響應(yīng)面法優(yōu)化厚樸花總酚浸提工藝

沈春紅，李金星，何越雯，葛苗苗，馬林，2*

（1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽(yáng)621010；2.四川省生物質(zhì)資源利用與改性工程技術(shù)研究中心，四川綿陽(yáng)621010）

厚樸(Magnolia officinalis Rehd.et Wils.)，木蘭科高大喬木，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其味苦溫，主中風(fēng)、傷寒、頭痛、寒熱[1]。歷代本草論述其主要以根皮、干皮及枝皮入藥，用于濕滯傷中、脘痞吐瀉、食積氣滯等[2]。厚樸樹皮的生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，一般要15年以上才符合藥用質(zhì)量要求[3]，這導(dǎo)致其使用效率受到限制，經(jīng)濟(jì)效益低下。近年來，為提高厚樸的資源利用率，探索厚樸新用途，不少學(xué)者已經(jīng)對(duì)厚樸籽、厚樸葉和厚樸花進(jìn)行研究，如厚樸籽優(yōu)良種源選育[4-5]；厚樸葉餐具墊片和其用作牲畜飼料、化妝品、植物殺菌劑以及食品包裝[6-7]；厚樸花化學(xué)成分研究[8-10]，這些研究拓展了厚樸新的消費(fèi)方式，使厚樸資源得到進(jìn)一步利用。

厚樸花是厚樸的非藥用部位，最早記載于1936年出版的《飲片新參》[11]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，厚樸花與厚樸皮有近似成分，如酚類、生物堿類[12]以及揮發(fā)油類[10]，且同樣具有抗炎、鎮(zhèn)咳、鎮(zhèn)痛以及促進(jìn)胃排空、推進(jìn)腸運(yùn)動(dòng)等藥理作用[13-16]。目前，僅有少量的厚樸花被用于臨床治療[17]和研制金屬納米材料[18]，大量的厚樸花任其自由凋落腐爛，造成了藥用資源的浪費(fèi)。查閱資料發(fā)現(xiàn)，厚樸花被列于2002年版可用于保健食品的物品名單，此外，在四川平武，松潘等地方也有用厚樸花泡茶飲用的習(xí)慣，但未見對(duì)其加工利用的研究。如今，已有研究者將具有降血脂和增強(qiáng)免疫力功能的杜仲雄花茶[19]和潤(rùn)肺止咳的枇杷花茶[20]等開發(fā)為特色植物飲品，深受消費(fèi)者喜愛。若能在科學(xué)研究的基礎(chǔ)上對(duì)厚樸花進(jìn)行提取加工，將產(chǎn)生重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。

酚類物質(zhì)作為厚樸皮中的主要有效成分，主要包括厚樸酚與和厚樸酚，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗腹瀉等多種生理功能[21-22]。因厚樸皮中酚類物質(zhì)含有烯丙基的聯(lián)苯二酚結(jié)構(gòu)，使其具有較強(qiáng)的抗氧化作用，這是厚樸中酚類物質(zhì)能發(fā)揮生物學(xué)功能的重要基礎(chǔ)[23]。厚樸花是厚樸的一部分，其主要有效成分與厚樸皮相近。本試驗(yàn)以厚樸花總酚含量為響應(yīng)值，通過單因素試驗(yàn)、篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì)（plackett-burman，PB）、最陡爬坡試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)，探索厚樸花最佳浸提工藝條件，為實(shí)現(xiàn)厚樸花保健茶的開發(fā)探索道路，也將有利于厚樸資源的綜合利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

厚樸（Magnolia officinalis）花：于2019年5月采自四川省松潘縣白羊鄉(xiāng)；福林酚、碳酸鈉（分析純）：成都科隆化學(xué)試劑有限公司。

JY2003電子天平：賽多利斯科儀器（北京）有限公司；DHG-9053A電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；UV-8000S紫外可見分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；DZKW-S-6電熱恒溫水浴鍋：北京市光明醫(yī)療儀器有限公司；SL-200型高速多功能粉碎機(jī)：浙江省永康市松青五金廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 單因素試驗(yàn)

固定厚樸花粉碎度為80目、提取溫度100℃、提取時(shí)間 10 min、提取 1 次，考察不同料液比 [1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70（g/mL）]對(duì)厚樸花總酚含量的影響，篩選出最佳料液比，然后將其作為最佳加條件固定，再分別考察提取時(shí)間（3、5、7、9、11、13、15min）、提取溫度（50、60、70、80、90、100 ℃）、提取次數(shù)（1、2、3）和粉碎度（20、40、60、80、100、120 目）。 其中，對(duì)于特定時(shí)間內(nèi)溫度的保持，采用水浴鍋保溫來實(shí)現(xiàn)。每次改變一個(gè)因素，考察完一個(gè)因素后，將其最佳條件作為下一個(gè)因素的固定條件，直至完成全部單因素試驗(yàn)。

1.2.2 篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì)（plackett-burman design，PB）

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Design Expert 10.0.7軟件進(jìn)行PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)料液比（A）、提取時(shí)間（B）、提取溫度（C）、粉碎度（D）進(jìn)行分析，采用4個(gè)因素和7個(gè)虛擬因素進(jìn)行N=12的設(shè)計(jì)組合，以總酚含量為響應(yīng)值，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 PB設(shè)計(jì)因素及水平Table 1 Plackett－burman design factor level

1.2.3 最陡爬坡試驗(yàn)

最陡爬坡試驗(yàn)是根據(jù)PB試驗(yàn)的結(jié)果，對(duì)篩選出的顯著因素進(jìn)行設(shè)計(jì)，根?據(jù)各因素的效應(yīng)大小和變化方向確定爬坡步長(zhǎng)和方向[24]。根據(jù)PB試驗(yàn)的結(jié)果，選擇對(duì)厚樸花總酚含量有顯著影響的因素作為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)開展試驗(yàn)，由此逼近最大響應(yīng)值區(qū)域。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)（Box-Behnken design，BBD）原理，在PB試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇料液比（X1）、提取溫度（X2）、粉碎度（X3）3 個(gè)因素，建立三因素三水平數(shù)學(xué)模型對(duì)厚樸花浸提工藝進(jìn)行優(yōu)化，其余因素條件固定為提取時(shí)間7 min，提取1次，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2。

表2 響應(yīng)面因素與水平Table 2 Response surface factors and horizontal table

1.2.5 總酚含量的測(cè)定

采用Folin-酚比色法[25]，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：Y=0.269 1X+0.057 9（R2=0.999 6）。取30 μL厚樸花浸提液加入10 mL的比色管中，加入5 mL 10%福林酚顯色劑，搖勻，8 min后加入4 mL 7.5%碳酸鈉，定容，混勻。靜置60 min后，在765 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度?？偡雍恳悦靠撕駱慊ú柚袥]食子酸含量計(jì)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有測(cè)定均重復(fù)3次，取平均值，用SPSS 22.0進(jìn)行顯著性分析，采用Origin 9.0繪圖；PB試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析采用Design Expert 10.0.7。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)厚樸花總酚含量釋放的影響

固定厚樸花粉碎度為80目、提取溫度100℃、提取時(shí)間10 min、提取1次，料液比對(duì)厚樸花總酚含量的影響見圖1。

圖1 料液比對(duì)厚樸花總酚含量的影響Fig.1 Effect of material liquid ratio on the total phenol content in Magnolia officinalis flower

由圖1可知，厚樸花總酚含量總體隨著溶劑的增加而增加，料液比超過1∶30（g/mL）時(shí)增長(zhǎng)速率變緩。溶劑添加量較小時(shí)，溶劑不足以完全提取出厚樸花粉末中的總酚，這在一定程度上降低了總酚的溶出率；而溶劑添加量過大時(shí)，由于傳質(zhì)阻力，過量的水不再起到提取總酚的作用，反而降低溶液的總酚濃度[26]。從節(jié)約成本的角度出發(fā)，考慮料液比1∶30（g/mL）為最佳。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)厚樸花總酚含量的影響

用料液比1∶30（g/mL）提取厚樸花茶，固定粉碎度為80目、提取溫度100℃浸提1次，提取時(shí)間對(duì)厚樸花總酚含量的影響見圖2。

由圖2可知，厚樸花總酚含量總體隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，在浸提時(shí)間為7 min時(shí)出現(xiàn)拐點(diǎn)（5.64%），9 min～15 min范圍內(nèi)又波動(dòng)上升。一般來說總酚含量隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，但在實(shí)際操作時(shí)，處于高溫條件下的時(shí)間越長(zhǎng)，總酚越易發(fā)生氧化聚合反應(yīng)，導(dǎo)致品質(zhì)下降[27]。因此在工業(yè)提取厚樸花時(shí)，應(yīng)對(duì)提取時(shí)間進(jìn)行合理的控制以得到高品質(zhì)的浸出物。故提取時(shí)間選擇7 min為宜。

圖2 提取時(shí)間對(duì)厚樸花總酚含量的影響Fig.2 Effect of extraction time on the total phenol content in Magnolia officinalis flower

2.1.3 提取溫度對(duì)厚樸花總酚含量釋放的影響

按照料液比 1∶30（g/mL）、粉碎度 80 目、提取時(shí)間7 min、對(duì)厚樸花進(jìn)行1次提取，提取溫度對(duì)厚樸花總酚含量的影響見圖3。

圖3 提取溫度對(duì)厚樸花茶總酚含量的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the total phenol content in Magnolia officinalis flower

由圖3可得，厚樸花總酚含量隨著提取溫度的升高而增加，在70℃～90℃之間增速最快，之后趨于穩(wěn)定，90℃與100℃無顯著性差異（P＜0.05）。這可能是由于較高的提取溫度有利于厚樸花茶中總酚向溶劑迅速擴(kuò)散，在90℃時(shí)植物總酚已基本溶出，再升高提取溫度，植物中酚類物質(zhì)發(fā)生氧化聚合更加明顯，其含量不再增加[28]。此外，繼續(xù)增高溫度會(huì)延長(zhǎng)升溫時(shí)間，消耗能源，造成成本增加，因此選擇提取溫度為90℃。

2.1.4 提取次數(shù)對(duì)厚樸花總酚含量釋放的影響

以料液比 1∶30（g/mL）、粉碎度 80 目、90 ℃溫度對(duì)厚樸花提取7 min，提取次數(shù)對(duì)厚樸花總酚含量的影響見圖4。

圖4 提取次數(shù)對(duì)厚樸花茶總酚含量的影響Fig.4 Effect of extraction times on the total phenol content in Magnolia officinalis flower

由圖4可知，隨著提取次數(shù)的增加，厚樸花總酚含量不斷降低。本試驗(yàn)中提取2次與提取1次出現(xiàn)顯著差異（P＜0.05），多次提取將增加功率的消耗，從節(jié)能角度考慮本試驗(yàn)選擇浸提1次。

2.1.5 粉碎度對(duì)厚樸花總酚含量釋放的影響

對(duì)厚樸花茶進(jìn)行1次提取，固定料液比1∶30（g/mL）、提取溫度90℃提取7 min，粉碎度對(duì)厚樸花總酚含量的影響見圖5。

圖5 粉碎度對(duì)厚樸花總酚含量的影響Fig.5 Effect of raw material particle size on the total phenol content in Magnolia officinalis flower

由圖5可知，總酚含量隨著厚樸花粉碎度的增大而增大，80 目時(shí)達(dá)到最高值（5.68%），但 60、80、100、120目之間總酚含量沒有顯著差異（P＜0.05）。對(duì)水溶性成分而言，原料顆粒越小，其與水的接觸面積越大，水溶出物越多。粉碎度為20目～40目時(shí)，原料顆粒較大，厚樸花粉末與水的接觸面積小，導(dǎo)致總酚不能完全溶出；隨著粉碎度增加到100目～120目時(shí)，原料顆粒間的吸附作用增強(qiáng)，總酚含量不再增加，且粉碎功率消耗變大，成本提高，此外，粉末易懸浮于水中使溶液渾濁，因此選擇粉碎度為60目。

2.2 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

PB試驗(yàn)可以有效地篩選出影響厚樸花總酚溶出率的關(guān)鍵因素，其設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3。各因素的PB試驗(yàn)結(jié)果回歸分析見表4。

表3 PB設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Plackett-burman design and results

表4 PB試驗(yàn)結(jié)果回歸分析Table 4 Regression analysis of plackett-burman experimental results

由表4可知，此回歸模型的P值為0.004 6，小于0.01，表明回歸模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)決定系數(shù)R2=0.992 0，調(diào)整決定系數(shù)為0.970 8，說明模型設(shè)計(jì)可靠。此外，各因素的P值表明，各因素對(duì)厚樸花總酚含量的影響水平為粉碎度＞提取溫度＞料液比＞提取時(shí)間，其中粉碎度、料液比和提取溫度達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。相關(guān)性方程為：總酚含量/%=-1.269 77+0.032 883A+0.091 603B+0.034 567C+0.027 909D+0.136 42F-0.102 52H-0.200 53J-0.278 70L。

由方程可知，粉碎度、料液比、提取溫度和提取時(shí)間4個(gè)因素均為正效應(yīng)。根據(jù)各因素影響水平選擇粉碎度、料液比和提取溫度3個(gè)因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，提取時(shí)間和提取次數(shù)選擇單因素試驗(yàn)的最佳條件。

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

由PB試驗(yàn)得出粉碎度、料液比和提取溫度均為正效應(yīng)，由此確定爬坡方向和合理步長(zhǎng)。最陡爬坡試驗(yàn)中X1料液比、X2提取溫度和X3粉碎度對(duì)厚樸花總酚含量的影響見表5。

由表5可知，試驗(yàn)3組厚樸花的總酚含量最高，故選擇試驗(yàn)組3作為Box-Behnken試驗(yàn)的中心值，并以2組和4組試驗(yàn)條件為邊界，優(yōu)化下一步的響應(yīng)面試驗(yàn)。

表5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Test design and results of steepest climb

2.4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及方差分析

在PB試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)的基礎(chǔ)上利用Design Expert 10.0.7軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到試驗(yàn)結(jié)果見表6，方差分析見表7。

表6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Box-Behnken design and results

表7 回歸模型方差分析Table 7 Analysis of variance of regression model

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到變量（料液比X1、提取溫度X2、粉碎度X3）與響應(yīng)值厚樸花總酚含量之間的回歸模型方程：厚樸花總酚含量/%=-118.71406-0.067 588X1+2.702 69X2-2.921 71×10-3X3+6.143 37×10-3X1X2+1.180 94×10-3X1X3+1.124 32×10-3X2X3-8.580 66×10-3X12-0.016 232X22-6.868 35×10-4X32。

由表7可知，模型P值小于0.001，模型極顯著，失擬項(xiàng)P值為0.179 2，無顯著性差異，R2=0.967 8，表明模型對(duì)本試驗(yàn)擬合程度良好，R2Adj=0.926 4，表明該模型能解釋92.64%響應(yīng)值的變化，模型變異系數(shù)C.V=2.62%＜10%，進(jìn)一步說明該模型較為穩(wěn)定，重復(fù)性好，因此可用該回歸方程對(duì)不同提取工藝條件下厚樸花總酚含量進(jìn)行分析預(yù)測(cè)。影響厚樸花總酚含量的因素順序?yàn)榉鬯槎龋╔3）＞料液比（X1）＞提取溫度（X2）。 回歸模型中二次項(xiàng)X12和 X32顯著（P＜0.05），X22極顯著（P＜0.01），而一次項(xiàng) X1X2、X1X3和 X2X3均不顯著（P＞0.05），表明不同提取條件對(duì)厚樸花總酚含量的影響不同。

對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到各因素交互作用對(duì)厚樸花總酚含量影響響應(yīng)面圖，見圖6。

從圖6可知兩兩因素之間交互作用的響應(yīng)面圖都較為平緩，表明各因素之間的交互作用不顯著；總酚含量與料液比的曲線較提取溫度與總酚含量的曲線陡，說明料液比對(duì)厚樸花總酚含量的影響較提取溫度高；粉碎度與總酚含量的曲線較料液比陡，說明粉碎度對(duì)厚樸花總酚含量的影響大于料液比；同理可得，粉碎度對(duì)厚樸花總酚含量的影響大于提取溫度，與方差分析結(jié)果相符。

圖6 各因素交互作用對(duì)厚樸花總酚含量影響的響應(yīng)面與等高線Fig.6 Contour plots and response surface diagram showing the interaction effect of various factors on the Magnolia officinalis flower

2.5 最佳提取條件的確定與驗(yàn)證試驗(yàn)

通過Design Expert 10.0.7軟件分析得出厚樸花總酚含量最高的工藝條件：料液比 1∶30.78（g/mL）、提取溫度94.22℃、粉碎度98.67目、提取時(shí)間7 min、提取次數(shù)1次，在此條件下，預(yù)測(cè)的總酚含量為6.50%?？紤]到實(shí)際操作的可行性，將理論工藝條件調(diào)整為料液比 1∶30（g/mL）、提取溫度 94 ℃、粉碎度 100 目、提取時(shí)間7 min、提取1次，平行試驗(yàn)3次，得到厚樸花總酚含量為6.42%，與模型預(yù)測(cè)結(jié)果相近，表明此模型用于預(yù)測(cè)厚樸花的浸提工藝條件具有較高可靠性。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以厚樸花總酚含量為響應(yīng)值，通過單因素試驗(yàn)、PB試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)確定了厚樸花最優(yōu)水提工藝條件為料液比1∶30（g/mL）、提取溫度94℃、粉碎度100目、提取時(shí)間7 min、提取1次，此時(shí)的總酚含量為6.42%。較高的粉碎度有利于顆粒中總酚的溶出，提取溫度越高，溶劑中總酚含量溶出越多，但提取時(shí)間不宜過長(zhǎng)，以7 min為佳。研究還發(fā)現(xiàn)，隨著提取次數(shù)的增加，溶劑中的總酚含量下降顯著，表明此厚樸花沒有多次提取的必要。本研究提供了厚樸花的最佳水提工藝，為厚樸花保健茶的研發(fā)提供了技術(shù)參考，豐富了厚樸花的消費(fèi)形式，提高了厚樸副產(chǎn)物的附加值。