牛肝菌多酚細(xì)胞抗氧化活性評(píng)價(jià)模型研究

王晶波，楊 倬，秦 文，王麗媛，陳 曦，卓 勤，宮照龍，沈 葹

尋找和開(kāi)發(fā)安全性高、天然、無(wú)毒的抗氧化物質(zhì)是近幾十年來(lái)功能性食品研究的熱點(diǎn)[1]。選擇恰當(dāng)準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)方法來(lái)評(píng)價(jià)其抗氧化活性至關(guān)重要?？寡趸钚栽u(píng)價(jià)方法主要包括體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)、體外化學(xué)評(píng)價(jià)方法和細(xì)胞抗氧化評(píng)價(jià)方法。體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)[2-3]是評(píng)價(jià)抗氧化活性較好的方法，然而，其成本高、周期長(zhǎng)，不適于大批量樣品的初篩操作；體外化學(xué)評(píng)價(jià)方法包括1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2'-聯(lián)氮雙-（3-乙基苯并噻唑林-6-磺酸）二胺鹽（ABTS）和氧化自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）等[4-8]，具有成本低、檢測(cè)快、結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，然而，化學(xué)評(píng)價(jià)方法僅關(guān)注食物的抗氧化值，未考慮抗氧化成分在細(xì)胞內(nèi)的生物利用率、吸收和代謝等情況，因此不能反映細(xì)胞生理?xiàng)l件和作用機(jī)制。

細(xì)胞抗氧化評(píng)價(jià)方法能夠反映抗氧化物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的吸收、代謝和分布等情況，相比于體內(nèi)試驗(yàn)和體外化學(xué)評(píng)價(jià)方法，具有準(zhǔn)確、用時(shí)少、成本低的特點(diǎn)[9]，是目前評(píng)價(jià)抗氧化物質(zhì)的一種相對(duì)科學(xué)、合理的方法。Wolfe 等[10]建立的細(xì)胞抗氧化活性（cellular antioxidant activity，CAA）評(píng)價(jià)方法是以人體肝癌細(xì)胞HepG2 為試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，觀察抗氧化物質(zhì)在細(xì)胞中的反應(yīng)情況，繼其之后，許多研究小組建立了其它細(xì)胞模型（如Caco-2、AGS、RBC）[11-13]的抗氧化活性評(píng)價(jià)方法，豐富和創(chuàng)新了細(xì)胞抗氧化評(píng)價(jià)方法。同時(shí)，也有研究者發(fā)現(xiàn)不同的細(xì)胞模型適用于不同的抗氧化物質(zhì)的活性檢測(cè)[14]，因此，對(duì)細(xì)胞抗氧化評(píng)價(jià)方法的細(xì)胞模型的篩選是必不可少的。

牛肝菌是一種食藥兼用的大型真菌，富含多酚、多糖、萜類[15-16]等抗氧化活性物質(zhì)。目前評(píng)價(jià)牛肝菌多酚抗氧化活性的研究多集中在體外化學(xué)評(píng)價(jià)法。本文采用氧化自由基吸收能力和細(xì)胞抗氧化評(píng)價(jià)方法綜合評(píng)價(jià)牛肝菌多酚的抗氧化活性，比較Caco-2、L02 和HepG2 3 種細(xì)胞模型檢測(cè)多酚濃度范圍、靈敏度方面的差異，確定能準(zhǔn)確評(píng)價(jià)牛肝菌多酚抗氧化活性的細(xì)胞評(píng)價(jià)模型，為抗氧化物質(zhì)的活性評(píng)價(jià)方法提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要樣品、試劑與儀器

野生牛肝菌干貨樣品（市售）分別購(gòu)自云南不同產(chǎn)地，將樣品粉碎，過(guò)120 目篩后置陰涼干燥處備用。3 種牛肝菌名稱（產(chǎn)地）分別為紅牛肝菌（普洱）、黃牛肝菌（大姚）、黑牛肝菌（師宗），設(shè)為樣品1～3 號(hào)。

Caco-2 和L02（編號(hào)為FH0029 和FH0099），上海富衡生物科技有限公司；HepG2（編號(hào)SCSP-510），上海生科院；MEM 和胎牛血清，HyClone 公司；1640 培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶-EDTA，Gibco 公司；Cell Counting Kit-8 試劑盒（CCK-8 試劑盒），北京索萊寶科技有限公司。

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（89.9%），中國(guó)食品藥品檢定院；槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品（95%）、左旋抗壞血酸（SLBL9227V）、Folin-Ciocalteu 試劑、2’，7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）、2，2’-偶氮二異丁基咪二鹽酸鹽（AAPH）、碳酸鈉、熒光素鈉（FL），Sigma Aldrich 公司。

酶標(biāo)儀SpectraMax i3x，基因有限公司；KQ-600DB 型數(shù)控超聲波清洗器（功率600 W，頻率40 000 Hz），昆山市超聲儀器有限公司；CO2培養(yǎng)箱，Panasonic 公司。

1.2 牛肝菌多酚提取及含量測(cè)定

采用超聲波提取法最佳工藝提取3 種牛肝菌多酚[15]。每種樣品稱取1 g 粉末，按照液料比為44∶1，加入85%的乙醇溶液，超聲38 min 后4 500 r/min 離心15 min，吸取上清液并用85%乙醇溶液定容至50 mL，即為牛肝菌多酚提取液，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩２捎肍olin-Ciocalteu 比色法測(cè)定多酚含量，在96 孔板上分別加入30 μL 的多酚提取液樣品、150 μL Folin-Ciocalteu 試劑（0.2 N）和120 μL 碳酸鈉溶液（75 g/L），室溫暗處反應(yīng)2 h 后，在酶標(biāo)儀于760 nm 下測(cè)定吸光度，以沒(méi)食子酸（8.75，17.5，35，70，140 和280 μg/mL）為對(duì)照品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲取多酚含量以每克食用菌中沒(méi)食子酸當(dāng)量計(jì)。

1.3 氧化自由基吸收能力試驗(yàn)ORAC

本試驗(yàn)參考Huang 等[17]方法并加以改進(jìn)。具體操作步驟為：首先向96 孔板中加入不同濃度樣品、抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品以及PBS（空白孔和陽(yáng)性對(duì)照孔）25 μL，平行操作3 次，再向各孔加入150 μL FL 工作液，振蕩5 s，37 ℃溫育10 min。然后向各孔中迅速加入25 μL AAPH（除空白孔），以激發(fā)波長(zhǎng)（485±20）nm、發(fā)射波長(zhǎng)（530±20）nm 連續(xù)測(cè)定熒光強(qiáng)度，整個(gè)體系保持37 ℃，每1 min 測(cè)定1次熒光強(qiáng)度，每次測(cè)定前中速振動(dòng)孔板10 s，振蕩幅度4 mm，測(cè)定時(shí)間設(shè)定在熒光衰減呈基線后為止（本試驗(yàn)設(shè)置60 個(gè)循環(huán)），測(cè)定結(jié)果以O(shè)RAC 值表示。待測(cè)樣品的ORAC 值以μmol/L 表示，即抗壞血酸當(dāng)量。計(jì)算公式為：

式中：AUC樣品——樣品作用下的各微孔熒光衰退曲線下面積；AUC抗壞血酸——抗壞血酸作用下的熒光衰退曲線下面積；AUC對(duì)照——僅有AAPH作用下的熒光衰退曲線下面積；C抗壞血酸——標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，μmol/L。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

Caco-2 和HepG2 細(xì)胞采用MEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)（胎牛血清量分別為15%和10%），L02 細(xì)胞采用含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2飽和濕度，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶底面積80%左右時(shí)傳代，培養(yǎng)期間隔天換液，試驗(yàn)用細(xì)胞代數(shù)小于35 代。

1.5 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

方法參照CCK-8 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明。細(xì)胞于96 孔板上按照6×104個(gè)/孔接種，每孔加入100 μL 細(xì)胞液，37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)24 h，需留有無(wú)細(xì)胞孔做為空白孔。棄去培養(yǎng)液，用不含血清的培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞2 次后加入100 μL 不含血清的培養(yǎng)液，再加入10 μL 不同濃度的牛肝菌多酚提取液，孵育24 h 后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm 處的吸光度。

式中：A樣品——有細(xì)胞、CCK-8 溶液和樣品溶液的孔的吸光度值；A空白——沒(méi)有細(xì)胞、有CCK-8 溶液的孔的吸光度值；A對(duì)照——有細(xì)胞、CCK-8 溶液而沒(méi)有樣品溶液的孔的吸光度值。

細(xì)胞活力在90%以上為樣品溶液無(wú)細(xì)胞毒性，樣品濃度安全。

1.6 細(xì)胞抗氧化活性試驗(yàn)

細(xì)胞抗氧化活性試驗(yàn)過(guò)程和CAA 值計(jì)算方法參考文獻(xiàn)[10、18]，并略有調(diào)整。細(xì)胞培養(yǎng)至足夠數(shù)量，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種到96 孔板，每孔100 μL，每孔細(xì)胞數(shù)約為6×104個(gè)，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h 后，移去培養(yǎng)液，用PBS 清洗1 次后每孔加入100 μL 樣品處理液（含DCFHDA，終濃度為 25 μmol/L）以及標(biāo)準(zhǔn)品槲皮素（終質(zhì)量濃度為0，0.5，2.5，5，10，12，15，20，30，50 mg/L），平行3 孔，96 孔板周?chē)讞売谩?7 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)1 h 后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL 的600 μmol/L AAPH，用熒光酶標(biāo)儀（激發(fā)波長(zhǎng)538 nm、發(fā)射波長(zhǎng)485 nm，恒溫37 ℃）每5 min測(cè)定1 次熒光值，持續(xù)測(cè)定1 h。兩步操作中，空白組用培養(yǎng)液處理，對(duì)照組用DCFH-DA 和AAPH處理，操作中使用的試劑均用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液配制。

CAA 值計(jì)算：空白孔調(diào)零后，譜出熒光值隨時(shí)間的變化曲線，由曲線下面積計(jì)算抗氧化物質(zhì)的CAA 值。

式中：∫SA——樣品時(shí)間-熒光值曲線下的積分面積；∫CA——對(duì)照時(shí)間-熒光值曲線下的積分面積。

樣品的半數(shù)有效濃度（EC50）根據(jù)lg（fa/fu）對(duì)lg（樣品濃度）的中效原理來(lái)計(jì)算，fa 表示樣品作用效應(yīng)（CAA unit），fu 表示100-CAA unit，EC50值以3 次平行試驗(yàn)計(jì)算得出。以每個(gè)96 孔板中測(cè)量的槲皮素作為標(biāo)準(zhǔn)，將牛肝菌多酚的CAA 計(jì)算為每100 g 牛肝菌的槲皮素（QE）微摩爾當(dāng)量。使用Excel 處理數(shù)據(jù)，SPSS 軟件分析EC50值，Origin 軟件作圖。

1.7 細(xì)胞抗氧化活性試驗(yàn)細(xì)胞種類的確定

采用1.6 節(jié)的方法，基于Caco-2、L02 和HepG2 3 種細(xì)胞來(lái)測(cè)定黃牛肝菌多酚的細(xì)胞抗氧化活性，比較三者在檢測(cè)多酚濃度范圍、靈敏度方面的差異，確定適宜牛肝菌多酚細(xì)胞抗氧化活性測(cè)定的細(xì)胞種類。采用適宜細(xì)胞測(cè)定紅牛肝菌、黃牛肝菌和黑牛肝菌3 種牛肝菌多酚的細(xì)胞抗氧化活性，并與牛肝菌的多酚提取率、ORAC 進(jìn)行相關(guān)性分析，驗(yàn)證方法的有效性和準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與討論

2.1 多酚含量和ORAC 測(cè)定結(jié)果

采用超聲波提取法提取3 種牛肝菌多酚，并測(cè)定多酚提取率，結(jié)果見(jiàn)表1，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0071x+0.0569，R2=0.9972。3 種牛肝菌之間多酚提取率差異不大，從高到低依次為黃牛肝菌、紅牛肝菌和黑牛肝菌。牛肝菌氧化自由基吸收能力試驗(yàn)檢測(cè)，以時(shí)間（min）為橫坐標(biāo)，熒光單位為縱坐標(biāo)，繪制抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和不同種類牛肝菌多酚的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間衰減曲線，如圖1所示。物質(zhì)的抗氧化活性高者，熒光強(qiáng)度隨時(shí)間衰減速度緩慢，從圖1b 中可以看出黃牛肝菌多酚抗氧化活性最高，紅牛肝菌和黑牛肝菌多酚次之，這與牛肝菌多酚提取率高低順序一致。

圖1 抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品和不同種類牛肝菌多酚熒光強(qiáng)度隨時(shí)間衰減曲線Fig.1 The decay curve of fluorescence intensity of ascorbic acid standard and boletus polyphenols with time

表1 3 種牛肝菌多酚提取率和ORAC 值測(cè)定結(jié)果Table 1 Results of the extraction rates of polyphenol and ORAC value of three varieties of boletus

2.2 細(xì)胞抗氧化活性試驗(yàn)的細(xì)胞篩選結(jié)果

細(xì)胞毒性試驗(yàn)證明牛肝菌多酚無(wú)細(xì)胞毒性。采用Caco-2、L02 和HepG2 3 種不同細(xì)胞模型來(lái)測(cè)定黃牛肝菌多酚的細(xì)胞抗氧化活性，計(jì)算得出QE 當(dāng)量值分別為23.681，9.367，8.118 μmol QE·（100g）-1。如圖2所示，3 種細(xì)胞都可以作為多酚細(xì)胞抗氧化活性測(cè)定模型的細(xì)胞基礎(chǔ)，抗氧化活性均隨著多酚濃度增大而升高，但不同細(xì)胞模型的抗氧化活性的檢出限不同，Caco-2、L02 和HepG2 分別為0.025，0.1，0.2 g 黃牛肝菌提取的多酚，Caco-2 曲線的R2值（R2=0.9653）更接近1，Caco-2 細(xì)胞模型明顯優(yōu)于L02 和HepG2 模型，采用Caco-2 來(lái)測(cè)定牛肝菌多酚的細(xì)胞抗氧化活性，結(jié)果更靈敏與準(zhǔn)確。

圖2 基于3 種細(xì)胞模型的黃牛肝菌多酚的細(xì)胞抗氧化活性比較Fig.2 Comparison of cellular antioxidant activity of polyphenols from Boletus auripes based on 3 cell models

2.3 基于Caco-2 細(xì)胞的牛肝菌多酚細(xì)胞抗氧化能力試驗(yàn)結(jié)果

采用Caco-2 細(xì)胞模型測(cè)定3 種牛肝菌多酚的抗氧化能力，選取0.025，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 g 牛肝菌提取的多酚，由圖3可知，牛肝菌多酚能有效抑制Caco-2 細(xì)胞中DCFH 向DCF 轉(zhuǎn)化，隨著多酚濃度的升高，細(xì)胞內(nèi)熒光物質(zhì)的生成減少，當(dāng)多酚為0.5 g 牛肝菌提取時(shí)，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度最低，即此時(shí)樣品的細(xì)胞抗氧化能力最強(qiáng)。計(jì)算得出3 種牛肝菌多酚QE 當(dāng)量的高低順序與多酚含量和ORAC 值順序一致，均為黃牛肝菌、紅牛肝菌和黑牛肝菌，相關(guān)系數(shù)分別為0.9662 和0.9156，呈顯著正相關(guān)，即多酚含量高的牛肝菌，其體外抗氧化能力和細(xì)胞抗氧化能力均較高（表2、表3）。

圖3 牛肝菌多酚（b，c，d）和標(biāo)準(zhǔn)品槲皮素（a）抑制Caco-2 細(xì)胞中DCFH 向DCF 轉(zhuǎn)化的動(dòng)力學(xué)曲線（±s，n=3）Fig.3 The kinetic curve of the inhibition of the conversion of DCFH to DCF in Caco-2 cells by boletus polyphenols（b，c，d）and standard quercetin（a）（±s，n=3）

表2 牛肝菌多酚提取率、ORAC 值和CAA 值的檢測(cè)結(jié)果Table 2 Results of the extraction rates of polyphenol and ORAC value and CAA value of boletus

表3 牛肝菌多酚提取率與細(xì)胞抗氧化活性相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of polyphenol extraction rate and cellular antioxidant capacity from boletus

3 結(jié)論

抗氧化活性評(píng)價(jià)方法多種多樣，采用細(xì)胞抗氧化評(píng)價(jià)方法具有準(zhǔn)確、用時(shí)少、成本低的特點(diǎn)，同時(shí)也能滿足樣品高通量測(cè)定要求，研究者需根據(jù)研究樣品來(lái)確定不同的細(xì)胞抗氧化研究模型，Caco-2、L02 和HepG2 3 種細(xì)胞相比較，Caco-2細(xì)胞模型更適用于牛肝菌多酚細(xì)胞抗氧化活性檢測(cè)，并且可以與ORAC 等體外化學(xué)評(píng)價(jià)方法聯(lián)合評(píng)價(jià)牛肝菌多酚的抗氧化活性。

牛肝菌多酚抗氧化活性強(qiáng)，黃牛肝菌ORAC值高達(dá)223.68 μmol AEAC/g，CAA 值達(dá)到23.68 μmol QE/100 g，不同種類牛肝菌多酚抗氧化活性高低不同，這為食品加工原料時(shí)選擇適宜品種提供參考，也為牛肝菌作為營(yíng)養(yǎng)性、功能性的菌類食品的研發(fā)提供了理論依據(jù)。