水果制品中丙烯酰胺含量的分布

王鵬璞，盧 佩，孫國玉，陳 芳

丙烯酰胺（Acrylamide，AA）是熱加工食品中的一種伴生危害物，對人具有神經(jīng)毒性、基因毒性和潛在致癌性[1-4]，被國際癌癥研究機構(gòu)歸為2A 類致癌物[5]。食品中的AA 主要通過還原糖和天冬酰胺在高溫下發(fā)生美拉德反應形成[6-7]。馬鈴薯制品、咖啡及其替代品、谷物類早餐等富含碳水化合物的熱加工食品中含量較高。根據(jù)歐洲食品管理局2015年的報道[8]，薯片類小吃中AA 暴露量達580 μg/kg，咖啡及咖啡替代品中高達703～1 499 μg/kg。

早期研究表明水果制品中AA 含量極低或未檢出。部分干制水果如杏脯（180 μg/kg）、棗干（70 μg/kg）、香蕉干（50 μg/kg）、香蕉脆片（770 μg/kg）等[9-10]中含有一定量的AA。中國部分市售果汁（蘋果汁、葡萄汁、橙汁等）中AA 平均含量僅約為20 μg/kg[11]。2015年，美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）發(fā)布的食品中AA 含量報告數(shù)據(jù)顯示：西梅汁和罐裝黑橄欖中AA 含量分別高達200 μg/kg 和500 μg/kg[12]。針對加拿大市面上出售的42 種西梅制品AA 暴露量的研究表明，不同西梅產(chǎn)品中AA 含量差異顯著，西梅汁中AA 含量為186～916 μg/kg，西梅干中為58～332 μg/kg，嬰幼兒西梅干中為75～265 μg/kg，嬰幼兒蘋果-西梅混合果汁卻僅有33～61 μg/kg[13]。市售黑橄欖中AA 含量范圍由未檢出到高達2 326 μg/kg[10]，當滅菌溫度在110～125 ℃時，產(chǎn)品中AA 含量隨加熱時間的增加而顯著增加[14-15]。目前尚缺乏常見水果制品中AA 含量數(shù)據(jù)。我國是世界最大的水果生產(chǎn)國和水果制品加工基地，因此有必要針對不同加工方式的水果制品中AA含量進行調(diào)查。本文針對5 類市售水果制品中AA含量進行檢測，為水果制品中AA 風險評估和控制技術開發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗原料 在美廉美超市及京東商城采購不同品牌市售水果制品58 種，根據(jù)加工方式的不同分為五類：果汁（23 種）、果脯（12 種）、果醬（9種）、罐頭（4 種）和水果脆片（10 種），涉及18 個產(chǎn)地、23 個生產(chǎn)廠家，所選樣品具有代表性。

1.1.2 主要試劑 AA 標準品（純度>99.8%），美國Sigma 公司；13C3-AA 標準溶液（純度>99%），美國Cambridge Isotope Laboratories 公司；色譜級乙腈、甲醇和甲酸，美國賽默飛世爾科技有限公司；分析純氯化鈉、正己烷和無水硫酸鎂，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Waters ACQUITY I-CLASS 超高效液相色譜儀，美國Waters 公司；Xevo TQ-S 三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（電噴霧ESI 電離源），美國Waters 公司；KQ-2200 超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；PURELAB Classic 超純水機，北京龍躍偉逸科貿(mào)有限公司；CF16RXII 高速離心機，日本Hitachi 公司；JP-300B 高速多功能食品粉碎機，永康市久品工貿(mào)有限公司；EFAA-DC24-RT 防腐型24位氮吹儀，上海安譜實驗科技股份有限公司；Vortex-5 漩渦振蕩器，江蘇其林貝爾有限公司；Cleanert-PEP SPE 柱（60 mg/3 mL）和聚醚砜微孔濾膜（0.22 μm，13 mm），天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 AA 的提取及純化

1.3.1.1 固體樣品 根據(jù)袁媛[16]和楊斯超[17]的方法并稍加修改。樣品凍干后粉碎，稱取1 g（精確至0.01 g）于50 mL 離心管中，加入10 mL 正己烷脫脂，振蕩1 min，4 ℃、10 000 r/min 離心15 min，棄上清。重復上述脫脂過程兩次。向沉淀中依次加入20 μL13C3-AA 溶液（120 mg/L）、10 mL 超純水、10 mL 乙腈、4 g MgSO4及1 g NaCl，振蕩混勻并超聲15 min，4 ℃、10 000 r/min 離心15 min，取上清，氮氣吹干后用1 mL 超純水復溶。依次用3 mL 甲醇及3 mL 超純水對SPE 柱進行活化，將復溶后所得溶液過SPE 柱，收集流出物。再加1 mL 超純水淋洗SPE 柱，合并2 mL 流出液，振蕩混勻，過0.22 μm 聚醚砜水系濾膜后注入棕色樣品瓶中，待UPLC-MS/MS 檢測。

1.3.1.2 液體樣品

1）果汁 根據(jù)Wang 等[3]研究中液體樣品處理方法并稍加修改。用超純水將果汁樣品稀釋5倍，取2 mL 加入20 μL13C3-AA 溶液（120 mg/L），振蕩混勻后，4 ℃、10 000 r/min 離心15 min。取1 mL 上清溶液過SPE 柱（預先活化）純化，后續(xù)操作同1.3.1.1 節(jié)。

2）其它液體樣品：樣品不經(jīng)過稀釋，其它處理內(nèi)容同果汁樣品。

1.3.2 AA 的UPLC-MS/MS 檢測

1.3.2.1 色譜條件 根據(jù)Wang 等[3]的方法并稍加修改。選用Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），柱溫40 ℃，進樣量5 μL，流動相及液相分離條件如表1所示。

表1 UPLC 主要參數(shù)Table 1 Main parameters for UPLC

1.3.2.2 質(zhì)譜條件 陽離子電噴霧電離源（ESI+）；掃描模式：MRM；脫溶劑氣溫度：500 ℃；脫溶劑氣流量：900 L/h；錐孔反氣流量：150 L/h；離子源溫度：150 ℃；源偏置電壓：60 V；霧化器壓力：7.0 Bar；毛細管電壓：2.9 kV；錐孔電壓：25 V；碰撞能量：11 eV；駐留時間：0.03 s；定量離子對：AA m/z 72.0→55.0，13C3-AA m/z 75.0→58.0。

1.3.2.3 檢測方法評價 配制1 g/L 的AA 標準品溶液，通過梯度稀釋方法配制質(zhì)量濃度范圍為5～1 000 μg/L 的AA 標準溶液。分別于各濃度溶液中加入20 μL13C3-AA 內(nèi)標溶液（120 mg/L），混勻，過0.22 μm 聚醚砜水系濾膜，進行UPLC-MS/MS檢測。以標準溶液濃度為橫坐標，AA 與13C3-AA的峰面積比值為縱坐標，繪制標準曲線并進行線性回歸分析計算。分別以被分析物的色譜峰信噪比為3 和10 時的濃度為方法的檢出限（Limit of Detection，LOD）和定量限（Limit of Quantification，LOQ），取6 次平行試驗的平均值。精密度由相對標準偏差（Relative standard deviation，RSD）表示，日內(nèi)精密度和日間精密度分別由高（500 μg/L，n=5）、中（50 μg/L，n=5）、低（5 μg/L，n=5）3 個質(zhì)量濃度的標準溶液在1 d 內(nèi)重復測定6 次（日內(nèi)精密度）和連續(xù)測定6 d（日間精密度）得到。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用軟件IBM SPSS 20.0 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法評價

對所用UPLC-MS/MS 方法進行評價，結(jié)果表明在給定的質(zhì)量濃度范圍（5～1 000 μg/L）內(nèi)，標準曲線線性關系良好（R2=0.9983），所得回歸方程為y=3.2638x+0.0042；日內(nèi)精密度為RSD（5μg/L）=3.39%、RSD（50μg/L）=1.35%、RSD（500μg/L）=1.73%，日間精密度為RSD（5μg/L）=10.56%、RSD（50μg/L）=1.95%、RSD（500μg/L）=1.59%，均低于15%，精密度高；LOD 為0.692 μg/L，LOQ 為2.384 μg/L，靈敏度好，滿足痕量物質(zhì)的測定。

2.2 果汁中AA 含量分布

選取的23 種市售果汁飲料（國產(chǎn)：葡萄汁、橙汁2 種、桃汁、蘋果汁、石榴復合果汁、橙/胡蘿卜/蘋果/菠蘿/獼猴桃/櫻桃李復合果汁、芒果/菠蘿/番石榴/蘋果/番茄/橙/西柚復合果汁、蘋果香蕉汁、紅心番石榴汁、西柚汁；進口：菠蘿汁、姜味甘蔗汁、荔枝汁、葡萄汁、蘋果芒果復合汁、蘋果汁2 種、復合果汁、櫻桃汁、西梅汁、橙汁、胡蘿卜汁）中僅美國產(chǎn)西梅汁有AA 檢出，質(zhì)量濃度為（377.00±22.17）μg/kg，與文獻報道水平相當[13]，這與其特殊制作工藝有關。西梅汁是先將新鮮西梅在85～90℃條件下熱風干燥處理18 h 以上制得西梅干，再將西梅干置于沸水中煮至可溶性固形物含量約為18%[18]，烘干和煮沸過程中加熱時間較長，導致其中含有較高濃度的AA。Becalski 等[13]也發(fā)現(xiàn)將西梅汁于95 ℃條件下加熱24 h，其中AA 含量顯著升高。除西梅汁外其它果汁均未檢出AA，這與前期研究（果汁中AA 平均含量為20 μg/kg）[11]不一致。一方面，果汁的低pH 值（pH 3～4）[19]抑制美拉德反應使AA 本身的形成降低；另一方面，不同產(chǎn)地和品牌果汁的生產(chǎn)工藝不同。比如產(chǎn)地北京的葡萄汁、橙汁、桃汁、蘋果汁、石榴復合果汁及保加利亞的櫻桃汁在生產(chǎn)過程中采用超高溫瞬時殺菌（Ultra-high temperature instantaneous sterilization，UHT）和無菌冷灌裝工藝，與傳統(tǒng)的熱灌裝相比使殺菌和罐裝的加熱時間大大縮短。在以上工藝使用的基礎上，產(chǎn)地杭州的兩類6 種水果復合果汁還保證混合果蔬汁濃度在30%；而同產(chǎn)地的橙汁、蘋果香蕉汁，湖州的紅心番石榴汁、西柚汁，西班牙的橙汁和蘋果汁對鮮果進行冷壓榨出汁，不經(jīng)濃縮及復原過程，這在縮短加熱時間的同時保留了豐富的膳食纖維和多種維生素，而這些都可以使加工過程中AA 的形成顯著降低[20-21]。

2.3 果脯中AA 含量分布

表2所示為果脯制品中AA 含量。如表所示，所選10 種果脯制品中8 種AA 含量為（19.24±0.61）～（147.22±5.12）μg/kg，果丹皮和太平脯中AA 未檢出。與果汁樣品相比，果脯樣品中AA 檢出率80%，這是由于二者加工工藝不同所致。果脯是以新鮮水果為原料，經(jīng)預處理后用糖液煮制、脫水干制得到的水果制品[22]。首先，為了保持品質(zhì)，避免“返砂”現(xiàn)象出現(xiàn)，要求煮制果品的糖液含糖量70%左右，其中還原糖占總糖60%；同時還需要在特定pH 值下長時間煮制使蔗糖完全轉(zhuǎn)化。最后，脫水干制還需進一步經(jīng)熱風干燥或晾曬處理[23-24]。因此，還原糖含量高、高溫長時間處理是導致果脯中AA 普遍形成的主要原因。8 種被檢出產(chǎn)品中美國西梅的AA 含量最高，但顯著低于西梅汁，與文獻[13]報道一致。這是因為西梅汁是在西梅干基礎上進一步進行長時間煮制而得到的。

表2 不同果脯類制品中AA 含量Table 2 AA contents in different commercial preserved fruits

2.4 果醬中AA 含量分布

如表3所示，所選9 種果醬制品AA 檢出率100%，質(zhì)量濃度范圍（25.65±3.83）～（64.93±5.46）μg/kg，整體較果脯中高。果醬是將新鮮水果經(jīng)預處理后加糖煮至可溶性固形物含量達到指定要求的凝膠制品。首先，與果脯相比，果醬無需保持果塊形狀，其濃縮煮制時間更長。其次，果醬利用果膠在脫水劑（糖）作用下形成凝膠的原理制得，要求果膠含量在1%左右，而果膠酸水解形成的半乳糖醛酸可顯著促進AA 的形成[25]。另外，果醬加工過程中原料漂燙、果漿濃縮及滅菌等環(huán)節(jié)均涉及熱處理[26-27]。因此，長時間高溫處理和果膠的含量是果醬中普遍檢出AA 的原因。

表3 不同果醬制品中AA 含量Table 3 AA contents in different jams

2.5 水果罐頭中AA 含量分布

表4所示為不同罐頭產(chǎn)品中AA 含量的檢測結(jié)果。所選4 種產(chǎn)品的固形物中AA 檢出率100%，范圍為（20.07±2.74）～（41.66±3.37）μg/kg。水果罐頭加工中涉及的熱處理工藝有原料漂燙、注液、排氣和殺菌[28-29]，不同水果原料適宜的熱處理溫度及時間不同，導致固形物中AA 含量存在差異。所選4 種產(chǎn)品的糖液中均未檢出AA。這是因為罐頭糖液是將白砂糖、檸檬酸等加入熱水中預先煮制后再轉(zhuǎn)移至盛有預處理后水果的容器中，進一步排氣和滅菌[29-30]，糖液在長時間煮制過程中缺少含氨基化合物作為反應底物，難以形成AA。

表4 不同罐頭中AA 含量Table 4 AA contents in different canned fruits

2.6 水果脆片中AA 含量分布

水果脆片是近年來出現(xiàn)的一類新型水果制品，因其具有原果風味、口感優(yōu)良、低脂低熱、便于攜帶、易于儲存等備受消費者青睞。如表5所示，所選10 種市售水果脆片中AA 檢出率80%，范圍在（17.49±2.56）～（87.74±7.90）μg/kg 之間，產(chǎn)地徐州的黃桃脆和產(chǎn)地煙臺的草莓脆中AA 未檢出。水果脆片主要通過水果原料脫水加工而成，加工方法有真空油炸、微波膨化、冷凍干燥、微波真空等[31]。如表所示，相較于產(chǎn)地煙臺的低溫真空油炸黃桃脆，采取冷凍干燥脫水工藝的徐州產(chǎn)黃桃脆無AA 檢出，這說明不同加工方式及加工溫度顯著影響產(chǎn)品中AA 的形成。同為冷凍干燥，徐州產(chǎn)榴蓮脆中AA 含量高于煙臺產(chǎn)，這可能與產(chǎn)品品種及原料中前體物含量不同有關。另外，在8 種被檢出水果中榴蓮脆、紅棗脆和椰子脆的AA 含量最高，與其它水果相比，這幾種水果碳水化合物和氨基酸含量豐富[32-33]，這為AA 的形成提供了豐富的前體物。

表5 不同水果脆片中AA 含量Table 5 AA contents in different fruit chips

3 結(jié)論

本研究利用UPLC-MS/MS，對國內(nèi)市場上5類（果汁、果脯、果醬、水果罐頭和水果脆片）共58種水果制品中的AA 含量進行了測定。結(jié)果表明各類水果制品中均含有一定量AA，但不同種類及加工方式的水果中AA 含量差異較大。其中西梅類制品中AA 含量最高；在果汁中除西梅汁外均未檢測到AA；果脯（除西梅干）、罐頭、果醬、水果脆片中AA 含量均低于100 μg/kg。研究結(jié)果為水果制品中AA 風險評估和控制提供依據(jù)。另外，低pH 值本身抑制AA 的形成，但西梅汁pH 值為3.8～3.9，加熱溫度低于100 ℃，在所有水果制品中AA 含量卻最高；果醬加工pH 值為2.8～3.3，但其AA 檢出率卻為100%，這驅(qū)使我們在后續(xù)研究中繼續(xù)探究水果中是否富含具有更高反應活性的美拉德反應底物導致AA 的形成，這對于生產(chǎn)健康水果制品有重要意義。