交叉反應率（CR）的變化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫親和層析柱的柱容量測定

溶脹后的CNBr-activated Sepharose 4B 與0.5 mL 質(zhì)量濃度為17.7 mg/mL 的大豆球蛋白偶聯(lián)反應結(jié)束后，用至少5 倍于凝膠體積偶聯(lián)液洗滌未偶聯(lián)蛋白，至檢測洗出液的OD280＜0.02。收集全部的洗滌液用超微量核酸蛋白檢測儀檢測洗滌出的蛋白15 mL 質(zhì)量濃度為0.025 mg/mL，因此偶聯(lián)在凝膠上的大豆球蛋白約為8.48 mg，即偶聯(lián)率達96%。

2.2 免疫親和層析結(jié)果

硫酸銨沉淀后的多抗血清進入親和柱時，與親和柱上連接的大豆球蛋白配基結(jié)合，不與大豆球蛋白抗原特異性結(jié)合的雜蛋白被洗掉，即為圖1中的穿透峰。由于本試驗中上樣濃度較高，樣品自然流下（未施加壓力），因此，親和層析圖譜上穿透峰較高、較寬，經(jīng)核酸蛋白定量檢測儀測定蛋白含量為4.08 mg/mL。當用pH 2.7 的洗脫液洗脫時，得到圖中標注的洗脫峰，得到目標抗體6 mL，經(jīng)質(zhì)量濃度測定為0.3 mg/mL 的目標抗體。圖中未標注的峰為操作過程中的氣泡峰。

圖1 抗血清過柱純化圖Fig.1 Antiserum purification column

2.3 純化前、后大豆球蛋白特異性抗體SDSPAGE

IgG 抗體是由一條重鏈和一條輕鏈構(gòu)成，顯示為兩條蛋白條帶，由圖2可以看出，未經(jīng)任何處理的血清含有較多的雜蛋白（泳道1），經(jīng)硫酸銨分級沉淀后（泳道2），血清純度得到提高，大部分雜蛋白被除去，但仍含有少量的雜蛋白。4 泳道為雜蛋白，除含有部分非抗體蛋白外，可以看出雜蛋白中還含有部分非抗大豆球蛋白目標抗體。將硫酸銨分級沉淀后的抗體過柱純化后（泳道3），泳道中已基本不含雜蛋白，因此，得到高純度的抗大豆球蛋白目標抗體。

圖2 抗血清純化前、后SDS-PAGEFig.2 SDS-PAGE before and after purification of antiserum

2.4 免疫親和層析抗體的間接ELISA 檢測

對穿透峰（非特異性洗脫）和洗脫峰（特異性洗脫）收集液進行間接ELISA 測定：結(jié)果見表1，由表1可知洗脫峰中的大部分為抗大豆球蛋白目標抗體，洗脫峰收集液稀釋至128 倍后間接ELISA 結(jié)果顯示為陽性，穿透峰收集液（雜蛋白）稀釋兩倍之后即為陰性，結(jié)果表明大部分的雜蛋白和非目標抗體基本被去除，免疫親和層析成功洗脫出大豆球蛋白特異性抗體。

表1 抗血清過柱非特異性洗脫與特異性洗脫的ELISA 鑒定Table 1 ELISA identification of non-specific elution and specific elution of antiserum by column

2.5 免疫親和層析前、后抗體特異性鑒定結(jié)果

由表2可以看出，純化前、后抗血清的敏感性變化不大，過柱后的抗血清敏感性最好，抗血清在過柱純化后與花生分離蛋白基本不存在交叉反應，芝麻蛋白與純化前、后的抗血清都無交叉反應，在純化前，抗血清與β-伴大豆球蛋白的交叉反應率（CR）為8.6%，經(jīng)硫酸銨分級沉淀后CR 有所降低，經(jīng)過柱后的抗血清CR 為0.5%，這可能與偶聯(lián)到柱填料上的蛋白的純度有關（會含有少量的β-伴大豆球蛋白），結(jié)果表明，試驗得到了特異性好的抗大豆球蛋白目標抗體。

表2 抗血清純化前、后特異性鑒定Table 2 Specific identification of antiserum before and after purification

3 結(jié)論

本試驗抗血清在經(jīng)過硫酸銨初步純化后與免疫親和層析柱偶聯(lián)來制備免疫親和柱，利用抗原抗體相互作用對多抗血清純化并進行免疫學特性鑒定。制備抗大豆球蛋白抗體時，除含有特異性抗體外,還有球蛋白等雜質(zhì),因此對動物免疫血清純化是必要的[19]。硫酸銨分級沉淀會除去雜蛋白，但去除不完全，僅為初步純化，因此通過SDSPAGE 所呈現(xiàn)出來的電泳圖會含有較多的雜蛋白以及非抗大豆球蛋白抗體，抗體經(jīng)過柱純化后，經(jīng)檢測，純度得到很大提高。將過柱所得到的非特異性洗脫液和特異性洗脫液進行間接ELISA 試驗，非特異性洗脫液（雜蛋白）中所含的抗體基本不與孔板中所包被的大豆球蛋白結(jié)合而呈陽性反應，特異性洗脫的抗體在經(jīng)128 倍稀釋后與大豆球蛋白仍呈陽性反應。間接競爭ELISA 對抗血清特異性鑒定結(jié)果顯示，抗血清與β-伴大豆球蛋白的交叉反應率很低，試驗成功獲得了純度高、敏感性好、特異性強的抗大豆球蛋白目標抗體。