鯉魚來源乙酰膽堿酯酶的高效表達及分子對接模擬

盧海強，陳 偉，黃 蕾，谷新晰，田洪濤

目前，有機磷類 （organophosphorus insecticides，OPs）和氨基甲酸酯類（carbamate insecticides，CBs）農(nóng)藥的不合理使用已嚴重威脅到農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量安全[1-3]。如何快速、靈敏及低成本的檢測農(nóng)副相關(guān)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留，對于保障我國的食品安全具有重要的現(xiàn)實意義。目前測定有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的方法主要有3 類，分別是色譜法[4]、免疫法[5]和酶抑制法[6]。其中酶抑制劑法檢測成本較低，可用于農(nóng)副產(chǎn)品生產(chǎn)的現(xiàn)場檢測，成為最有發(fā)展?jié)摿Φ臋z測方法，而乙酰膽堿酯酶是酶抑制法的核心材料。乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，E.C.3.1.1.7）是生物神經(jīng)傳導(dǎo)中的關(guān)鍵酶，也是有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥作用的靶位點[7-8]。當(dāng)前，酶抑制劑法推廣的瓶頸主要是較高的酶制劑生產(chǎn)成本及酶對有機磷農(nóng)藥所表現(xiàn)出的較低的敏感性。

一般來說，酶制劑發(fā)展可分為3 個階段：第1階段是酶制劑主要從動物、植物和微生物體中直接提取[9-10]；第2 個階段是利用基因工程技術(shù)實現(xiàn)酶基因的高效表達，擺脫原材料的束縛，降低酶的生產(chǎn)成本[11-12]；而第3 個階段主要是對酶制劑分子進行改造，使它的催化效率、穩(wěn)定性及酶學(xué)性質(zhì)向著有利于實際應(yīng)用需求的方向改變，稱為酶的分子進化[13]。目前，乙酰膽堿酯酶處于第1 階段發(fā)展末期和第2 階段初期的過渡階段，即大量的乙酰膽堿酯酶主要從生物體直接提取獲得，而該類方法獲得乙酰膽堿酯酶產(chǎn)量低、成本高，難以滿足檢測的需要。目前，眾多科研工作者對多種物種如魚、家蠶和菜葉蛾等來源的乙酰膽堿酯酶基因進行克隆表達[14-16]，發(fā)現(xiàn)它們對有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的敏感性存在較大差異，其中魚源乙酰膽堿酯酶表現(xiàn)出較好的應(yīng)用潛力[17-18]。2009年，Sato等[19]選用pPICZα A 載體和P.pastoris X-33 宿主完成了對鯉魚來源的乙酰膽堿酯酶基因的克隆表達，然而，酶的表達量偏低（181 mU/mL ± 31 mU/mL）。2019年，Liang[20]等采用細胞表面展示技術(shù)對CpAChE 進行研究，取得較好的效果，然而，該酶表達量不高的問題依然制約其在食品農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用。

本研究以鯉魚乙酰膽堿酯酶基因（CpAChE）為研究對象，依據(jù)畢赤酵母的密碼子偏好性對該基因進行密碼子優(yōu)化，獲得乙酰膽堿酯酶優(yōu)化基因CpAChEopt。采用pPIC9K 及畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115 表達系統(tǒng)進行高效表達。通過對重組CpAChE 的酶學(xué)性質(zhì)表征及其對有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥敏感性的研究，為乙酰膽堿酯酶在食品農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用提供依據(jù)。利用分子對接模擬重組乙酰膽堿酯酶與克百威的作用，尋找潛在的結(jié)合殘基，為后續(xù)酶的定向改造提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Easy Taq DNA 聚合酶、dNTPs（2.5 mmol/L）、T4 DNA 連接酶和限制性內(nèi)切酶Ecol I、Not I 和BglⅡ，TaKaRa 公司；質(zhì)粒小提中量試劑盒、DNA回收試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司；二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）、典化硫代乙酰膽堿，索萊寶生物科技有限公司；有機磷農(nóng)藥、氨基甲酸酯類農(nóng)藥，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所；其它化學(xué)試劑為分析純。

1.2 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

巴斯德畢赤酵母GS115、質(zhì)粒pPIC9k 和大腸桿菌DH5α 由本實驗室保藏。

LB 培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母抽提物5 g，NaCl 1 g，pH 7.0，定容至1 L，滅菌備用。

YPD 培養(yǎng)基：酵母浸膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，定容至1 L，滅菌備用。

BMGY 培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L，酵母抽提物10 g/L，磷酸鉀緩沖液 （pH 6.0，100 mmol/L），YNB 13.4 g/L，0.016 μmol/L 生物素，甘油10 g/L。

BMMY 培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L，酵母抽提物10 g/L，磷酸鉀緩沖液 （pH 6.0，100 mmol/L），YNB 13.4 g/L，0.016 μmol/L 生物素，甲醇10 g/L。

1.3 方法

1.3.1 乙酰膽堿酯酶基因的優(yōu)化與合成 為提高乙酰膽堿酯酶（AChE）在巴斯德畢赤酵母GS115中的表達量，依據(jù)密碼子使用數(shù)據(jù)庫（http：//cazusa.or.jp/codon）信息，優(yōu)化乙酰膽堿酯酶基因（AB361595）低頻氨基酸密碼子（<10‰），且對基因各區(qū)段GC 含量進行優(yōu)化，使GC 含量均保持在50%左右。在目的基因5' 端和3' 端分別添加EcoR I （GAATTC） 酶切位點和Not I（GCGGCCGC）酶切位點，優(yōu)化后的乙酰膽堿酯酶基因（CpAChEopt）由金斯瑞生物科技公司合成。

1.3.2 重組菌株的構(gòu)建 分別將pUC57-CpAChEopt 質(zhì)粒和pPIC9K 質(zhì)粒進行雙酶切（EcoR I 和Not I），利用膠回收試劑盒對酶切產(chǎn)物進行回收，并進行CpAChEopt 和pPIC9K 片段的連接反應(yīng)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-CpAChEopt，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)中。采用通用引物5’AOX 和3’AOX 對轉(zhuǎn)化子進行菌液PCR 驗證，將陽性轉(zhuǎn)化子送至北京中科希林生物科技有限責(zé)任公司進行測序。將測序正確的菌株進行培養(yǎng)，利用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒pPIC9KCpAChEopt，使用限制性內(nèi)切酶Bgl Ⅱ?qū)χ亟M質(zhì)粒pPIC9K-CpAChEopt 進行線性化，線性化產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化至P.paster GS115 宿主中，參照畢赤酵母表達手冊進行陽性轉(zhuǎn)化子的篩選。

1.3.3 重組菌株誘導(dǎo)表達及SDS-PAGE 分析 挑取陽性轉(zhuǎn)化子至YPD 培養(yǎng)基（50 mL）中培養(yǎng)12 h（30 ℃，250 r/min）后，取2 mL 轉(zhuǎn)接至200 mL BMGY 中，在搖床30 ℃培養(yǎng)48 h 后（8 000 g 離心10 min 收集細胞） 重懸于100 mL 甲醇體積分數(shù)為0.5%的BMMY 培養(yǎng)基中誘導(dǎo)72 h，每間隔24 h補加甲醇，離心收集發(fā)酵液，即為粗酶液，進行后續(xù)試驗分析。

1.3.4 乙酰膽堿酯酶活性的測定 酶活測定參照Ellman 等[21]的方法并進行適當(dāng)調(diào)整：取50 μL 適當(dāng)稀釋的酶液和50 μL 碘化硫代乙酰膽堿，在pH 8.0（磷酸鹽緩沖液，0.1 mol/L）的緩沖液中，25 ℃反應(yīng)10 min 后，加入50 μL 的SDS（10%）溶液終止反應(yīng)，隨后加入50 μL DTNB（2 mmol/L）進行顯色，顯色穩(wěn)定后在波長412 nm 處測定吸光值。

酶活單位（IU）：以每分鐘水解1 μmol 碘化硫代乙酰膽堿的酶量定義為1 個酶活單位（IU）。

1.3.5 重組乙酰膽堿酯酶的酶學(xué)性質(zhì)測定

1.3.5.1 pH 值對重組酶活性的影響 將重組乙酰膽堿酯酶酶液分別在pH 5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5 和9.0 條件下進行催化反應(yīng)，測定重組酶CpAChE 的酶活力，以酶活力最高值為100%計算，分析該酶的pH 值反應(yīng)范圍。將重組酶CpAChE 在pH 2.0～12.0 的條件下，0 ℃處理1 h，對照組為未進行處理的酶，參照1.3.4 節(jié)方法測定酶活力，以酶活力最高值為100%計算分析其pH值耐受性。

1.3.5.2 溫度對重組酶活性的影響 將重組酶CpAChE 在最適pH 值下，分別在10，20，25，30，35，40，45 ℃的溫度條件下測定重組酶CpAChE 的酶活力，以酶活力最高值為100%計算，分析該酶的溫度反應(yīng)范圍。將重組酶在15，25，35，45 ℃的溫度條件下，孵育0，10，20，30，60 min 后，測定剩余酶活力，以酶活力最高值為100%計算分析其熱穩(wěn)定性。

1.3.5.3 有機試劑及金屬離子對重組酶活性的影響 在最適合反應(yīng)條件下，分別測定丙酮、乙醇、尿素、CTAB、吐溫、SDS 和9 種金屬離子下的CpAChE 酶活力，探究化學(xué)試劑和金屬離子對酶活性的影響，為該酶的應(yīng)用提供必要的指導(dǎo)。

1.3.6 重組酶農(nóng)藥敏感性和動力學(xué)參數(shù)的測定農(nóng)藥敏感性試驗參考何紹志等[22]方法：取50 μL適當(dāng)稀釋酶液，25 μL 碘化硫代乙酰膽堿溶液（8 mmol/L）和75 μL 不同濃度農(nóng)藥溶液（pH 8.0）混合均勻，25 ℃反應(yīng)10 min 后，加入50 μL 的SDS（10%）溶液終止反應(yīng)，隨后加入50 μL 的DTNB（2 mmol/L）進行顯色，顯色穩(wěn)定后在412 nm 處測定吸光值ΔAx。對照為不添加農(nóng)藥的標準酶活測定值ΔA0。根據(jù)下式計算抑制率：（ΔA0-ΔAX）/ΔA0×100%，并計算農(nóng)藥對CpAChE 的抑制中濃度IC50。配制0.5，1，2，4，8，10 mg/mL 的ATCHI 底物溶液，依據(jù)Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)法計算動力學(xué)參數(shù)Km及Vmax。

1.3.7 重組酶與克百威的分子對接 利用BLAST 程序從NCBI 的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中找到與CpAChE 序列相似且結(jié)構(gòu)已知的乙酰膽堿酯酶，將其結(jié)構(gòu)作為模板，利用Discovery studio 2.5中的MODELER module 模塊對CpAChE 進行同源建模；并用PROCHECK、ERRAT 和ProSA 軟件對所得模型的質(zhì)量進行評估，獲得CpAChE 的三維結(jié)構(gòu)模型。從NCBI 網(wǎng)站化學(xué)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov） 獲得小分子克百威（CID：2566，MF：C12H15NO3）的結(jié)構(gòu)，用Autodock中的Libdock 模塊進行分子對接，采用Pymol 軟件進行對接模型的可視化分析。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析及處理 每次試驗平行測定3次，利用Excel 2010 和SPSS 19.0 等軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)結(jié)果采用平均值±標準誤差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙酰膽堿酯酶基因分析

乙酰膽堿酯酶基因（CpAChE）經(jīng)密碼子優(yōu)化后，GC 含量由33%～66%調(diào)整為45%～55%范圍內(nèi)，密碼子適應(yīng)指數(shù)（CAI）由0.67 優(yōu)化為0.88，優(yōu)化前后的序列一致性為77%。乙酰膽堿酯酶CpAChE 由前22 氨基酸的信號肽和催化區(qū)域組成，其中膽堿結(jié)合位點為Trp108，推測該酶分子可形成3 對二硫鍵，分別是Cys 91-Cys 118、Cys 275-Cys290、Cys 427-Cys580。大多數(shù)乙酰膽堿酯酶在C 端含有T 肽，主要起連接各個單鏈分子形成聚合物體的作用，而大量證據(jù)表明，T 肽結(jié)構(gòu)阻礙基因的異源高效表達[23]。

2.2 重組酶的誘導(dǎo)表達及SDS-PAGE 分析

參照畢赤酵母表達手冊要求進行重組菌株的培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達。經(jīng)測定，發(fā)酵上清液的乙酰膽堿酯酶酶活為7.4 U/mL，是Sato 等[19]報道的該酶表達量的40 倍，這表明利用密碼子優(yōu)化實現(xiàn)了酶的高效表達。酶液經(jīng)SDS-PAGE 分析，結(jié)果如圖1所示。在約50 ku 處出現(xiàn)目標蛋白條帶，而這與CpAChE 的蛋白理論分子質(zhì)量（66.84 ku）存在一定的差異。這很可能與P.pastoris GS115 菌株所分泌內(nèi)源性蛋白酶降解有關(guān)。經(jīng)分析，該氨基酸序列存在3 個“Lys-Arg”蛋白酶酶切位點和3 個“Arg-Arg”蛋白酶酶切位點。該蛋白分子經(jīng)Endo H 處理后，片段大小并未發(fā)生變化，表明N 糖基化并未對該酶進行后修飾加工。

圖1 重組乙酰膽堿酯酶CpAChE 的SDS-PAGE電泳分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of the recombinant CpAChE

2.3 重組酶CpAChE 酶學(xué)性質(zhì)分析

參考周思多等[23]的報道，以SDS 為終止劑開展重組酶CpAChE 的酶學(xué)性質(zhì)研究，結(jié)果如下。經(jīng)測定（圖2a），重組酶CpAChE 的最適反應(yīng)pH 值為8.0，當(dāng)pH 值低于5.0 時，該酶活性無法被檢測到。由于當(dāng)pH 值大于9.0 之后，底物降解所造成的本底干擾非常嚴重，因此堿性條件下的乙酰膽堿酯酶活性還需進一步探究。經(jīng)pH 穩(wěn)定性測定（圖2b），發(fā)現(xiàn)該酶在堿性條件（pH 7.0，11.0）下能使酶活性保持在95%以上，相對穩(wěn)定，而該酶在pH 2.0，6.0 處理1 h 后，CpAChE 剩余酶活性低于80%，且隨著pH 值的降低而減弱。重組酶CpAChE 的最適反應(yīng)溫度為25°C，其活性反應(yīng)溫度范圍為10～45°C（圖2c），結(jié)果表明該酶非常適合常溫反應(yīng)。重組酶CpAChE 在15 ℃和25 ℃條件下，處理1 h 酶活性保持不變，活力穩(wěn)定 （圖2d）。隨著溫度的提高，該酶的穩(wěn)定性越來越差，在35 ℃處理1 h 后，CpAChE 相對酶活僅損失20%，而45 ℃處理20 min 后，CpAChE 活性完全喪失。

圖2 乙酰膽堿脂酶CpAChE 的酶學(xué)性質(zhì)分析Fig.2 The characterization of recombinant CpAChE

2.4 化學(xué)試劑及金屬離子對重組酶活性的影響

酶在實際應(yīng)用時，除了受自身的性質(zhì)影響外，往往受到具體的環(huán)境因素的干擾，而化學(xué)試劑及金屬離子就是比較重要的外界因素。由表1可知，多種有機試劑及表面活性劑對酶活力的影響存在差異，且不同濃度也存在差異。丙酮、乙醇、尿素、CTAB、吐溫80 和SDS 均對重組酶CpAChE 活性有抑制作用，抑制作用隨著試劑濃度的提高而增強，而乙醇對重組酶CpAChE 活性抑制作用相對較弱。經(jīng)對9 種金屬離子對重組酶CpAChE 活性的影響分析發(fā)現(xiàn)，Mg2+、K+、Ca2+和Li+離子對該酶活性有較強的促進作用，其中Mg2+（5 mmol/L）的促進最為明顯，使該酶活力提高約1.7 倍，而Cu2+、Fe3+和Zn2+離子則對該酶表現(xiàn)出較強的抑制作用。

表1 有機溶劑及金屬離子對CpAChE 活性的影響Table 1 Effects of various organic solvents and metal ions on the activity of recombinant CpAChE

2.5 重組酶CpAChE 對農(nóng)藥的敏感性測定

重組酶CpAChE 與16 種有機磷和氨基甲酸類農(nóng)藥的敏感性如表2所示，結(jié)果表明不同農(nóng)藥對CpAChE 活性抑制存在差異，16 種農(nóng)藥對CpAchE 的IC50由小到大順序為：克百威<涕滅威<甲拌磷<敵敵畏<仲丁威<久效磷<樂果<毒死蜱<對硫磷<倍硫磷<西維因<馬拉硫磷<葉蟬散<殘殺威<速滅威<抗蚜威。8 種有機磷農(nóng)藥對CpAchE 的IC50差異較小，而氨基甲酸酯類農(nóng)藥對CpAChE 的IC50差異較大，其中CpAChE 對克百威的敏感性最強，IC50為0.176 μg/mL，而對速滅威和抗蚜威的敏感性很弱，IC50分別為17.0 μg/mL 和182.7 μg/mL。由IC15結(jié)果可知，重組酶對上述16 種農(nóng)藥的檢查范圍為0 至3.0 μg/mL 不等，而對克百威檢查最為敏感，綜上可以確定重組CpAChE 可以用于多種有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的檢測。在一級反應(yīng)時間之內(nèi)（10 min），重組CpAChE 的動力學(xué)常數(shù)Km和Vmax分別為1.639 mg/mL 和8.071 μmol/min/mg。

表2 重組乙酰膽堿酯酶對農(nóng)藥敏感性分析Table 2 Sensitivity and the limit of detection of recombinant CpAChE to pesticides

（續(xù)表2）

2.6 乙酰膽堿酯酶與克百威分子對接模型分析

以數(shù)據(jù)庫中的乙酰膽堿酯酶（PDB：1f8u，PDB：2w6c，PDB：2x8b 和PDB：4bdt） 作為模板，利用Discovery studio 2.5 中的MODELER module 模塊對CpAChE 進行同源建模，得到的模型經(jīng) Ramachandran 圖評估，該模型蛋白中的83.0%氨基酸在核心區(qū)域為（A，B，L 區(qū)），11.7%的氨基酸分布在允許區(qū)域（a，b，l，p 區(qū)），3.2%的氨基酸分布在額外接受區(qū)域（～a，～b，～l，～p 區(qū)），僅有2.2%的殘基落在不允許區(qū)域內(nèi)（空白區(qū)），約98%以上的氨基酸構(gòu)象合理，表明所構(gòu)建的氨基酸構(gòu)型穩(wěn)定。用Profile-3D 對分子模型中氨基酸序列的相容性進行評價表明，92.7%的氨基酸Verify score 大于0.2，氨基酸殘基側(cè)鏈合理，上述分析表明模型的構(gòu)建是成功的。

配體克百威和受體膽堿酯酶CpAChE 模型對接，通過CDOCKER ENERGY 打分后，選擇最適的結(jié)合構(gòu)象，由圖3可知，配體克百威分子進入到了CpAChE 分子的活性口袋[24]。由于配體分子在結(jié)合物中的結(jié)合構(gòu)象的不同，從而使得它們形成相互作用的活性位點周圍的氨基酸殘基以及相互作用強弱均不同。進一步分析發(fā)現(xiàn)，重組乙酰膽堿酯酶CpAChE 與底物克百威3? 范圍內(nèi)的氨基酸共19 個，其中以范德華力發(fā)揮作用的氨基酸16個，分別是Asp96、Ile105、Trp108、Asn109、Gly142、Gly143、Gly144、Glu224、Tyr155、Ser225、Ala226、Phe315、Phe356、His495、Gly496 和Ile499，而以氫鍵作用力發(fā)揮作用的氨基酸是Tyr146、Ser147 和Tyr355，是與克百威作用的最為關(guān)鍵的氨基酸。由此可見，二者在結(jié)合過程中所產(chǎn)生的范德華力和氫鍵可使小分子克百威與CpAChE 緊密結(jié)合，進而競爭性抑制CpAChE 酶活性。

圖3 乙酰膽堿酯酶CpAChE 的分子模型及與克百威結(jié)合位點分析Fig.3 Molecular model of the recombinant CpAChE and docking results with carbofuran

3 討論

自發(fā)現(xiàn)乙酰膽堿酯酶（AChE）可用于農(nóng)藥殘留的檢測之后[25-27]，人們對乙酰膽堿酯酶的挖掘，提高酶的靈敏性和降低生產(chǎn)成本等方面的研究從未停止過。乙酰膽堿酯酶主要來自脊椎動物和非脊椎動物，而大量研究表明不同來源的乙酰膽堿酯酶對農(nóng)藥的敏感性存在較大差異，其中脊椎動物中的魚類普遍對OPs 和CBs 殺蟲劑有較強敏感性[28]。Chuiko[29]通過對來自白鮭科、狗魚科、鱸科和鯉科類的11 種魚的AChE 研究發(fā)現(xiàn)，鯉科魚較其它3 類魚不僅表現(xiàn)出較高的酶活性，同時靈敏性也非常突出。雖然鯉科魚類的AChE 性質(zhì)突出，但是由于問題的復(fù)雜性及相關(guān)技術(shù)的不成熟，近十年，鯉魚來源乙酰膽堿酯酶的研究才進入到分子時代，這與非脊椎動物為代表的果蠅、家蠶和線蟲來源的AChE 等研究深度還有一定的差距。

迄今為止，包括昆蟲、動物細胞和植物在內(nèi)的表達系統(tǒng)已成功對AChE 進行了表達，但由于操作的復(fù)雜性和較高的生產(chǎn)成本致使其并不適合大規(guī)模生產(chǎn)乙酰膽堿酯酶[30-32]。巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）系統(tǒng)[33]能夠?qū)ν庠椿虍a(chǎn)物進行修飾，如糖基化和生成二硫鍵等，遺傳操作簡便，僅使用純試劑進行培養(yǎng)，如甲醇、葡萄糖或甘油、生物素、無機鹽和水。此外，巴斯德畢赤酵母細胞可以高密度培養(yǎng)，分泌的內(nèi)源性蛋白水平低，且在AOX1 啟動子控制下高水平表達異源蛋白，使得巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)廣泛被用于真核基因的表達。該系統(tǒng)中的表達載體主要有pPICZα A、pPSC3k 和pPIC9K 等，常用的宿主菌主要有GS115、X-33 和KM71 等，畢赤酵母中不同的表達質(zhì)粒和宿主的組合差異會對酶的表達量和性質(zhì)造成顯著影響[34]，重組乙酰膽堿酯酶CpAchE 在SDS-PAGE 分析中，目標條帶大小與理論大小存在差異，其原因很可能是巴斯德畢赤酵母的內(nèi)源蛋白酶切割CpAchE 所致。乙酰膽堿酯酶基因CpAChE 中存在多個Kex2 蛋白酶酶切位點（6處），同時CpAChE 中存在6 個潛在的N 糖基化位點未受到宿主的糖基化修飾，使得蛋白的分子質(zhì)量大小與理論值存在差異，而這與Sato 等[19]研究結(jié)果存在差異，表明不同的宿主和載體可對酶的性質(zhì)造成不同影響。本研究采用pPIC9K 質(zhì)粒和GS115 宿主對優(yōu)化后鯉魚乙酰膽堿酯酶基因CpAChE 進行重組表達，使鯉魚乙酰膽堿酯酶CpAChE 的表達量提高了40 倍。

CpAChE 對本研究中檢測的16 種有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥中的14 種表現(xiàn)出一定的敏感性（IC50值均<4 μg/mL）。總體而言，CpAChE 對氨基甲酸酯類農(nóng)藥表現(xiàn)出更強的敏感性，其中對克百威表現(xiàn)出最高的敏感性，這與Dembele 等[35]報道相一致。分子對接分析中發(fā)現(xiàn)，克百威分別與受體CpAChE 中的Tyr146、Ser147 和Tyr355 形成氫鍵，這些氫鍵網(wǎng)絡(luò)增強了克百威與CpAchE 的結(jié)合能力，因此加強了與底物競爭CpAChE 能力。除此之外，有機小分子和蛋白質(zhì)等生物大分子之間的疏水作用力和范德華力也發(fā)揮重要作用。

本研究利用巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)對優(yōu)化的乙酰膽堿酯酶基因進行了高效表達，該酶可用于常見農(nóng)藥殘留的檢測，其中對克百威的檢測最為靈敏，克百威主要通過與重組CpAChE 形成穩(wěn)定的復(fù)合體達到抑制酶活性的效果，而Tyr146、Ser147 和Tyr355 很可能在其中發(fā)揮更加重要的作用。