禽類中沙門氏菌MLST分型及毒力基因篩查

張捷，暢曉暉，柳明，李小林，萬曉楠，槐碩，趙琢*

（1.中國海關(guān)科學技術(shù)研究中心，北京100026;2.出入境食品安全檢測北京市重點實驗室，北京100026；3.天津海關(guān)工業(yè)產(chǎn)品安全技術(shù)中心，天津300308）

根據(jù)世界衛(wèi)生組織的估計，全球每年大約有10億人發(fā)生食源性疾病，其中由食源性致病菌引起的食品安全事件，造成全球每年約349億美元的經(jīng)濟損失。沙門氏菌病是歐盟繼彎曲桿菌病之后第二種常見的食源性疾病，是食源性疾病暴發(fā)的重要原因[1-2]。

傳統(tǒng)的沙門氏菌檢測分型，多采用血清學分型，而定量檢測無法準確分析其主要基因型及變化情況，難以滿足實際的預(yù)防檢測要求。全基因組測序（whole genome sequencing，WGS）是一種新興的分子流行病學工具[3-4]。最近的研究表明，致病菌分型可以使用WGS積累的大量DNA序列數(shù)據(jù)區(qū)分非常密切相關(guān)的分離株，遠遠超過脈沖場凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）和多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分型（multiple locus variable-number tandem repeat analysis，MLVA）[3]。 此外，WGS可以識別分離株組之間特定分子的差異，從而可以鑒定系統(tǒng)發(fā)育樹上的特征，以顯示菌群之間的進化關(guān)系。本研究采用快速的全基因組測序分型和多位點序列測定分型（multilocus sequence typing，MLST）方法。該方法可直接進行沙門氏菌主要基因型的檢測，縮短了沙門氏菌基因型的排查時間。經(jīng)過軟件分析可對其親緣關(guān)系進行分析鑒定，是一種適用性較強的檢測方法。本研究對前期分離鑒定的36株沙門氏菌進行全基因組測序、MLST分型及毒力基因篩查，比較不同來源沙門氏菌的基因型及毒力基因分布情況，從而為食源性致病菌沙門氏菌的風險識別和溯源提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

36株不同來源的沙門氏菌由中國海關(guān)科學技術(shù)研究中心分離、鑒定保存；參考菌株：腸炎沙門氏菌ATCC9184、傷寒沙門氏菌ATCC50071（美國ATCC菌種保藏中心）均由中國海關(guān)科學技術(shù)研究中心保存。

1.2 試劑

亞硒酸鹽胱氨酸（selenite cystine broth，SC）增菌液、木糖賴氨酸脫氧膽鹽（xylose lysine desoxycholate，XLD）瓊脂：賽默飛世爾科技公司；顯色培養(yǎng)基：上海欣中生物工程有限公司；DNA提取試劑盒：寶生物工程有限公司。

1.3 DNA完整性檢測

把38個提取好的DNA樣品放在冰上融化后，吹打混勻離心待檢測。采用瓊脂糖凝膠電泳（膠濃度1%、電壓150 V、電泳時間40 min）檢測樣品的完整性，用于構(gòu)建DNA文庫。

1.4 全基因組測序

細菌基因組de novo測序。采用illumina平臺對36株沙門氏菌進行測序。用檢測合格的樣品構(gòu)建文庫，最后用合格的文庫進行集群cluster制備和測序。

1.5 MLST分型

根據(jù)全基因組測序結(jié)果分析7個管家基因（aroC、dnaN、hemD、hisD、purE、suc A、thrA），每株菌的 7 個位點組合獲得一個ST型。然后通過Eburst（http：//eburst.mlst.net）對沙門氏菌分離株進行親緣關(guān)系分析。

1.6 沙門氏菌毒力基因篩查

采用毒力因子數(shù)據(jù)庫（virulence factors database，VFDB）對毒力島（Salmonella pathogenicity islands，SPI）基因包括 sopE、sptB、sseA/B/C/D、mgtC、sopB、sopD、soxR等基因及侵襲基因invA/invF、細胞致死膨脹素基因cdtB、毒力基因spvB等進行分析。

1.7 沙門氏菌聚類分析及數(shù)據(jù)處理

基于全基因組序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。系統(tǒng)發(fā)生樹（phylogenetic tree）是表明被認為具有共同祖先的各物種相互間演化關(guān)系的樹。它用來表示系統(tǒng)發(fā)生研究的結(jié)果，用它描述物種之間的進化關(guān)系。基于SNP結(jié)果進行進化分析并構(gòu)建最大似然法進化樹。采用MEGA7.0軟件制作系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA完整性檢測

樣品前處理：將提取好的36個菌株的DNA樣品在冰上融化后，充分混勻并離心，取適量樣品進行檢測。檢測參數(shù)：膠濃度1%；電泳150 V；電泳時間40 min。圖1為電泳檢測圖譜（以1號～16號菌株DNA樣品為例）。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳圖譜檢測DNAFig.1 Detection of DNA by agarose gel electrophoresis

采用DNA Marker作對照，確定樣品的相對分子量。DNA如果降解或者混有其它雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、RNA，則可以通過電泳檢測。36個DNA樣品的完整性使用瓊脂糖凝膠電泳法檢測，所有檢測條帶均位于同一位置23 130 bp。因此，所有DNA樣品均合格，并可用于構(gòu)建DNA文庫。

2.2 沙門氏菌MLST分型結(jié)果

36株沙門氏菌MLST分型結(jié)果見表1。

由表1可知，共獲得11個ST型，其中獲得優(yōu)勢的ST型為ST11，有17株占47.2%，其次為ST19，有8株占22.2%。其中ST11與ST78標準菌株的7個管家基因中，5個基因完全相同，親緣關(guān)系較近，均為腸炎沙門氏菌；ST19與ST34的7個管家基因中，5個基因完全相同，親緣關(guān)系較近，均為鼠傷寒沙門氏菌。

表1 36株沙門氏菌MLST分型結(jié)果Table 1 36 strains of Salmonella MLST typing results

2.3 毒力基因分析

基于全基因組測序結(jié)果，采用毒力因子數(shù)據(jù)庫對毒力島（Salmonella pathogenicity islands，SPI）基因包括sopE、sptB、sseA/B/C/D、mgtC、sopB、sopD、soxR、侵襲基因invA/invF、細胞致死膨脹素基因cdtB、毒力基因spvB等進行分析見表2。

表2 36株沙門氏菌毒力基因分析Table 2 Analysis of virulence genes of 36 strains of Salmonella 株

將36株沙門氏菌進行全基因組重測序，選用VFDB數(shù)據(jù)庫對菌株毒力島（Salmonella pathogenicity islands，SPI）SPI-1、SPI-2、 SPI-3、 SPI-4、SPI-5 進行分析，發(fā)現(xiàn)除sopE、sopE2外其余致病島基因均為保守基因。 88.2%（15/17）腸炎沙門氏菌攜帶sopE，69.2%（9/13）鼠傷寒氏菌攜帶sopE。腸炎沙門氏菌中88.2%（15/17）的菌株攜帶sopE2，鼠傷寒沙門氏菌中92.3%（12/13）的菌株攜帶sopE2。研究表明沙門氏菌的致病性與毒力基因相關(guān)，包括菌毛黏附類因子、調(diào)節(jié)因子、毒力島、質(zhì)粒上的毒性基因、毒素等[5-6]。感染初期沙門氏菌入侵腸上皮細胞是由毒力島SPI-1控制的。SPI-2Ⅲ型分泌系統(tǒng)編碼sseL使細菌在體內(nèi)持續(xù)慢性感染，它通過阻止宿主細胞中的免疫細胞遷移，減弱宿主清除細菌的能力[7-9]。 SPI-3的基因mgtC與宿主吞噬細胞的毒力相關(guān)[10]。除了染色體上的毒力基因，毒力質(zhì)粒上的代表基因主要是spvB和pefA[4，11]。prot6E一般位于腸炎沙門氏菌質(zhì)粒中，pefA可促進細菌吸附于腸上皮細胞，與菌毛形成有關(guān)[12-15]。

本研究中36株沙門氏菌均攜帶有SPI1～SPI5代表性基因和調(diào)節(jié)基因，它們是沙門氏菌具有高致病力的分子基礎(chǔ)。該菌重要的致病因子鞭毛蛋白由fliC或fliB編碼，可引起強烈的免疫應(yīng)答。hisH為組氨酸轉(zhuǎn)運基底結(jié)合蛋白，可使組氨酸降解成氨，影響組氨酸的合成。36株沙門菌株中，66.7%（24/36）菌株含有毒性質(zhì)粒spvB基因。腸炎沙門氏菌攜帶spvB高達82.4%（14/17）、鼠傷寒沙門氏菌攜帶spvB的菌株占76.9%（10/13）。本次分離到的胥伐成格隆沙門菌為多克隆ST241型，占5.56%（2/36）。胥伐成格隆沙門菌與腸炎沙門氏菌明顯不同，兩株胥伐成格隆沙門菌均未攜帶質(zhì)粒毒力基因spvB、pefA、prot6E，反映出基因型差別對攜帶毒力基因的影響。在我國胥伐成格隆沙門菌攜帶毒力基因的研究比較少見。有些毒力因子可以直接產(chǎn)生毒素，如細胞致死膨脹毒素（cytolethal distending toxin B，CdtB）。 百日咳類毒素（pertussis-like toxins，PltA）在胥伐成格隆沙門氏菌中普遍存在。CdtB、PltA經(jīng)NCBI Blast比對，與傷寒沙門氏菌的相應(yīng)基因（S.typhi CT18）DNA相似性達97%以上。

2.4 沙門氏菌分離株聚類分析

采用全基因組測序分型方法對36株沙門氏菌分離株進行聚類分析，將所有菌株的基因組序列與參考菌株基因組序列進行比對分析，獲得單核苷酸多態(tài)性包括3 005個基因為核心基因，共聚成9類。沙門氏菌分離株聚類分析圖見圖2。

圖2 沙門氏菌分離株聚類分析圖Fig.2 Cluster analysis of Salmonella isolates

腸炎沙門氏菌檢測率較多的樣品主要集中在禽肉、豬肉和牛肉。本研究中腸炎沙門氏菌均來源于禽肉包括雞源、鴨源。由圖2可知，腸炎沙門氏菌聚在一類，包括菌株 1、4、5、6、12、13、22、28 等。鼠傷寒沙門氏菌聚在一類，包括 3、7、8、23、25、33、31、35。菌株 2、27號聚在一起，均為胥伐成格隆沙門氏菌。通過聚類圖分析，全基因組分型將沙門氏菌分成9簇，相同的血清型可能分在同一個簇。如2株胥伐成格隆沙門菌，基因型具有高度的相似性。10株鼠傷寒沙門氏菌分在不同的2個簇里，可能是由于不同品種肉類（雞源、鴨源）的沙門氏菌在進化上產(chǎn)生了變異。2株胥伐成格隆沙門氏菌聚在一起，均從雞大胸中分離產(chǎn)生。

3 討論與結(jié)論

通過對2017年北京地區(qū)禽類中分離的36株沙門氏菌進行分型研究，發(fā)現(xiàn)不同來源菌株的毒力、耐藥、致病性等方面均有存在差異，進一步揭示沙門氏菌的分布特征。采用MLST分型法，獲得11個ST型，其中雞源ST11腸炎沙門氏菌為優(yōu)勢菌株；鴨源ST19鼠傷寒沙門氏菌為優(yōu)勢菌株。印第安納沙門氏菌為ST17型、胥伐成格隆沙門菌為ST241型。同時通過全基因組測序發(fā)現(xiàn)幾株國內(nèi)未報道過的沙門氏菌，MLST分型分別是 ST1941、ST2441、ST1546。

非傷寒沙門菌（non-typhoid Salmonella，NTS）中，腸炎血清型和鼠傷寒血清型引起的感染和暴發(fā)最為常見，胥伐成格隆血清型原本很少見，但近些年來很多國家發(fā)現(xiàn)該血清型在臨床患者和食源性動物中的分離率明顯上升。細胞致死膨脹毒素亦出現(xiàn)在此非傷寒沙門菌血清型。在沙門氏菌中，cdtB、pltA、pltB基因編碼組成細胞膨脹毒素。國內(nèi)外研究表明細胞致死膨脹毒素CdtA和CdtC在部分沙門氏菌亞種中會缺失，百日咳類毒素PltA和PltB將代替其發(fā)揮作用[16-18]。本研究發(fā)現(xiàn)cdtB、pltA基因在2株胥伐成格隆沙門氏菌中均為陽性，因此推測在胥伐成格隆沙門氏菌普遍攜帶細胞致死膨脹毒素。本次分離到的胥伐成格隆沙門氏菌均為多克隆ST241型，與劉曉霞等從腸道腹瀉病人標本中分離的16株胥伐成格隆沙門菌MLST分型一致[19]。但均未攜帶質(zhì)粒毒力基因spvB、pefA、prot6B?？梢婑惴コ筛衤∩抽T菌基因型與鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌明顯不同，反映出基因型差別對攜帶毒力基因的影響。在非傷寒沙門氏菌中，近年來數(shù)據(jù)顯示該血清型已經(jīng)在許多國家成為引起食源性疾病的主要病原菌之一[20]，結(jié)合前期耐藥性試驗結(jié)果，該血清型具有多重耐藥性。

綜上所述，通過對36株沙門氏菌進行全基因組測序、MLST分型及毒力基因篩查，比較不同來源菌株的基因型及毒力基因分布情況，需要警惕多重耐藥胥伐成格隆沙門菌等對禽肉制品的感染，該菌在我國具有潛在的上升趨勢和被低估的可能。進一步推測胥伐成格隆沙門氏菌可能在全球范圍內(nèi)傳播，提示相關(guān)部門需加強進口禽肉制品的監(jiān)控力度。考慮本研究涉及的區(qū)域較小、時間尚短，因此建議在我國更大范圍內(nèi)持續(xù)開展相關(guān)監(jiān)測和研究，為我國禽類致病性沙門氏菌的防治提供了一定的理論基礎(chǔ)和科學依據(jù)。