發(fā)酵肉制品中生物活性肽的研究進展

王寶麗，張開屏，劉嘉琪，張慧敏，李少英，靳 燁，田建軍*

發(fā)酵肉制品是在自然或人工控制條件下，利用微生物的發(fā)酵或酶的水解作用使原料肉發(fā)生一系列生物化學(xué)及物理變化，從而形成風(fēng)味、色澤和質(zhì)地獨特且具有較長保藏期的肉制品。發(fā)酵肉制品歷史悠久，2 000 多年前位于地中海地區(qū)的古羅馬人就通過自然發(fā)酵、成熟、干燥生產(chǎn)出發(fā)酵香腸[1]。目前，世界上發(fā)酵肉制品主要為火腿、培根和香腸等3 大類。我國著名的傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品有金華火腿、宣威火腿、牛干巴、廣式香腸和川式臘肉等[2-3]。生物活性肽是具有一定的營養(yǎng)價值，還可在生物體內(nèi)發(fā)揮特定生理功能的多肽類有機物。大多數(shù)已知的生物活性肽通常含有2～20 個氨基酸殘基，并以特定的序列連接[4]。近幾十年來，在制藥工程、臨床治療、功能食品的研發(fā)或營養(yǎng)組學(xué)等方面，生物活性肽正在被廣泛應(yīng)用。目前，化學(xué)合成的生物活性肽被用于治療心血管、胃、腸道、肥胖或腫瘤等疾病[5]。然而，經(jīng)化學(xué)合成或修飾的功能肽雖兼具功能和經(jīng)濟效益，但其會在腎臟和肝臟等器官積累，導(dǎo)致許多嚴重的副作用。近年來，天然來源的生物活性肽是新的研究趨勢[6]。

1950年，Mellander[7]發(fā)現(xiàn)了具有增強佝僂病患者骨鈣化的功能酪蛋白磷酸化肽，這標志著食物源性的生物活性肽的發(fā)現(xiàn)。學(xué)者們發(fā)現(xiàn)，一些食源性的蛋白質(zhì)包括動物蛋白、大豆蛋白、豌豆蛋白等，經(jīng)生物酶法處理得到的肽類物質(zhì)多具有如抗菌、抗癌、促進胰島素分泌、免疫調(diào)節(jié)、抗高血壓等生物活性功能[8-9]。在肉制品加工過程中，源于肌肉中內(nèi)源酶和微生物酶的復(fù)合作用會使蛋白質(zhì)發(fā)生強烈的水解作用而生成大量游離氨基酸（free amino acid，F(xiàn)AA）和分子質(zhì)量各異的肽類化合物[10]。近年來，大量研究報道發(fā)酵肉制品特定的生產(chǎn)加工過程會產(chǎn)生具有多種功能的生物活性肽[11-12]。作為生物活性肽重要的食物來源，發(fā)酵肉制品中的生物活性肽成為近幾十年的研究熱點之一。本文綜述發(fā)酵肉制品中生物活性肽的研究進展。

1 生物活性肽的來源

蛋白質(zhì)是肉中最主要的成分，具有廣泛的功能特性，可形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，可與水、鹽等成分協(xié)同，在肉制品質(zhì)地、感官與營養(yǎng)品質(zhì)的形成中發(fā)揮重要作用[13]。肌球蛋白、肌動蛋白和膠原蛋白是肉中主要的結(jié)構(gòu)性蛋白[14]。在肉制品發(fā)酵過程中，蛋白質(zhì)會發(fā)生強烈的水解作用。蛋白質(zhì)水解一般分為兩個步驟：首先，內(nèi)源肽酶（主要為組織蛋白酶和鈣激活蛋白酶，溶酶體組織蛋白酶B 和D 被認為是導(dǎo)致發(fā)酵肉制品中第一次蛋白質(zhì)分解的主要內(nèi)肽酶）分解完整蛋白質(zhì)生成小肽[15-16]；然后，生成的小肽被外源肽進一步降解使N-端和C-端釋放單氨基酸、二肽或三肽[17]。

1.1 肌動蛋白的水解

肌動蛋白是肌原纖維中含量第二豐富的蛋白質(zhì)，是發(fā)酵肉制品中生物活性肽的主要來源之一[18]。肌動蛋白的水解主要發(fā)生于9 段氨基酸序列中分別位于肌動蛋白的4 個二級子域（如圖1）。大部分肽段水解于靠近N-端和C-端的序列1和序列9，序列1、3、4、5、9 位于第一子域（序列1部分位于第二子域）；序列2 位于第二子域，序列6 和8 位于第三子域；序列7 位于第四子域[19]。根據(jù)已知的組織蛋白酶B 裂解位點[20]，該酶可能在以下位點裂解肌動蛋白：Ala24-Gly25、Thr68-Leu69、Met49-Gly50、His75-Gly76、Gly76-Ile77、Lys86-Ile87、Thr105-Leu106、Thr251-Ile252、Lys330-Ile331和 Glu363-Tyr364；組織蛋白酶D 可能負責(zé)的裂解位點有：Cys12-Asp13、Thr79-Asn80、Thr91-Phe92、Thr91-Phe92、Lys120-Met121、Ile153-Val154、Leu155-Asp156、Lys240-Ser241、Trp358-Ile359、Thr91-Phe92、His103-Pro104、Lys120-Met121。但現(xiàn)無法確定是何種酶在Gly22-Phe23、Arg30-Ala31、Phe92-Tyr93、Arg97-Val98和Leu107-Thr108位點發(fā)生作用，因為這兩種組織蛋白酶都有一些共同的裂解位點。氨基肽酶會對部分肽段再次水解。大部分氨基肽酶會在動物被屠宰后失去活性，但有5 種氨基肽酶在動物死后依然具有活性，即亮氨酸、精氨酸、丙氨酰、焦戊二酰和蛋氨酸氨基肽酶。在其作用下會生成Phe、Leu、Lys 和Met 等FAA。溶酶體羧肽酶A 和B 在酸性pH 值條件下具有最佳活性，前者可水解疏水性氨基酸，而后者則具有更廣泛的水解活性[21]。二肽基肽酶（dipeptidyl peptidase，DPP）如DPPI、DPP II 和三肽基肽酶[22-23]，使肌動蛋白水解為二肽或三肽。此外，大部分學(xué)者認為鈣激活酶不會水解肌動蛋白。

圖1 肌動蛋白序列和3D 結(jié)構(gòu)圖[19]Fig.1 Picture of the actin sequence and 3D structure[19]

1.2 肌球蛋白的水解

肌球蛋白是肌原纖維的主要組成部分，與肌動蛋白、原肌球蛋白和肌鈣蛋白一起參與肌肉收縮和各種非肌肉細胞運動。肌球蛋白分子是由兩條完全相同重鏈（myosin heavy chain，MHC）和兩組輕鏈（myosin light chain，MLC）組成的六聚體。源于肌球蛋白的生物活性肽主要由MHC 水解所得。暫時未有研究確定MHC 的全部氨基酸序列。Mora 等[24]在經(jīng)24 個月腌制的伊比利亞干腌火腿中識別出部分水解于MHC 的肽段序列。Gallego等[25]利用nESI-LC-MS/MS 技術(shù)在經(jīng)14 個月腌制的土耳其干腌火腿中識別出水解于MHC 的氧化肽氨基酸序列。在經(jīng)9 個月腌制的西班牙干腌火腿中，已識別由組織蛋白酶B、H、L 水解MHC 所得主要肽段為Ser2-Arg18、Lys19-Ser37、Thr71-Asp90、Thr71-Asp86、Val72-Asp90 等，可確定MHC 是生物活性肽的重要來源之一。外肽酶繼續(xù)水解小肽生成TS、TL、FD、VK、AT、QT 等二肽和SRE、TVQ、NAS、KIE、GKM 等三肽[26]。

1.3 肌漿蛋白的水解

肌漿蛋白系指肌漿中的蛋白質(zhì)，主要包括肌紅蛋白和參與肌肉收縮功能反應(yīng)的酶蛋白，例如糖酵解酶系、三羧酸循環(huán)及脂肪酸β-氧化酶系、氧化磷酸化酶系、電子傳遞體有關(guān)的酶系等。有研究認為，在發(fā)酵肉制品中肌漿蛋白的水解程度高于肌原蛋白[27-28]。肌紅蛋白（Myoglobin，Mb）是一種小分子蛋白，由珠蛋白與正鐵血紅素（Heme））結(jié)合而成。肌紅蛋白的種類和含量決定著發(fā)酵肉制品的顏色[29]。通過研究接種乳酸菌發(fā)酵的豬肉制品，發(fā)現(xiàn)在原料肉中含有肌紅蛋白，但在發(fā)酵后的樣品中卻沒有發(fā)現(xiàn)肌紅蛋白，證明在肉制品發(fā)酵過程中肌紅蛋白會發(fā)生強烈的水解作用[30]。組織蛋白酶B、L 和μ-激鈣酶參與肌酸激酶的水解，目前未見微生物酶參與這種蛋白質(zhì)水解相關(guān)報道。

2 生物活性肽的功能

生物活性肽的定義為：蛋白質(zhì)在酶解過程中產(chǎn)生的一些具有特殊生理調(diào)節(jié)功能的介于蛋白質(zhì)和氨基酸之間的低分子聚合物，由20 種天然氨基酸以不同組成和排列方式構(gòu)成的從二肽到復(fù)雜的線形、環(huán)形結(jié)構(gòu)的肽類的總稱。基于此認知，可將發(fā)酵肉制品中肽類物質(zhì)分為營養(yǎng)性和功能性兩類。而營養(yǎng)性肽是指具有與氨基酸和蛋白質(zhì)相似的營養(yǎng)功能，而功能性肽是在神經(jīng)系統(tǒng)和外分泌以及內(nèi)分泌過程中發(fā)揮特定的信使功能，或者發(fā)揮抗氧化、提高免疫力等功能，功能性肽即為生物活性肽[31]。生物活性肽的活性取決于其結(jié)構(gòu)，如氨基酸的組成、氨基酸在N-和C-端的類型、肽鏈的分子質(zhì)量和長度、氨基酸的電荷特性、疏水性和親水性、空間結(jié)構(gòu)等[32]。

2.1 降血壓生物活性肽

高血壓是導(dǎo)致心血管疾病的主要危險因素之一。在全球范圍內(nèi)，心血管疾病的死亡率遠高于癌癥，是全球死亡率最高的疾病。預(yù)計到2025年，全球?qū)⒂?5.6 億高血壓患者。隨著我國經(jīng)濟水平的發(fā)展，我國高血壓患病率逐年升高[33-34]。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）又稱羧基-二肽基-金屬肽酶，是腎活素血管緊張素系統(tǒng)（renin angiotensin system，RAS）的主要連接酶，參與周圍血壓的調(diào)節(jié)。它主要催化血管緊張素-Ⅰ轉(zhuǎn)化為血管緊張素-Ⅱ，即將鈍化的十肽轉(zhuǎn)化為活躍的八肽血管收縮劑。此外，ACE 會鈍化具有舒張血管功能的緩激肽。因此ACE 抑制劑具有降血壓的功能[35]。大量研究表明，發(fā)酵肉制品中包含具有降高血壓功能的生物活性肽-ACE 抑制劑[36]。由于其與血壓調(diào)節(jié)的關(guān)系，可作為控制心血管疾病發(fā)生的重要因子，其抑制活性是發(fā)酵肉制品中研究最為廣泛的生物活性肽之一[37-38]。在BIOPEP 數(shù)據(jù)庫中，目前已知的3 285 個生物活性肽根據(jù)功能性可分為三類：降血壓、抗氧化、抑菌，而降高血壓生物活性肽占比高達21.6%[39]。

ACE 的抑制活性通過體外實驗進行評估，用半抑制濃度IC50表示能夠抑制ACE 50%活性的肽濃度，并模擬胃腸道環(huán)境對肽的體外生物利用度和生物活性進行評價。此外，需要進行體內(nèi)實驗，自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）是公認的研究人類原發(fā)性高血壓的動物模型。

因為生物活性肽的功能和結(jié)構(gòu)具有相關(guān)性，通常具有較高ACE 抑制活性的肽在N-端含有芳香族或堿性氨基酸，在C-端則含有較多的疏水氨基酸和帶正電的氨基酸。Pro、Arg、Phe、Tyr 和Lys是抗高血壓活性肽中常見的氨基酸殘基[40]。伊比利亞干腌火腿中肽段可在8 h 后將SHR 收縮壓顯著降低12 mmHg，對其序列進行分析表明2 632個AA 中包含已知的ACE 抑制片段PPK、PAP 和AAP，重復(fù)次數(shù)分別為322，302，119[41]。生物活性肽的ACE 抑制活性在體外和體內(nèi)的實驗結(jié)果不同，在體外實驗中，RPR 的ACE 抑制性活性比KAPVA 低8 倍，但在體內(nèi)實驗中兩者降血壓活性相似。這可能是由于RPR 與底物有較高的親和力，或者在ACE 抑制外還存在一種未知食源肽的降壓機制。SHR 口服七肽FKGRYYP（IC50為0.55 μmol/L）后，血壓卻沒有下降。這表明ACE 活性在體內(nèi)也可能降低甚至消失。其原因可能是被細胞內(nèi)肽酶、消化道酶或血清酶水解喪失活性，肝臟中的修飾作用也會降低功能肽活性[36]。除了通過ACE 抑制肽調(diào)控血壓外，降高血壓活性肽還可以通過其它途徑調(diào)控血壓。例如降高血壓活性肽可以與RAS 系統(tǒng)中的腎素、精氨酸-一氧化氮途徑、內(nèi)皮素系統(tǒng)和Ca2+通道相互作用。最近的一些研究表明，食物源生物活性肽可以作為腎素抑制劑、鈣通道阻斷劑降血壓，還可以調(diào)節(jié)交感神經(jīng)系統(tǒng)，從而控制血壓[42-44]。

2.2 抗氧化生物活性肽

抗氧肽是清除重金屬、防止脂肪過氧化、降低細胞自氧化速率，并且能夠有效捕獲并中和自由基從而減少自由基對人體損害的一類活性物質(zhì)，因其分子質(zhì)量小、結(jié)構(gòu)緊湊，可最大限度捕捉和消除過多的自由基及有害物質(zhì)，抑制自由基的過氧化作用。發(fā)酵肉制品是抗氧化肽的天然來源之一。在BIOPEP 數(shù)據(jù)庫目前已知的3 285 個肽段中，抗氧化生物活性肽占比為16.1%[39]。據(jù)報道，我國金華火腿和宣威火腿中均含有抗氧化活性肽。金華火腿中分離鑒定所得肽段GKFNV 是最主要的自由基清除劑[45]。四肽DLEE 是宣威火腿中具有抗氧化活性的功能性肽段，當(dāng)其質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 時，可清除75.45%的DPPH 自由基[46]。在金華火腿中已分離并鑒定不同的抗氧化肽，如DLEE、GKFNV 和LPGGGHGDL 序列[47]。Vastag 等[48]研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵香腸中的抗氧化性是原料中的2 或3倍，在經(jīng)90 d 成熟期后，DPPH 自由基清除活性為50%、還原能力為0.97，而干燥18 h 后大于5 ku的肽段組分對DPPH 自由基的清除活性達到86%，而干燥72 h 后小于5 ku 的肽段其清除活性逐漸增加達到92%。有學(xué)者證明干發(fā)酵香腸中的小肽（<3 ku）對DPPH 自由基有較高的清除能力[24]。在發(fā)酵肉制品的加工生產(chǎn)過程中會發(fā)生氧化反應(yīng)，脂肪的過度氧化會產(chǎn)生不良的酸敗氣味，蛋白質(zhì)的氧化則會降低營養(yǎng)價值甚至危害人體健康[49-50]。發(fā)酵肉制品中的抗氧化肽也可以抑制脂肪和蛋白質(zhì)的氧化提高其感官品質(zhì)和營養(yǎng)價值。

2.3 其它功能

降血壓和抗氧化是發(fā)酵肉制品中生物活性肽最主要的功能特性，此外其還具有抗菌、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫力、提高記憶力等功能。Castellano等[51]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)10月腌制的西班牙干腌火腿中含有抑制李斯特菌的五肽RHGYM。Keska 等[52]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)酸乳清腌制的發(fā)酵牛肉在4 ℃成熟1 個月后會釋放大量生物活性肽，根據(jù)其功能性分類共有17 種生物活性（如表1～表3所示）。

表1 作用于心血管系統(tǒng)的主要肽段序列[52]Table 1 Main peptide sequences influencing the cardiovascular system[52]

（續(xù)表1）

表2 作用于免疫和神經(jīng)系統(tǒng)的主要肽段序列[52]Table 2 Main peptide sequences influencing the immune and nervous system[52]

表3 具有其它活性的主要肽段序列[52]Table 3 Main peptide sequences with other activities[52]

（續(xù)表3）

3 發(fā)酵肉制品中生物活性肽的研究方法

生物活性肽在食品領(lǐng)域的研究因食物基質(zhì)的復(fù)雜性，其提取分離方法也有很大差異。對于發(fā)酵肉制品中生物活性肽的研究首先需要將食物基質(zhì)中的多肽進行提取，并通過一種或多種技術(shù)串聯(lián)將多肽混合物進行逐級分離純化，并利用質(zhì)譜鑒定獲得肽段氨基酸序列或結(jié)構(gòu)，最后根據(jù)生物活性肽數(shù)據(jù)庫的信息對其生理功能進行鑒定，必要時需進行體內(nèi)實驗。Jang 等[53]先后使用超濾、SephadexG-25 尺寸排阻色譜、PR-HPLC 的手段分離牛肉蛋白的水解物，獲得了具有較強降血壓活性的肽段VLAQYC；Wang 等[54]通過SephadexLH-20 尺寸排阻色譜與RP-HPLC 聯(lián)用從牡蠣蛋白水解物中分離得到ACE 抑制肽段VVYPWTQRFO。

3.1 肽段的提取分離與鑒定

迄今為止，廣大學(xué)者已熟練地采用各種方法提取食物源肽，例如溶劑提取法、微生物發(fā)酵法、蛋白酶水解法等。而對發(fā)酵肉制品中多肽的提取多采用溶劑提取法。國外學(xué)者多數(shù)參照Moral 等[41]的方法對發(fā)酵肉制品中的肽段進行提取，Korhonen 等[55]提出磷酸鹽法提取。肽段粗提后需要通過紫外分光光度法測量其濃度；并進行脫鹽處理且一般采用萃取法。SEC 是一種廣泛用于肽段分離的色譜技術(shù)。在多肽分離中，固定相多為葡聚糖凝膠G25、流動相多為0.01N 的HCl。保留時間是分子尺寸的函數(shù)，可能提供一定的分子結(jié)構(gòu)相關(guān)信息。生物相容性好，餾分活性回收率高。但它不能分辨分子大小相近的化合物，一般說來，分子質(zhì)量的差別需在10%以上時才能分離，所以該法不能分離分子質(zhì)量相近的肽段。肽段提取物分離純化的方法還包括超濾法、離子交換層析、高效液相色譜法和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（SDS-PAGE）等。

對肽段AA 組成和序列鑒定常采用液相色譜或質(zhì)譜技術(shù)，并且大多將多種方法聯(lián)用以獲得更為準確的肽段結(jié)構(gòu)信息，進而分析其中強活性的成分以及其結(jié)構(gòu)中的有效特征。常用的有ESIMS、LC-MS、MALDI-TOF-MS 等[56]。光譜技術(shù)也廣泛應(yīng)用于肽段的結(jié)構(gòu)分析中。

3.2 肽段生物學(xué)信息分析

生物活性肽是近年來的研究熱點，廣大學(xué)者在不斷的研究和探索中發(fā)現(xiàn)了許多具有特定功能的生物活性肽并建立多種生物活性肽數(shù)據(jù)庫。一般將試驗所得的肽段序列結(jié)構(gòu)與數(shù)據(jù)庫中所有肽段序列結(jié)構(gòu)相比較，根據(jù)肽段分子質(zhì)量與數(shù)據(jù)庫中所包含肽段理論分子質(zhì)量相匹配的數(shù)量計算出試驗肽段的生物活性評分。最為常用的數(shù)據(jù)庫包括UniPot、BIOPEP、BLAST 等[58]。PeptideRanker 是一種既可以預(yù)測肽段的潛在生物活性，又可以計算活性片段在蛋白質(zhì)序列中出現(xiàn)的頻率（參數(shù)A）的數(shù)據(jù)庫，生物活性評分為0～1 即無活性-活性最強[57]。此外EROP-Moscow、PEPBANK、ERP-Moscow等也常用于生物活性肽的活性分析。

4 結(jié)語與展望

發(fā)酵肉制品中的生物活性肽主要來源于肌原纖維和肌漿蛋白的內(nèi)源酶水解作用。參與該水解的內(nèi)源酶為組織蛋白酶B、D、H、L、K 和鈣激活酶等，不同種內(nèi)源酶的水解位點和最佳作用條件有所差異，組織蛋白酶B 和L 的最佳pH 值約為6，而組織蛋白酶H 的最佳pH 值為6.8，組織蛋白酶D 的最佳pH 值范圍為3.0～5.0。然而，在發(fā)酵肉制品的實際生產(chǎn)過程中由于產(chǎn)品配方或加工條件的差異影響參與蛋白質(zhì)水解的相關(guān)酶的活力，因此在不同種類的發(fā)酵肉制品中水解所得的生物活性肽種類可能會有一定差異[58]。

生物活性肽作為一種生物活性物質(zhì)，需要保持其特定結(jié)構(gòu)的完整性才可發(fā)揮其生理功能。有研究證明生物活性肽在經(jīng)人體唾液、胃酸、有蛋白酶參與的胃腸道消化后會使生物活性肽發(fā)生降解，生理功能會下降甚至喪失[59]。已報道的對發(fā)酵肉制品中生物活性肽的研究主要是對發(fā)酵肉制品中的生物活性肽提取分離后再對其功能活性進行研究，然而直接食用發(fā)酵肉制品后，其中的生物活性肽是否會因復(fù)雜且特殊的生理環(huán)境而產(chǎn)生其它作用尚不清楚。發(fā)酵肉制品作為食物源性生物活性肽重要的來源之一可作為功能性食品的一個新方向，發(fā)酵肉制品中的生物活性肽依然有著很大的研究空間。未來對于發(fā)酵肉制品中生物活性肽的發(fā)展可以從以下三個方面考慮：1）建立發(fā)酵肉制品中生物活性肽數(shù)據(jù)庫；2）探索出既有經(jīng)濟效益又有生理作用的發(fā)酵肉制品生產(chǎn)加工工藝以實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化；3）研發(fā)新型發(fā)酵劑或蛋白水解酶參與發(fā)酵肉制品生產(chǎn)，提高生物活性肽的含量和種類。