庫車小白杏仁內(nèi)生細(xì)菌的篩選及其功能特性初探

劉曉靜，梁幸豪，朱 靜，楚 敏，顧美英，唐琦勇，張志東*

杏仁是薔薇科落葉喬木植物杏的種仁，是我國傳統(tǒng)的藥食兼用資源。其富含多種營養(yǎng)成分，其中油酸、亞油酸含量占脂肪酸總量的90%以上。杏仁具有多種益生功能，可抗炎癥、抗腫瘤、提高免疫力、調(diào)節(jié)血脂、預(yù)防心血管疾病。同時，還具有美容護(hù)膚、促進(jìn)毛發(fā)生長、改善發(fā)質(zhì)、減肥等作用[1-3]。此外，維吾爾族傳統(tǒng)的飲食習(xí)慣表明，當(dāng)食用過多杏果引起腹瀉時，適量食用杏仁能夠有效緩解腹瀉，然而其內(nèi)在的機(jī)制尚不清楚。

植物內(nèi)生菌廣泛存在于各種植物的根、莖、葉、果實、種子等組織中，因受宿主植物的保護(hù)，而具有相對穩(wěn)定的生存空間，并與宿主在長期進(jìn)化過程中形成互利共生的關(guān)系[4]。研究表明，植物的相對優(yōu)勢內(nèi)生細(xì)菌菌群主要包括：假單胞屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、腸桿菌屬（Enterobacterium）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）4個屬[5]。對花生[6-7]、銀杏[8]、核桃[9-10]等眾多果仁內(nèi)生細(xì)菌的研究表明，其中蘊(yùn)藏著大量寶貴的天然產(chǎn)物產(chǎn)生菌。部分菌株具有廣譜的抗菌活性，促進(jìn)果仁生長，提高宿主植物中SOD、CAT 等酶活力等功能。目前，有關(guān)杏仁內(nèi)生菌的研究鮮有報道。解析小白杏仁內(nèi)生細(xì)菌群落組成，篩選相關(guān)的功能菌株，為進(jìn)一步分析杏仁多種益生功能提供科學(xué)依據(jù)。

本研究采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法結(jié)合Biolog-ECO微平板法，對庫車小白杏仁內(nèi)生細(xì)菌群落碳源主要利用類型進(jìn)行分析，并對其內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離和鑒定，同時對相關(guān)菌株的產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果膠酶及抑菌特性進(jìn)行驗證，為進(jìn)一步探究庫車小白杏仁內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性，解析活性酶產(chǎn)生菌與杏仁生理機(jī)能和潛在功能間的關(guān)系提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

庫車小白杏于2018年6月采自庫車縣烏恰鎮(zhèn)（E82.8188°，N41.6781°）小白杏果園中。采用隨機(jī)采樣法，選擇果實自然成熟、無機(jī)械傷痕、無病變，且表皮有光澤，顏色、大小、硬度等表觀一致的小白杏，經(jīng)發(fā)泡網(wǎng)包裹裝筐后，12 h 內(nèi)運回實驗室，于4 ℃下貯藏，并在48 h 內(nèi)開展相關(guān)表面消毒、去核、取仁，以及內(nèi)生菌的分離篩選等工作。

供試菌種：黑曲霉、青霉、鏈格孢霉、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所菌種保藏室提供。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 分離培養(yǎng)基 TSA 培養(yǎng)基、高氏1 號培養(yǎng)基、R2A 培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、察式培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨液培養(yǎng)基等，均購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 功能酶測定培養(yǎng)基

1）蛋白酶篩選培養(yǎng)基 NA 培養(yǎng)基中加入脫脂牛奶20 g。

2）脂肪酶篩選培養(yǎng)基 NA 培養(yǎng)基中加入75 mL 三丁酸甘油酯乳化液（15 mL 三丁酸甘油酯加入60 mL 2%聚乙烯醇，加熱，超聲：160 Hz，10 min，間隔2 s）。

3）果膠酶篩選培養(yǎng)基 酵母粉5 g，CaCl2·2H2O 0.5 g，聚果膠酸鈉10 g，2% NaOH 9 mL，溴百里酚藍(lán)0.2%溶液12.5 mL，瓊脂8 g（121 ℃高壓滅菌不超過15 min）。

1.3 方法

1.3.1 預(yù)處理 杏仁經(jīng)自來水流水沖洗10 min，無菌紙吸干水分，75%酒精處理2 min，無菌水洗滌，3.3% NaClO 浸泡1 min，無菌水沖洗，75%酒精涮洗30 s 后，無菌水洗滌液經(jīng)涂板檢測無菌后，無菌條件下進(jìn)行破碎、勻漿操作[11]。

1.3.2 內(nèi)生細(xì)菌碳源代謝利用測定 在無菌條件下，分別取杏仁100 g，加入900 mL 滅菌的生理鹽水（0.85%），使用粉碎機(jī)粉碎混勻，然后將樣品稀釋至10-1，靜置30 min，移液器吸取上清液加入Biolog-Eco 微平板中，每微孔加150 μL。將微平板放置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)溫育。采用Biolog 分析鑒定系統(tǒng)進(jìn)行樣品測定，每24 h 讀板1 次，連續(xù)讀7 d。

Biolog-Eco 微平板孔中吸光值平均顏色變化率（Average well color development，AWCD）用于描述微生物代謝活性，取活性穩(wěn)定時的平均光密度值對微孔板中的31 種碳源的利用情況進(jìn)行分析[12]。

1.3.3 菌株的分離及純化 上述組織懸液按10-1，10-2，10-3梯度稀釋至10-5，各取0.1 mL 組織稀釋液將其分別涂布在試驗所需的各類培養(yǎng)基上，每個梯度設(shè)置3 個重復(fù)，于28 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)。每間隔24 h 觀察1 次培養(yǎng)皿的變化情況。

待培養(yǎng)基長出群落，于無菌條件下挑取不同形態(tài)的單菌落至新培養(yǎng)基上，再次進(jìn)行培養(yǎng)。不斷重復(fù)此操作，直至得到形態(tài)單一的菌落為止[13]。

1.3.4 菌株的分子鑒定 采用菌落PCR 法，利用細(xì)菌16S rRNA 基因通用引物27 F 和1492 R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[14]。條件為95 ℃5 min；95 ℃1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)切膠純化回收后，送往北京鼎國生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

所測得的序列經(jīng)人工校正后，上傳EzTaxon數(shù)據(jù)庫（http：//www.ezbiocloud.net/eztaxon/identify）進(jìn)行比對，并調(diào)取相關(guān)模式菌株序列，使用MEGA 5.0 進(jìn)行ClustalX 多重比對，并使用Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自舉值（Bootstrap）為1 000，初步確定菌株的生物學(xué)分類地位[15-16]。

1.3.5 菌株產(chǎn)酶特性的測定 將純化好的菌株接至待測培養(yǎng)基上進(jìn)行測定，設(shè)置3 個重復(fù)，于28℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每間隔24 h 觀察1 次培養(yǎng)皿的變化情況。果膠酶篩選可通過觀察菌落周圍的培養(yǎng)基是否下凹，若存在該現(xiàn)象則為陽性。蛋白酶、脂肪酶篩選可直接通過觀察菌落周圍是否存在透明圈；淀粉酶篩選需用0.1%的碘液染色，在5 min 之內(nèi)觀察菌落周圍是否有透明圈。以上培養(yǎng)基若存在透明圈則為陽性，根據(jù)透明圈直徑與菌落的直徑比值的大小來比較各菌株產(chǎn)酶能力的強(qiáng)弱[17]。

1.3.6 菌株拮抗作用的測定 真菌：采用常規(guī)對峙培養(yǎng)法，對所獲菌株的拮抗能力進(jìn)行測定。具體操作如下：用0.5 cm 打孔器分別將3 種真菌制成菌餅，挑取1 塊病原菌菌餅放置在PDA 平板中心（有菌體面向下），在距離病原菌菌餅2.5 cm 處的4 個垂直點分別接種待測菌株。

細(xì)菌：將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)48 h，用無菌水稀釋至濃度為107CFU/mL 的菌懸液，制備固體平板。采用點接法篩選，將待測菌株分別點接至上述固體平板上。

以上均設(shè)置3 個平行和1 個空白對照，于28℃下培養(yǎng)3～7 d，觀察病原菌與待測菌之間是否存在明顯抑制現(xiàn)象，并根據(jù)抑菌圈直徑與菌落的直徑比值的大小來比較各待測菌株拮抗能力的強(qiáng)弱[18-19]。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及圖表繪制方法 AWCD、碳源利用情況、功能酶及抑菌活性等分析工作采用DPS v9.50、Origin 8.0 Excel 2003 等軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細(xì)菌碳源利用類型分析

樣品經(jīng)7 d 連續(xù)培養(yǎng)和測定后，數(shù)據(jù)經(jīng)分析并求得平均吸光值后作圖。由圖1可以看出，在培養(yǎng)24～120 h 內(nèi)，AWCD 值隨培養(yǎng)時間的延長而明顯提高，庫車小白杏仁內(nèi)生細(xì)菌群落的代謝活性表現(xiàn)出快速增長的趨勢。其中，120 h 時AWCD 值為最高，可達(dá)1.13；在120～168 h 內(nèi)，AWCD 值逐漸趨于穩(wěn)定，其群落的代謝活性趨于緩慢。

圖1 杏仁內(nèi)生細(xì)菌群落AWCD 變化Fig.1 Changes in AWCD of endophytic bacteria in almond

試驗選擇菌群生長較為穩(wěn)定（120 h）時的碳源利用情況進(jìn)行分析。結(jié)果表明（見圖2），碳水化合物類和氨基酸類為庫車小白杏仁內(nèi)生細(xì)菌群落的主要利用碳源類型，分別占總體的42%和35%，共占總體的77%；其次為羧酸類，約占總體的12%；多聚物、酚酸類、胺類所占比例均為5%以下。進(jìn)一步對碳源利用情況的分析發(fā)現(xiàn)，杏仁內(nèi)生細(xì)菌群落主要利用4 種碳源。其中，3 種為碳水化合物類，分別為：D-半乳糖醛酸、D-甘露醇和N-乙酰-D-葡萄糖胺，分別約占總體的10.88%，11.90%，11.06%；L-天門冬酰胺為最主要的氨基酸類型，約占總體的14.27%。

圖2 杏仁內(nèi)生細(xì)群落碳源利用情況Fig.2 Carbon source utilization of endophytic bacterial community in almond

2.2 內(nèi)生細(xì)菌的分離

經(jīng)不同分離培養(yǎng)基培養(yǎng)3～15 d 后，根據(jù)菌落形態(tài)觀察，共挑取各類菌株55 株。通過共同接種至NA 培養(yǎng)基中，觀察菌落形態(tài)和顯微形態(tài)并去重后，獲得試驗菌株47 株。其中，采用貧營養(yǎng)培養(yǎng)基（R2A）共分離獲得菌株3 株，而常規(guī)分離培養(yǎng)基分離到菌株44 株，其占絕大多數(shù)。不同培養(yǎng)基來源菌株統(tǒng)計情況如表1所示。

表1 主要菌屬OTUs 所占比例Table 1 Ratio of OTUs in major genera

2.3 內(nèi)生細(xì)菌的分子鑒定

上述47 株菌的16S rRNA 基因序列經(jīng)PCR擴(kuò)增和測序后，所得序列運用EzTaxon 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了相似度比較，同時分別調(diào)取各菌株相似性最高模式菌株序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹。結(jié)果表明，庫車小白杏仁可培養(yǎng)細(xì)菌種類較為豐富，所得47株菌分別屬于4 個門的13 個屬。在門水平中（圖3），厚壁菌門（Firmicutes）和變形桿菌門（Proteobacteria）為小白杏仁可培養(yǎng)細(xì)菌的主要菌門，分別占總菌落的35%；其次為放線菌門（Actinobacteria），約占總菌落的25%；而擬桿菌門（Bacteroidetes）僅占總菌落的5%。

圖3 代表菌株的16S rRNA 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of isolates based on 16S rRNA gene sequence

在屬水平中，結(jié)果顯示，變形桿菌門所含種屬最為豐富，共涉及5 個屬，分別為：不動桿菌屬（Acinetobacter）、泛菌屬（Pantoea）、醋菌屬（Acetobacter）、葡糖桿菌屬（Gluconobacter）和Lonsdalea屬；其次為放線菌門，涉及4 個屬，分別為：節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、假節(jié)桿菌屬（Pseudarthrobacter）、考克氏菌屬（Kocuria）、迪茨氏菌屬（Dietzia）；厚壁菌門涉及3 個屬，分別為：葡萄球菌屬（Staphylococcus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、明串珠菌屬（Leuconostoc mesenteroides）；而擬桿菌門涉及種屬最少，僅包含類香味菌屬（Myroides）。

在完成測序的47 個菌株中，1 株代表菌（xr375）與已知模式菌株序列相似性為98.23%（圖3），初步確定其為潛在新種，為假節(jié)桿菌屬（Pseudarthrobacter）的1 個種，初步表明庫車小白杏仁中存在潛在的新物種資源，有待進(jìn)一步挖掘。上述菌株的最終分類地位，有待通過細(xì)菌多相系統(tǒng)分類鑒定結(jié)果進(jìn)一步證明。

2.4 內(nèi)生細(xì)菌產(chǎn)酶特性分析

通過平板透明圈法或顯色圈法對所得菌株的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、果膠酶產(chǎn)生能力進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，具有蛋白酶活性的代表菌株的數(shù)量占絕大多數(shù)，其次為產(chǎn)脂肪酶、淀粉酶類菌株，而具有果膠活性的菌株的數(shù)量最少。其中，7 株代表菌具有蛋白酶活性；5 株代表菌具有脂肪酶活性；3 株代表菌具有淀粉酶活性；2 株代表菌具有果膠酶活性。同時，研究發(fā)現(xiàn)，6 株代表菌同時具有2 種或2 種以上功能酶的產(chǎn)生能力。

2.5 內(nèi)生細(xì)菌抑菌能力分析

通過平板抑菌圈法對所獲菌株的拮抗能力進(jìn)行了測定。結(jié)果表明：5 株代表菌對真菌或細(xì)菌表現(xiàn)出了不同程度的抑制效果。其中，J4、J8 代表菌具有廣譜的抑菌效果，其對黑曲霉、青霉、鏈格孢霉、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均表現(xiàn)出了抑制效果；5 株代表菌對鏈格孢霉的生長表現(xiàn)出了抑制效果；對黑曲霉、青霉的生長表現(xiàn)出了抑制效果的代表菌各4 株；對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌表現(xiàn)出抑制效果的各為2 株。

3 結(jié)論

本文以庫車小白杏仁為研究對象，利用Biolog-ECO 微平板技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法，對其內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行了篩選，并對相關(guān)菌株的功能特性進(jìn)行了測定與分析。結(jié)果表明，碳水化合物類和氨基酸類為庫車小白杏仁內(nèi)生細(xì)菌群落的主要利用碳源類型，共約占總體的77%；其中，D-半乳糖醛酸、D-甘露醇和N-乙酰-D-葡萄糖胺為主要的碳水化合物類型；L-天門冬酰胺為主要的氨基酸類型。

表2 部分菌株功能酶活性情況Table 2 Some strains with functional enzyme activity

表3 部分內(nèi)生細(xì)菌的拮抗效果Table 3 Antagonistic effects of partial endophytic bacteria

試驗所獲得47 株菌，歸類為4 個門的13 個屬。其中，厚壁菌門和變形桿菌門為庫車小白杏仁可培養(yǎng)細(xì)菌的主要菌門，共占總體的70%左右。在屬水平中，不動桿菌屬、節(jié)桿菌屬、考克氏菌屬、葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬、明串珠菌屬、類香味菌屬的分離數(shù)量較多。同時，發(fā)現(xiàn)1 株假節(jié)桿菌屬的潛在新種。

功能特性的研究表明，試驗所獲代表菌中產(chǎn)蛋白酶類菌株居多，產(chǎn)脂肪酶、淀粉酶類菌株次之，產(chǎn)果膠酶類菌株最少。其中，6 株代表菌同時具有2 種或2 種以上功能酶的產(chǎn)生能力。抑菌試驗的結(jié)果表明，5 株代表菌對真菌或細(xì)菌表現(xiàn)出了不同程度的抑制效果。其中，J4、J8 代表菌具有廣譜的抑菌效果，其對黑曲霉、青霉、鏈格孢霉、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均表現(xiàn)出了抑制效果。

以上結(jié)果表明，庫車小白杏仁內(nèi)生細(xì)菌群落組成多樣，且存在大量具有豐富功能的微生物資源，有待深入研究。

4 討論

現(xiàn)代中醫(yī)名家章次公氏在其所著的 《章次公醫(yī)術(shù)經(jīng)驗集》中反復(fù)提及，杏仁可用于胃、十二指腸潰瘍及其出血、慢性胃炎、胃神經(jīng)痛、胃痙攣痛等的治療[20]。孫錫高[21]利用杏仁與其它藥物的復(fù)合，并通過對數(shù)胃疾病人進(jìn)行治療與觀察，進(jìn)一步證明了杏仁可有效緩解胃部等不適。朱宇偉等[22]也發(fā)現(xiàn)杏仁對胃食管反流病、慢性胃炎、胃潰瘍、功能性胃腸病、膽囊息肉等消化系統(tǒng)疾病的治療具有良好的效果。相關(guān)研究已證實，杏仁中存在大量的生物保護(hù)菌，如腸膜明串珠菌可利用蔗糖合成大量莢膜葡聚糖，并產(chǎn)生大量的B 族維生素[23]；部分醋酸菌和酵母菌共同作用產(chǎn)生大量酸，可激活相關(guān)乳酸菌的活性，調(diào)整腸道菌落，不僅可以保護(hù)腸道黏膜，有助于營養(yǎng)物的消化和吸收，還可排除腸道內(nèi)的有害菌[24]。在本研究中，試驗發(fā)現(xiàn)庫車小白杏仁中存在豐富的內(nèi)生細(xì)菌組成，如醋菌屬、葡糖桿菌屬、迪茨氏菌屬、芽孢桿菌屬、明串珠菌屬等。同時，相關(guān)研究表明，木糖葡萄球菌屬的部分菌株還可氧化、降解組胺，從而緩解其高濃度時引起的過敏、發(fā)炎、胃腸絞痛等不良癥狀[25]；迪茨氏菌屬菌株可與部分藥物結(jié)合治療或治愈炎癥性腸病、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎[26]。由此可見，杏仁的多種功能與功效可能與其內(nèi)生細(xì)菌有關(guān)，但相關(guān)論點仍需進(jìn)一步驗證。

中國自古以來就有“杏傷人”的說法，即過多食用杏子對身體不利，在日常生活中過量食用后常引起腹瀉。本研究前期通過對庫車小白杏果肉內(nèi)生細(xì)菌的分析發(fā)現(xiàn)，其中存在著多種與腸胃代謝相關(guān)菌群。如擬桿菌、普雷沃氏菌屬等，雖廣泛存在健康人群的口腔或腸道中，但當(dāng)機(jī)體免疫功能紊亂或菌群失調(diào)時，可導(dǎo)致機(jī)體的內(nèi)源性感染；氣單胞菌和密螺旋體屬易引起人體腹瀉等多種感染。通過對新疆本地飲食習(xí)慣的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，適量食用杏仁能夠有效緩解因過量食用杏果而引起的腹瀉。相關(guān)研究也表明，杏仁主要成分對大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等病原菌產(chǎn)生顯著的抑制作用[27-28]。本研究通過對庫車小白杏內(nèi)生細(xì)菌抑制能力的測定發(fā)現(xiàn)，其中的部分代表菌對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌具有良好的抑制效果，其可能也參與了杏仁在緩解腹瀉和抑菌方面的作用。

另外，蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和果膠酶不僅在食品生產(chǎn)中有著重要的作用，也可能參與了種子的萌發(fā)?，F(xiàn)有研究表明，蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶在種子中大量存在。其中，蛋白酶可為種子的生長發(fā)育提供氮源，其活性隨萌發(fā)的進(jìn)行而增加，萌動時酶活性最大，隨后活性逐漸下降[29-30]；脂肪酶活性可促進(jìn)種子中油脂的合成，也可催化脂肪分解成供給種子萌發(fā)的碳水化合物，使得種子的萌發(fā)速度與脂肪酶的活性成正比[31]；淀粉水解是種子萌發(fā)所需主要物質(zhì)和能量的來源，因而其活性在種子萌發(fā)初期較高，末期逐漸降低[32]。在本研究中，也發(fā)現(xiàn)了庫車小白杏仁中存在一定數(shù)量的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶產(chǎn)生菌，其存在是否在杏仁種子萌發(fā)中發(fā)揮了相應(yīng)作用，有待進(jìn)一步研究。