薏苡仁油自納米乳化體系的建立及體外釋放

易 醒，李 娟，易孜成，羅俊溢，袁弋婷，夏小華，肖小年*

薏苡仁是禾本科的草本植物，為藥食同源的原料，其營養(yǎng)價值較高，在健脾祛濕、抗癌、降低血壓和免疫調(diào)節(jié)等方面具有多種作用[1-2]。薏苡仁油（Coix seed oil，CSO）是薏苡仁中的主要生物活性組分，有顯著的抗腫瘤作用，主要含有甘油三酯、甘油二酯等成分[3]。目前以CSO 為原料生產(chǎn)的康萊特注射液已廣泛運用在肝癌、胃癌等的治療及輔助治療[4]。然而，CSO 較差的水溶性、穩(wěn)定性和口服生物利用度，限制了其在食品及醫(yī)藥領(lǐng)域的使用和發(fā)展[5]。目前，對于CSO 制劑，以微乳制劑[6]、納米粒、脂質(zhì)體[7]、薏苡仁油酯微膠囊形式居多，鮮有CSO 自乳化體系及其體外釋放的相關(guān)報道。

自乳化遞送系統(tǒng)是由親脂性或疏水性物質(zhì)、油相、表面活性劑（Surfactant，SA）和助表面活性劑（Cosurfactant，CoSA）組成，在胃腸道蠕動的內(nèi)環(huán)境條件下，可自發(fā)乳化成粒徑小于500 nm 的水包油（O/W）型乳劑[8]。根據(jù)液滴尺寸大小，自乳化遞送系統(tǒng)可分為自納米乳化遞送系統(tǒng)（Self-nanoemulsifying Delivery System，SNEDS） 和自微米乳化遞送系統(tǒng) （Self-microemulsifying Delivery System，SMEDS）[9]。目前研究發(fā)現(xiàn)，SNEDS 可解決水難溶性物質(zhì)在胃腸道內(nèi)快速分散、溶解與吸收的問題，達到顯著提高口服生物利用度，增加在胃腸道的溶出及促進吸收的目的[10]，對提高BCS Ⅱ類藥物生物利用度有較多幫助。

本文嘗試采用偽三元相圖及星點設(shè)計-效應(yīng)面優(yōu)化等方法構(gòu)建薏苡仁油自納米乳化體系（CSO-SNEDS），并對其特性進行表征。同時，基于體外釋放試驗，對CSO-SNEDS 體外釋放及動力學(xué)進行研究。本研究期望解決CSO 存在的低水溶性問題，并為CSO-SNEDS 體內(nèi)釋放情況的研究與預(yù)測提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

薏苡仁油，廣州和博香料有限公司；胰酶、胃蛋白酶、透析袋，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；蓖麻油聚氧乙烯醚-35（EL-35），BASF；聚氧乙烯失水山梨醇單油酸酯（Tween80）、聚氧乙烯山梨醇酐棕櫚酸酯（Tween40）、聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯（Tween20）、蓖麻油聚氧乙烯醚-40（EL-40）、聚乙二醇400（PEG-400）、失水山梨醇單油酸酯 （Span80）、聚氧乙烯山梨醇酐硬脂酸酯（Tween60）、失水山梨醇單月桂酸酯（Span20）、丙二醇、丙三醇，均為分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AED110 電子天平，美國奧豪斯Adventurer 公司；DK-S24 電熱恒溫水浴鍋，上海森信實驗儀器有限公司；RH-數(shù)顯磁力攪拌器，德國IKA 公司；TDL-5-A 低速臺式離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；T6 紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；NICOMP380ZL 激光納米粒度測定儀，英國馬爾文粒度分析儀公司；SHA-A 數(shù)顯恒溫水浴振蕩器，常州天瑞儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 CSO-SNEDS 的制備過程 準確稱取所需量的SA、CoSA 和CSO，置于小燒杯中，在60 ℃下攪拌（250 r/min）約20 min，使其均勻混合，直至形成黃色的澄清黏稠液體。取0.1 mL 的上述制備的混合物至10 mL 蒸餾水中，在37 ℃條件下低速攪拌（100 r/min），考察其自乳化情況。以外觀是否澄清透明和自乳化時間為指標，確定該配方能否形成自乳化制劑。

據(jù)文獻所述，自乳化速率等級可如下所示（表1），其中A、B 級符合試驗要求[11]。

表1 自乳化速率等級表Table 1 Self-emulsification rate grade table

1.3.2 CSO 與SA、CoSA 互溶情況考察 將1 mL CSO 分別加入到裝有4 mL 不同SA （分別為Tween80、EL-40、EL-35、Tween60、Tween40、Tween20）或不同CoSA（分別為丙三醇、丙二醇、聚乙二醇400）的具塞離心管中，渦旋混勻后，3 500 r/min 離心1 min，若可互溶則繼續(xù)加入CSO，以出現(xiàn)分層和渾濁為臨界指標評估互溶情況。

1.3.3 配方的初步篩選試驗

1.3.3.1 單一SA 的篩選 分別以Tween60、EL-35、EL-40 作為SA，按質(zhì)量比9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，1∶9 準確稱取SA 與CSO，在不使用CoSA 的情況下，按1.3.1 節(jié)進行CSOSNEDS 制備，并考察其自乳化情況。

1.3.3.2 CoSA 的篩選 分別以PEG 400 和丙三醇作為CoSA，固定SA 與CoSA 質(zhì)量比（Km）為2∶1，按質(zhì)量比9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，1∶9 準確稱取SA 與CSO，按1.3.1 節(jié)進行CSOSNEDS 制備，并考察其自乳化情況。

1.3.3.3 復(fù)合SA 的篩選 選取Tween60、EL-35、EL-40 分別和Span80、Span20 進行復(fù)配，復(fù)配比例為9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，1∶9，CoSA 為丙三醇，固定Km=3∶1，復(fù)合SA 與CSO 質(zhì)量比為9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，1∶9，按1.3.1 節(jié)進行CSO-SNEDS 制備，并考察其自乳化情況。

1.3.3.4 偽三元相圖的繪制 采用初步篩選結(jié)果來進行偽三元相圖繪制，根據(jù)微乳區(qū)大小來確定Km范圍和最高載油量，具體方法如下：將油相、SA和CoSA 作為偽三元相圖的3 個頂點，將SA 與CoSA 按照質(zhì)量比9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，1∶9 的比例混合，再將制得的混合物與油相以質(zhì)量比9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，1∶9 的比例混勻，將可形成自微乳點連線成面即得相圖。

1.3.4 星點設(shè)計-效應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)化配方

1.3.4.1 試驗設(shè)計 結(jié)合偽三元相圖的試驗結(jié)果，選取對自納米乳化體系影響較顯著的油相質(zhì)量分數(shù)（X1，oil%）和Km（X2）作為考察因素，以自乳化時間和透光率作為評價指標。

透光率的測定是由吸光度值換算得出，自乳化時間的測定方法：取0.1 mL CSO-SNEDS 至10 mL 蒸餾水中，在37 ℃條件下低速攪拌 （100 r/min），于0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4，5 min 時取樣進行吸光度測定，當吸光度值趨于穩(wěn)定不再改變時，此時自乳化制劑已經(jīng)乳化完全，即為自乳化時間。

依據(jù)星點設(shè)計原理擬采用二因素，五水平設(shè)計因素水平表，將油相比例控制在10%～22%，Km范圍控制在1～5，試驗設(shè)計如表2所示。

表2 星點設(shè)計的因素及水平Table 2 Factors and levels of star point design

1.3.4.2 模型擬合 將試驗所得數(shù)據(jù)采用Design Expert 8.0.6 軟件進行處理，以評價指標分別對各因素進行回歸分析和數(shù)學(xué)模型擬合，并繪制效應(yīng)面三維圖。

1.3.4.3 驗證試驗 采用效應(yīng)面優(yōu)化配方，以自乳化時間、透光率作為評價指標，通過比較試驗值與效應(yīng)面預(yù)測值之間的差異性進行驗證。

1.3.5 CSO-SNEDS 的理化特性表征

1.3.5.1 外觀及稀釋后的外觀 室溫下觀察最優(yōu)配方制得的CSO-SNEDS 的外觀。然后在溫和攪拌下，取1 mL 加入到100 mL 蒸餾水（37 ℃）中，進行分散性試驗以考察其自乳化情況。

1.3.5.2 液滴尺寸和ζ-電位 將優(yōu)化的CSOSNEDS 在恒定磁力低速攪拌下用蒸餾水（1∶100）稀釋。使用馬爾文粒度儀通過激光散射測定液滴尺寸、多分散性指數(shù)（Polydispersity index，PDI）和ζ-電位。測定3 次取平均值。

1.3.5.3 自乳化速率 取0.1 mL 最優(yōu)配方制得的CSO-SNEDS 加入到裝有10 mL 蒸餾水的樣品瓶中，在相同條件時，測定在不同溫度、轉(zhuǎn)速、稀釋倍數(shù)下的自乳化時間和體系透光率。

1.3.6 CSO-SNEDS 的體外釋放研究

1.3.6.1 反向透析法 人工胃液 （Simulated gastric fluid，SGF）、人工腸液 （Simulated intestinal fluid，SIF）根據(jù)2015 版《中國藥典》進行配制[12]。

分別移取180 mL 的SIF 于兩個錐形瓶中，每個錐形瓶中放入7 個裝有2 mL SIF 的透析袋，分別取2.40 g CSO 和同等CSO 含量的SNEDS 于錐形瓶中，并將其置于搖床（37 ℃恒溫）中，分別于0.5，1，1.5，2，4，6，8 h 從錐形瓶中取一個透析袋，取樣備用。

CSO-SNEDS 在SGF 中釋放考察，參照上法操作。

1.3.6.2 釋放液的測定 依據(jù)先前研究顯示[13]，甘油三酯是CSO 中的主要成分。本文采用試劑盒法測定透析袋釋放介質(zhì)中甘油三酯含量，取樣品2.5 μL 置于酶標板中，加250 μL 工作液，37 ℃孵育10 min 后，用全波長酶標儀測定吸光度，并進行數(shù)據(jù)分析。

根據(jù)公式計算甘油三酯累計釋放量：

式中：Mt——甘油三脂累計釋放量，mg；Q——甘油三酯累計釋放率，%；Ci——第i 次取樣時甘油三酯的釋放質(zhì)量濃度，mg/mL；V——第1次取樣前的體積，mL；Ci-1——i 時間取樣點的前一個取樣點時甘油三酯的質(zhì)量濃度，mg/mL；V樣——每次取樣對應(yīng)的體積，mL。

1.3.6.3 體外釋放動力學(xué)模型的擬合 參照文獻[13]，選用5 種釋放方程對甘油三酯累計釋放率進行曲線擬合，根據(jù)擬合優(yōu)度判斷體外釋放動力學(xué)類型。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Origin 2017 軟件進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 CSO 與不同SA、CoSA 的互溶情況

根據(jù)試驗結(jié)果，CSO 與SA 的互溶情況：Tween60>EL-35>EL-40>Tween40>Tween80>Tween20，CSO 與CoSA 的互溶情況：PEG400>丙三醇>丙二醇。

CSO 與Tween60、EL-35、EL-40、PEG400 和丙三醇均能很好的相溶，未出現(xiàn)分層或渾濁，因此，選用Tween60、EL-35、EL-40 作為SA，PEG400 和丙三醇作為CoSA 進行試驗。

2.2 配方篩選試驗結(jié)果

選取CSO 溶解度較好的3 種SA 和兩種CoSA 進行配方篩選試驗，試驗結(jié)果顯示PEG400/EL-35/CSO，丙三醇/EL-35/CSO 體系，Tween60/丙三醇/CSO 體系均可形成CSO-SNEDS，但載油量較低，以Tween60/丙三醇/CSO 體系最佳，載油量可達16%左右。

根據(jù)已有研究顯示，復(fù)合SA 相比于單一SA可形成更穩(wěn)定的復(fù)合凝聚膜，因此更易形成穩(wěn)定的自納米乳化體系[14]。因此本試驗采用復(fù)合SA（Tween60/Span80 或 Tween60/Span20）/丙三醇/CSO 體系進一步進行配方篩選。結(jié)果表明，僅Tween60/Span20/丙三醇/CSO 體系可形成CSOSNEDS，其中Tween60/Span20 質(zhì)量比=9：1。另外，如圖1所示，復(fù)合SA（Tween60/Span20）/丙三醇=8∶2～5∶5 時，自納米乳化體系均可形成，且當復(fù)合SA（Tween60/Span20）/丙三醇=8∶2 時，體系油相比例最高為18.60%，此時自乳化等級僅為B，因此該體系還需進一步優(yōu)化。

圖1 復(fù)合SA（Tween60/Span20）/丙三醇/CSO 體系偽三元相圖Fig.1 Pseudo-ternary phase diagram of complex surfactant （Tween60/Span20）/glycerol/CSO system

2.3 星點設(shè)計-效應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)選配方

2.3.1 模型擬合 采用表2進行星點設(shè)計試驗，其響應(yīng)值如表3所示。采用Design Expert 8.0.6軟件，對各因素分別進行多元線性、二項式擬合，結(jié)果顯示二次多項式為最佳方程（表4）。

表3 星點設(shè)計表與結(jié)果Table 3 Star design table and results

表4 各響應(yīng)值的回歸方程Table 4 Regression equation of each response value

回歸方差分析顯著性檢驗表明，Y1和Y2的回歸方程的P<0.0001，說明模型回歸顯著，失擬項不顯著（P>0.05），說明該模型具有統(tǒng)計學(xué)意義，即自乳化時間和透光率的非線性擬合效果較好，相關(guān)系數(shù)較高，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義，可用來進行CSO-SNEDS 的配方優(yōu)化。

2.3.2 效應(yīng)面分析 由圖2可知，當Km值一定時，隨著油相質(zhì)量分數(shù)的增加，自乳化時間延長，油相質(zhì)量分數(shù)在一定范圍內(nèi)時，透光率逐漸上升，當油相質(zhì)量分數(shù)較大時，透光率逐漸下降，不再呈現(xiàn)透明或半透明狀態(tài)。當油相的質(zhì)量分數(shù)一定時，自乳化時間隨Km的增加而增加，透光率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。

圖2 油相質(zhì)量分數(shù)、Km 值對自乳化時間及透光率影響的效應(yīng)面圖及等高線圖Fig.2 Effect surface diagram and contour diagram of oil phase mass fraction and Km value on self-emulsification time and light transmittance

2.3.3 效應(yīng)面估測及最佳驗證試驗 通過軟件的預(yù)測分析功能、擬合方程及其三維效應(yīng)面圖綜合分析，在試驗范圍內(nèi)以載油量（油相質(zhì)量分數(shù)）、自乳化時間和透光率為綜合考察指標，結(jié)合配方的初步篩選試驗，得到最佳配方：油相質(zhì)量分數(shù)為16.11%，Km=3.54，其中油相為薏苡仁油，復(fù)合SA為Tween60/Span20＝9∶1，CoSA 為丙三醇。根據(jù)最優(yōu)配方制備CSO-SNEDS，考察預(yù)測值與實測值的偏差，結(jié)果表明，自乳化時間及透光率與預(yù)測值之間沒有顯著差異，表明預(yù)測性良好。試驗結(jié)果見表5。

表5 驗證配方評價指標的預(yù)測值與試驗值（n=3）Table 5 Predictive value and experimental value of verified prescription evaluation index （n=3）

2.4 CSO-SNEDS 的理化特性

2.4.1 CSO-SNEDS 外觀及液滴尺寸 如圖3b所示，CSO-SNEDS 為淡黃色澄清透明體系，將其稀釋后可形成微泛藍光、澄清透明的乳液。另外，SNEDS 粒徑大小決定著CSO 溶出速率與溶出度，是影響其在體吸收和生物利用度的重要因素。如圖3a 所示，CSO-SNEDS 的平均粒徑為47.52 nm（＜100 nm），且呈正態(tài)分布，符合對納米乳的理想要求[15]。

圖3 CSO-SNEDS 的粒徑分布（A）及外觀（B）Fig.3 Particle size distribution （A） and appearance （B）of CSO-SNEDS

2.4.2 自乳化速率 由表6可知，轉(zhuǎn)速和溫度對自乳化時間的影響很大，對透光率影響較小，而稀釋倍數(shù)對自乳化時間的影響較小，對透光率影響較大。隨著轉(zhuǎn)速的增大，CSO-SNEDS 的自乳化時間減小，透光率增加。自乳化時間隨著溫度的升高明顯縮短，可能是由于溫度較高時，增加了各分子間的碰撞，從而降低油水界面間的界面能，有利于形成乳劑。

表6 自乳化速率體外評價Table 6 In vitro evaluation of self-emulsification efficiency

2.5 CSO-SNEDS 體外釋放及動力學(xué)

體外釋放度是評價納米制劑質(zhì)量的重要指標[16]，采用反向透析法對CSO 及其SNEDS 的體外釋放性進行評估。由圖4可知，SNEDS 顯著提高了CSO 在SIF 與SGF 中的累計釋放量，8 h 后分別為2.98 倍與9.54 倍。CSO 不易溶于人工消化液，多漂浮于表面，不利于甘油三酯的擴散，而CSOSNEDS 為粒徑較小的O/W 體系，其可于消化液中均勻分散并更大程度被釋放[17]，這可能是SNEDS提高CSO 體外釋放量的最主要原因。另外，CSO與CSO-SNEDS 在SIF 中的釋放量均高于SGF，這可能是由于弱酸性的CSO 更易溶解于堿性SIF 而引起的[18]。

圖4 CSO-SNEDS 在體外釋放模型中的釋放情況Fig.4 Release of CSO-SNEDS in vitro model

將CSO-SNEDS 在兩種人工消化液中的累計釋放率分別用5 種方程進行釋放動力學(xué)擬合[13]，擬合結(jié)果如表7所示。Ritger-Peppas 方程的擬合優(yōu)度更高，其在人工腸液與胃液中的釋放擬合系數(shù)分別為0.731 和0.912，可較好地描述CSO-SNEDS在消化液中的釋放規(guī)律。另外，對于Ritger-Peppas方程來說，n（釋放指數(shù)）是用來表征釋放機制的特征參數(shù)，如果0.450.89 時，為骨架溶蝕機制[20-21]。試驗結(jié)果表明，CSO-SNEDS 在人工胃液及腸液中的釋放指數(shù)n 均小于0.45，屬于Fick 擴散機制。

表7 CSO-SNEDS 在SGF 與SIF 中的體外釋放動力學(xué)擬合結(jié)果Table 7 Results of in vitro release kinetics of CSO-SNEDS in SGF and SIF

3 結(jié)論

本文以CSO 作為油相，通過配方篩選試驗及偽三元相圖的繪制結(jié)果，成功構(gòu)建了以Tween60/Span20/丙三醇/CSO 為體系的CSO-SNEDS。同時，使用星點設(shè)計-效應(yīng)面法，以透光率、自乳化時間為評價指標，通過模型效應(yīng)面圖及模型擬合確定了各組分比例，即油相質(zhì)量分數(shù)為16.11%，Km值為3.54，其中復(fù)合SA 為Tween60/Span20=9∶1，CoSA 為丙三醇。優(yōu)化所得CSO-SNEDS 載油量較高，外觀為黃色澄清液體，稀釋后穩(wěn)定性較好。體外釋放結(jié)果表明，SNEDS 中CSO 的體外釋放量顯著提升，其體外釋放動力學(xué)均符合Ritger-Peppas方程，且符合Fick 擴散機制。