玫瑰枸杞發(fā)酵飲品對大鼠耳廓微循環(huán)的改善作用

李 雍，秦 勇，劉 偉，周雅琳，李?，B，于蘭蘭，陳宇涵，林 峰，許雅君，4*

微循環(huán)作為血液循環(huán)的最小功能單位，肩負著為體內(nèi)活細胞提供營養(yǎng)物質(zhì)并移除代謝副產(chǎn)物的使命，是機體物質(zhì)能量交換的基本場所，也是心血管系統(tǒng)在組織內(nèi)真正發(fā)揮功能的部位[1-2]。微循環(huán)障礙是微循環(huán)管道、血流及其功能發(fā)生紊亂的總稱，幾乎與各系統(tǒng)的多種急、慢性疾病均有著密切關(guān)系[3]?；谄渲匾?，微循環(huán)學已成為一門熱點研究課題。中醫(yī)學中的“孫絡(luò)”與現(xiàn)代醫(yī)學的微血管，特別是微循環(huán)在解剖形態(tài)學及自身循環(huán)特點上具有密切相關(guān)性[4]，“孫絡(luò)”運氣行血，而氣血在經(jīng)絡(luò)中流動時易受干擾，當絡(luò)失通暢或滲灌失常時則常會導致瘀血阻絡(luò)等基本病理變化[5]。微循環(huán)障礙與血瘀證有著緊密的聯(lián)系，目前臨床上常運用活血化瘀的藥物，通過改善微循環(huán)等途徑達到活血通絡(luò)化瘀的功效。

中藥重瓣紅玫瑰性微溫、味甘微苦，歸肝、脾、胃經(jīng)，在我國有著2 000 多年栽培歷史，廣泛用于中醫(yī)處方配藥，具有行氣活血，開竅化淤，疏肝醒脾之功效[6-7]。《本草正義》[8]記載：“疏氣活血，宣通窒滯而絕無辛溫干燥之弊，斷無其匹”。目前科學研究也發(fā)現(xiàn)玫瑰具有促進血液循環(huán)，強化血管壁彈性等功效[9]。枸杞成熟干燥果實稱枸杞子[10]，枸杞子味甘性平，歸肝、腎經(jīng)，滋肝補腎、益精補血[11]，作為經(jīng)典方劑的主要組方藥物在《中華人民共和國藥典》（《中國藥典》）2015年版中收錄制劑70 余種，有“主五內(nèi)邪氣，熱中消渴，周痹”之效[12]。

目前有針對玫瑰花和枸杞子進行改善微循環(huán)功效的探索，而未對其二者在改善微循環(huán)方面的共同功效進行探究。本試驗中玫瑰枸杞發(fā)酵飲品以重瓣紅玫瑰和枸杞子勻漿經(jīng)腸膜明串株菌腸膜亞種發(fā)酵所得，關(guān)于該發(fā)酵飲品對于微循環(huán)的改善作用研究尚未開展。為了解其功效，本研究采用尾靜脈給藥的試驗方法，通過觀測正常用藥及高分子右旋糖酐造成急性微循環(huán)障礙模型下不同時間點大鼠耳廓微循環(huán)血流灌注量（Perfusion Unit，PU）的變化，探討其改善微循環(huán)的作用機制，以期為開發(fā)改善微循環(huán)的野生植物資源提供一定的試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

重瓣紅玫瑰藥材：于2015年5月下旬購自亳州市華云中藥飲片有限公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學張媛副教授鑒定為薔薇科植物重瓣紅玫瑰（Rose rugosa cv.Plena） 的干燥花蕾；枸杞子藥材：于2015年5月下旬購自亳州市華云中藥飲片有限公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學張媛副教授鑒定為茄科植物寧夏枸杞（Lycium barbarum L.）的干燥成熟果實；高分子右旋糖酐，上海源葉生物科技有限公司；異氟烷，北京科業(yè)興誠科技有限公司；SPF 級健康Sprague Dawlay 雌性大鼠，體重約200～220 g，由北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部提供，動物飼養(yǎng)于屏障環(huán)境中，實驗動物使用許可證號：SCXX（京）2016-0010。

激光多普勒血流檢測儀，北京吉安得爾科技有限公司；動物麻醉機，美國Matrx 公司；奧豪斯電子分析天平，上海國際貿(mào)易有限公司。

1.2 方法

1.2.1 玫瑰枸杞發(fā)酵飲品制備 取重瓣玫瑰花、玫瑰茄藥材粉末各10 g，精密稱定，加入300 mL水混合攪拌均勻后加入一定量NaHCO3調(diào)節(jié)pH值至4.5～5.0。在混合液中添加2 g 纖維素酶（20 000 U/g）、2 g 果膠酶（30 000 U/g），50 ℃下酶解90 min，繼續(xù)加入一定量NaHCO3等調(diào)節(jié)pH值至5.8～6.0，然后加入10 g 蛋白胨、50 g 白砂糖，混合攪拌均勻。使溶液在90 ℃水浴條件下滅菌30 min，待溫度降至室溫，接種腸膜明串株菌腸膜亞種發(fā)酵（培養(yǎng)溫度25 ℃，發(fā)酵20 d），發(fā)酵結(jié)束后，溶液以0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得玫瑰枸杞發(fā)酵飲品。

1.2.2 動物分組 40 只雌性大鼠于屏障環(huán)境下喂飼維持飼料，飼養(yǎng)環(huán)境溫度（23±2）℃，濕度50%～60%，光/暗周期12 h/12 h（光照時間7：00-19：00）。經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，所有大鼠稱重，按體重隨機分為4 組，分別為空白對照組、玫瑰枸杞發(fā)酵飲品低劑量組、中劑量組和高劑量組，空白對照組和不同劑量組每組各10 只。各組均給予維持飼料，自由進食、飲用無菌去離子水。

1.2.3 造模及給藥 試驗期間每天早上8：00-10：00 對各劑量組進行灌胃，對各劑量組灌胃給藥不同劑量的受試樣品，其中低劑量組：4 mL/kg、中劑量組：8 mL/kg、高劑量組：16 mL/kg，對照組給予去離子水。以灌胃容量0.1 mL/10 g 連續(xù)灌胃30 d，并根據(jù)體重來調(diào)整灌胃劑量，灌胃期間自由取食和飲水。試驗時間30 d，間隔5 d 稱重并記錄其體重與攝食量。

1.2.4 試驗指標檢測

1.2.4.1 正常情況下大鼠耳廓微循環(huán)測定 分別在灌胃14 d 和30 d 早晨8：00-10：00 測定正常情況下大鼠耳廓微循環(huán)情況，試驗當天利用實驗動物麻醉機，使大鼠吸入異氟烷麻醉，將大鼠腹部向下固定在觀察臺上，使耳廓平展將激光多普勒血流儀的表面探頭固定于耳廓面，記錄大鼠耳廓PU值。比較各組大鼠給藥14 d 和30 d 前后耳廓微循環(huán)PU 差值及血流速度的差異，實驗室溫度維持在（27±1）℃。

1.2.4.2 高分子右旋糖酐所致耳廓微循環(huán)障礙模型測定 在連續(xù)灌胃給藥30 d 后對大鼠進行高分子右旋糖酐耳廓微循環(huán)障礙造模。試驗前用溫水清洗大鼠鼠尾，并用無水乙醇擦拭大鼠尾部，之后利用實驗動物麻醉機使大鼠吸入異氟烷對其進行麻醉，連接多普勒激光血流檢測儀并記錄尾靜脈注射高分子右旋糖酐前大鼠耳廓微循環(huán)PU值。測完后立即尾靜脈注射10%的高分子右旋糖酐10 mL/kg 以制備微循環(huán)障礙模型，15 min 后觀察PU 值的變化，以確定造模是否成功。PU 測定后各組大鼠立即按試驗劑量灌胃給予發(fā)酵飲品或去離子水，1 h 后再次將大鼠麻醉，依照上述同樣方法觀察記錄灌胃后大鼠耳廓微循環(huán)PU 值。在第1次PU 測定時利用黑色馬克筆在大鼠測量部位的耳朵上畫圈標記需要測定的位置，以保證3 次測量的位點一致。比較各組鼠尾靜脈注射高分子右旋糖酐前后及灌胃給藥后大鼠耳廓微循環(huán)PU 值差異，實驗室溫度維持在（27±1）℃。

1.3 統(tǒng)計分析

2 試驗結(jié)果

2.1 試驗期間動物體重增長

試驗期間動物體重變化如圖1所示，適應(yīng)性喂養(yǎng)后，各組動物的初始體重無明顯差異（P>0.05）。整個試驗期間，各組動物的平均體重均呈現(xiàn)隨周齡增加而逐漸增加的趨勢。

圖1 玫瑰枸杞發(fā)酵飲品對大鼠體重的影響Fig.1 The effect of the fermented beverage on the weight of rats

2.2 試驗期間動物食物利用率

試驗期間各組動物的攝食量如圖2所示，各組動物的食物利用率未見明顯差異（P>0.05）。

圖2 玫瑰枸杞發(fā)酵飲品對大鼠食物利用率的影響Fig.2 The effect of the fermented beverage on the food utilization rate of rats

2.3 玫瑰枸杞發(fā)酵飲品對正常情況下大鼠耳廓微循環(huán)PU 值的影響

如表1結(jié)果顯示，與空白對照組相比，在干預14 d 后低、中、高3 個劑量組大鼠耳廓微循環(huán)PU值均有顯著增加，且呈現(xiàn)一定的劑量-反應(yīng)關(guān)系，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；在干預30 d 后低、中、高3 個劑量組大鼠耳廓微循環(huán)PU 值較空白對照組同樣表現(xiàn)為顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；提示玫瑰枸杞發(fā)酵飲品能夠提升正常大鼠局部微循環(huán)的血流灌注量。

表1 玫瑰枸杞發(fā)酵飲品對正常大鼠耳廓微循環(huán)PU 值的影響（±s，n=10）Table 1 The effect of the fermented beverage on the PU of auricle microcirculation in normal rats（±s，n=10）

表1 玫瑰枸杞發(fā)酵飲品對正常大鼠耳廓微循環(huán)PU 值的影響（±s，n=10）Table 1 The effect of the fermented beverage on the PU of auricle microcirculation in normal rats（±s，n=10）

注：與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學意義，*P<0.05，**P<0.01。

組別 給藥14 d 后PU 值 給藥30 d 后PU 值空白對照組 264.32±71.19 253.26±90.42玫瑰枸杞發(fā)酵飲品低劑量組 324.08±80.77* 318.13±60.10*玫瑰枸杞發(fā)酵飲品中劑量組 325.06±30.80* 372.96±53.09**玫瑰枸杞發(fā)酵飲品高劑量組 385.28±45.49** 391.90±30.90**

利用獨立樣本t 檢驗分析玫瑰枸杞發(fā)酵飲品干預14 d 和30 d 對應(yīng)各組PU 數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。提示正常情況下，服用飲品14 d 后即可達到相對穩(wěn)定的改善血流灌注量的效果。

2.4 玫瑰枸杞發(fā)酵飲品對微循環(huán)障礙模型大鼠耳廓微循環(huán)PU 值的影響

表2的結(jié)果顯示，鼠尾靜脈注射高分子右旋糖酐后，各組大鼠耳廓PU 值與注射前相比均顯著降低（P<0.05），提示高分子右旋糖酐造成的大鼠耳廓局部微循環(huán)血流灌流障礙模型建立成功。造模成功后各劑量組按照試驗劑量灌胃玫瑰枸杞發(fā)酵飲品1 次，1 h 后再次測定大鼠耳廓微循環(huán)PU 值，根據(jù)表2可判斷，灌胃后1 h，高劑量組PU值相比空白組升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。中、低劑量組1 h 后的PU 絕對值較造模15 min 時的PU 絕對值也有非常明顯的增加，但是標準差較大，未出現(xiàn)統(tǒng)計學上的顯著性差異。

表2 玫瑰枸杞發(fā)酵飲品對微循環(huán)障礙大鼠耳廓微循環(huán)PU 值的影響（±s，n=10）Table 2 The effect of the fermented beverage on the PU of auricle microcirculation in microcirculatory disturbance rats（±s，n=10）

表2 玫瑰枸杞發(fā)酵飲品對微循環(huán)障礙大鼠耳廓微循環(huán)PU 值的影響（±s，n=10）Table 2 The effect of the fermented beverage on the PU of auricle microcirculation in microcirculatory disturbance rats（±s，n=10）

注：與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學意義，*P<0.05，**P<0.01；與注射高分子右旋糖酐前PU 值相比差異有統(tǒng)計學意義，#P<0.05，##P<0.01。

組別 給藥前PU 值 注射后15 min PU 值 給藥后1 h PU 值空白對照組 274.98±88.00 160.05±62.53## 221.60±81.08玫瑰枸杞發(fā)酵飲品低劑量組 310.36±61.77 201.01±69.89# 251.59±74.39玫瑰枸杞發(fā)酵飲品中劑量組 372.96±53.09** 193.43±75.41## 280.25±90.79玫瑰枸杞發(fā)酵飲品高劑量組 391.90±30.90** 206.43±49.83## 302.81±46.00*?

分析在建立局部微循環(huán)障礙模型基礎(chǔ)上，追加給予1 次玫瑰枸杞發(fā)酵飲品干預前后PU 差值（表3）可發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，追加干預1 h后中、高劑量組SD 大鼠耳廓局部PU 差值明顯升高（P<0.05）；提示玫瑰枸杞發(fā)酵飲品可顯著提升高分子右旋糖酐所致微血管收縮反應(yīng)的回復速度，快速改善高分子右旋糖酐造成的微循環(huán)障礙。

表3 玫瑰枸杞發(fā)酵飲品對微循環(huán)障礙大鼠耳廓微循環(huán)PU 差值的影響（±s，n=10）Table 3 The effect of the fermented beverage on the difference of PU of auricle microcirculation in microcirculatory disturbance rats（±s，n=10）

表3 玫瑰枸杞發(fā)酵飲品對微循環(huán)障礙大鼠耳廓微循環(huán)PU 差值的影響（±s，n=10）Table 3 The effect of the fermented beverage on the difference of PU of auricle microcirculation in microcirculatory disturbance rats（±s，n=10）

注：與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學意義，*P<0.05，**P<0.01。

組別 PU 差值空白對照組 41.78±17.57玫瑰枸杞發(fā)酵飲品低劑量組 75.03±49.83玫瑰枸杞發(fā)酵飲品中劑量組 86.82±38.44*玫瑰枸杞發(fā)酵飲品高劑量組 91.77±22.27**

3 討論

耳廓微循環(huán)變化作為全身微循環(huán)的表現(xiàn)具有一定的代表意義，大鼠耳廓背部皮膚纖薄，微血管位置表淺，呈平面分布且充分展開，自細動靜脈到毛細血管形成完整的終末血管網(wǎng)絡(luò)，微血管形態(tài)清晰，易于觀察便于對各微血管節(jié)段進行無創(chuàng)傷性追蹤觀察[13]。本試驗以正常情況下和高分子右旋糖酐造成急性微循環(huán)障礙模型下大鼠耳廓微循環(huán)血液灌流量的變化為研究指標，探究玫瑰枸杞發(fā)酵飲品對大鼠耳廓微循環(huán)的改善情況，研究結(jié)果表明，正常情況下玫瑰枸杞發(fā)酵飲品高、中、低各劑量組均可在灌胃14 d 時顯著提升大鼠微循環(huán)血流灌注量，并長效穩(wěn)定保持其提升血流灌注量的功能直至30 d。靜脈注射高分子右旋糖酐后，大鼠耳廓血流灌注量顯著降低，造成局部微循環(huán)障礙模型。給予發(fā)酵飲品后，高、中、低劑量組血流灌注量均有顯著增加，且與造模前相比較差異均有統(tǒng)計學意義。

微循環(huán)是指機體內(nèi)微細血管與其周圍組織細胞進行物質(zhì)代謝的一系列結(jié)構(gòu)與成分，是全身血液循環(huán)的重要組成部分，對各組織臟器血供及功能代謝起著重要作用[14]。微循環(huán)負責協(xié)調(diào)血管張力的調(diào)整，以使局部組織灌注與需氧量相匹配[2]。正常情況下，微循環(huán)的血流量與組織器官的代謝水平相適應(yīng)，保證各組織器官的血液灌流量并調(diào)節(jié)回心血量[15]。正常情況下經(jīng)口灌胃該飲品14 d時，即可顯著提升大鼠微循環(huán)并穩(wěn)定保持，提示該飲品可作為保健品用于改善非病理狀態(tài)下的微循環(huán)情況，對于微循環(huán)障礙有一定的預防作用，并可以穩(wěn)定保持其功效。

微循環(huán)可以成為許多病理過程和疾病的原發(fā)性或繼發(fā)性的應(yīng)答器官，并將直接影響各器官的生理功能，微循環(huán)障礙參與多種疾病的病理過程，其中的炎癥反應(yīng)及血管內(nèi)皮損傷可引起機體心、肺、肝、腎等多器官功能障礙，繼而成為病人致殘乃至死亡的重要病因之一[16-17]，而急性微循環(huán)障礙更是很多疾病發(fā)生的共同病理生理環(huán)節(jié)。微循環(huán)血流灌注量是反映微循環(huán)狀態(tài)的一項重要參數(shù)，并能夠在一定程度上闡釋經(jīng)絡(luò)的代謝生理機制[18]。急性微循環(huán)障礙模型下，高黏滯膠體高分子右旋糖酐經(jīng)靜脈注射后，大鼠血漿及全血黏度急劇增加，紅細胞聚集，血流阻力大幅度升高、血流減慢甚至停滯，而血漿黏度急劇改變，并通過刺激血管壁黏度感受器，引起血管運動機能改變。本研究中給予發(fā)酵飲品后，各組血流灌注量顯著增加，提示玫瑰枸杞發(fā)酵飲品可以在一定程度上對抗高分子右旋糖酐所致的SD 大鼠微血管運動機能與血漿黏度改變等導致的微循環(huán)障礙作用。該結(jié)果提示玫瑰枸杞飲品在緩解急性微循環(huán)障礙方面有一定的臨床應(yīng)用前景。

中醫(yī)學認為女性宮寒與腎虛、脾氣虛、血虛、肝郁、痰濕、濕熱、血瘀等原因有關(guān)?，F(xiàn)在中醫(yī)則以治療腎虛為主。玫瑰枸杞二者滋補肝腎，養(yǎng)肝明目，活血止痛、清熱解渴、理氣平肝，本研究結(jié)果與玫瑰花和枸杞子的活血化瘀及行氣活絡(luò)作用相吻合，玫瑰枸杞發(fā)酵飲品是采用重瓣紅玫瑰和枸杞子勻漿接種腸膜明串株菌腸膜亞種發(fā)酵所得。發(fā)酵工藝的運用具有很強的增效減毒功效，在很大程度上提高了藥物本身活血化瘀的作用，可有效改善人體微循環(huán)，促進血液循環(huán)。根據(jù)本試驗結(jié)果，玫瑰枸杞發(fā)酵飲品在改善微循環(huán)方面值得進一步研究和開發(fā)，為其未來的臨床治療和應(yīng)用提供了一定思路和試驗基礎(chǔ)。