宣恩火腿加工過程中蛋白質(zhì)相互作用力變化

范露，郭官清，付宜萍，周辰，周利娟，許云峰，邱朝坤

（武漢設(shè)計工程學(xué)院食品與生物科技學(xué)院，湖北武漢430205）

宣恩火腿是我國湖北省恩施自治州一帶特產(chǎn)，以宣恩縣所產(chǎn)火腿最負盛名，其肉質(zhì)細嫩、皮黃脂白肉紅、氣味鮮香宜人、滋味濃郁，在乾隆時期就作為貢品進貢朝廷，被譽為“中國四大名腿”之一[1]。

宣恩火腿要歷經(jīng)十個月以上的加工周期，在此期間，腌制、烘腿、發(fā)酵等關(guān)鍵工序都會影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和相互作用力，對宣恩火腿風(fēng)味和質(zhì)地形成產(chǎn)生一定的影響。已有研究表明，蛋白質(zhì)分子在展開過程中原來掩埋于蛋白內(nèi)部的疏水基團會暴露于蛋白表面并與風(fēng)味化合物發(fā)生共價結(jié)合[2]，蛋白分子的疏水區(qū)域和巰基具有吸附性，可以增強蛋白質(zhì)對風(fēng)味的吸附能力[3]，而二硫鍵能夠提高蛋白質(zhì)被外界破壞作用的抵抗力，保護蛋白質(zhì)免受快速水解的破壞[4]。

近年來關(guān)于豬肉及其制品蛋白質(zhì)化學(xué)作用力的相關(guān)研究主要集中在原料肉[5-7]、西式蒸煮火腿[8-9]等，對干腌豬肉火腿以金華火腿為主[10]，對宣恩火腿的研究鮮有報道。本課題對宣恩火腿加工過程中不同階段樣品蛋白質(zhì)相互作用力變化進行測定，為探究宣恩火腿風(fēng)味和質(zhì)地的形成機理研究提供理論支撐，從而為宣恩火腿的現(xiàn)代化生產(chǎn)加工技術(shù)提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

火腿由湖北省思樂牧業(yè)集團有限公司提供，每個階段采集3支火腿，取股二頭肌用料理機攪碎后置于-18℃?zhèn)溆茫楸苊庵纠^續(xù)氧化，一個月內(nèi)完成所有指標測定）。宣恩火腿簡要工藝流程[11]：選腿→修胚→腌制→洗腿→整形→烘腿→入庫發(fā)酵→洗霉→修割→驗收。

本課題研究5個階段的樣品分別為原料腿、腌制期、發(fā)酵初期、發(fā)酵中期和成品腿，原料腿指用于生產(chǎn)制作宣恩火腿的新鮮豬腿（恩施本地黑豬），腌制期指腌制1個月的豬腿（用鹽量為每10 kg豬腿用鹽1 kg，分6～7次上鹽），發(fā)酵初期指發(fā)酵1個月的豬腿，發(fā)酵中期指發(fā)酵4個月的豬腿，成品腿指發(fā)酵7個月后經(jīng)洗霉修割的豬腿。

氯化鈉、尿素、β-巰基乙醇、氫氧化鈉、硫酸銅、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、溴酚藍、2，4-二硝基苯肼（2，4-dinitrophenylhydrazine，DNPH）、三氯乙酸、乙醇、乙酸乙酯、鹽酸胍、5，5＇二硫代雙（2-硝基苯甲酸)[5，5'-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid)，DTNB]（以上均為分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；鹽酸（分析純）：平煤神馬集團開封東大化工有限公司試劑廠。

FE20型pH計：瑞士Metteler toledo公司；UV2000型分光光度計：美國Unico公司；AL-104型分析天平：瑞士Metteler Toledo公司；Neofuge 18R型高速冷凍離心機：香港Heal Force公司；XH-C型漩渦混合器：金壇市醫(yī)療儀器廠；THZ-82型水浴恒溫振蕩器：常州國華電器有限公司；FJ-200高速均質(zhì)分散機：上海標本模型廠。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質(zhì)作用力的測定

參照 Gómez-Guillén 等[12]的方法稍加修改，稱取2.00g均勻的樣品于50mL離心管中，分別加入20 mL S1（0.05 mol/L NaCl）、S2（0.6 mol/L NaCl）、S3（0.6 mol/L NaCl＋1.5 mol/L 尿素）、S4（0.6 mol/L NaCl＋8 mol/L 尿素）、S5（0.6 mol/L NaCl＋8 mol/L尿素＋1.5 mol/L β-巰基乙醇）溶液，于10 000 r/min均質(zhì)1 min，將離心管置于4℃下靜置2 h，用雙縮脲法測定上清液中蛋白質(zhì)含量。S2與S1上清液中蛋白質(zhì)含量之差表示離子鍵相對含量，S3與S2上清液中蛋白質(zhì)含量之差表示氫鍵相對含量，S4與S3上清液中蛋白質(zhì)含量之差表示疏水相互作用力大小，S5與S4上清液中蛋白質(zhì)含量之差表示二硫鍵相對含量。各作用力的含量與上述4種蛋白質(zhì)作用力含量之和的比值為該作用力的相對含量。每個樣品平行測定3次。

1.2.2 肌原纖維蛋白的提取

稱取10.00 g均勻的樣品，加入100 mL含15.6mmol/L Na2HPO4和3.5 mmol/L KH2PO4（pH7.5）溶液后勻漿，于4℃10 000 r/min下離心15 min，棄去上清液，沉淀用10倍體積含0.5 mol/L氯化鉀、15.6 mmol/L磷酸氫二鈉和3.5 mmol/L磷酸二氫鉀（pH7.5）溶液溶解，于4℃10 000 r/min下離心15 min，上清液即為肌原纖維蛋白提取液。

1.2.3 肌原纖維蛋白表面疏水性的測定

用肌原纖維蛋白與溴酚藍的結(jié)合量表征肌原纖維蛋白的表面疏水性，其測定方法參照Chelh等[13]的方法稍加修改，用0.1 mmol/L的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液（pH7.5）將5個階段的火腿肌原纖維蛋白濃度調(diào)整為5mg/mL。取1 mL該溶液，加入200μL 1 mg/mL溴酚藍溶液，渦旋振蕩混勻1 min，5 000 r/min下離心15 min，于595 nm處測定上清液吸光值。另取1 mL磷酸鹽緩沖液做空白對照組，每個樣品平行測定3次。表面疏水性按下列公式進行計算。

式中：200 為溴酚藍質(zhì)量，μg；OD對照組為空白對照組的吸光值；OD樣品組為樣品組的吸光值。

1.2.4 肌原纖維蛋白羰基值的測定

參照Oliver等[14]的方法稍加修改，用0.1 mmol/L的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液（pH7.5）將5個階段的火腿肌原纖維蛋白濃度調(diào)整為2 mg/mL。取1 mL該溶液，加入1 mL 10 mmol/L DNPH溶液，空白組加入1 mL 2 mmol/L鹽酸溶液，于37℃水浴保溫1 h（期間每隔15 min漩渦混勻1次），加1 mL 30%三氯乙酸溶液，渦旋振蕩混勻30 s，冰浴保溫10 min，4 500 r/min離心15 min，沉淀用1 mL乙醇-乙酸乙酯（1:1，體積比）洗滌3次，靜置10 min，棄去上清液，沉淀用3 mL 6 mmol/L鹽酸胍溶液溶解，37℃水浴保溫30 min，4 500 r/min離心15 min，于370 nm處測定上清液吸光值，每個樣品平行測定3次。羰基值按下列公式進行計算。

式中：A為吸光值；3為反應(yīng)液終體積，mL；1 000為單位換算系數(shù)；21為摩爾吸收系數(shù)，L/（mmol·cm）；1為比色皿光程，cm；2為樣品中蛋白質(zhì)質(zhì)量，mg。

1.2.5 肌原纖維蛋白巰基和二硫鍵的測定

參照Yongsawatdigul等[15]的方法稍加修改，用0.1 mmol/L的 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液（pH7.5）將5個階段的火腿肌原纖維蛋白濃度調(diào)整為2 mg/mL。取1mL該溶液，加入8mL50mmol/L磷酸緩沖液A（8mol/L尿素、0.6 mol/L NaCl、10 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，pH7.5），再加入1.0 mL 0.1%DTNB溶液，40℃水浴保溫30 min，于412 nm處測定溶液吸光值，每個樣品平行測定3次。巰基含量按下列公式進行計算。

式中：A為吸光值；10為反應(yīng)液終體積，mL；1 000為單位換算系數(shù)；13.6為摩爾吸收系數(shù)，L/（mmol·cm）；1為比色皿光程，cm；2為樣品中蛋白質(zhì)質(zhì)量，mg。

活性巰基的測定用緩沖液B（0.1 mmol/LNa2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液、0.6 mol/L NaCl、10 mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉，pH7.5）替換緩沖液A，混合液在4℃水浴保溫1 h后，于412 nm處測定溶液吸光值，每個樣品平行測定3次。二硫鍵含量為巰基含量與活性巰基含量之差，每個樣品平行測定3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗和測量均為3份，結(jié)果記錄為平均值和標準偏差。使用IBM SPSS Statistics 23對數(shù)據(jù)進行ANOVA差異顯著性分析，P＜0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 宣恩火腿加工過程中蛋白質(zhì)相互作用力變化

宣恩火腿在不同加工階段，維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的主要化學(xué)作用力相對含量見表1。

表1 宣恩火腿不同階段各蛋白質(zhì)作用力相對含量變化Table 1 Changes of relative content of protein interaction in different stages of Xuanen ham

從表1中可以看出，在宣恩火腿整個加工階段，離子鍵和氫鍵相對含量持續(xù)下降，尤其是在腌制期內(nèi)，這種變化幅度更大，這可能與鹽分的大量滲入導(dǎo)致細胞內(nèi)汁液和細胞間水分的流失有關(guān)。疏水相互作用和二硫鍵的相對含量則持續(xù)增加，且在發(fā)酵期內(nèi)這種增幅更明顯，這可能與此階段蛋白質(zhì)的降解、氧化等化學(xué)變化有關(guān)，蛋白質(zhì)部分變性導(dǎo)致一些側(cè)鏈暴露出更多的疏水性氨基酸，其中一些巰基發(fā)生了一定程度的氧化形成了二硫鍵。

在原料期，穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的化學(xué)作用力依次為疏水相互作用＞離子鍵＞氫鍵＞二硫鍵，且以疏水相互作用力（38.4%）和離子鍵為主（相對含量31.5%），這與其他學(xué)者的結(jié)果基本一致[16]。隨著加工的進行，受到加工條件和環(huán)境條件的變化，肌肉蛋白質(zhì)發(fā)生了一系列的變化，維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的化學(xué)作用力也隨之改變，對成品火腿而言，維持起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用力以疏水相互作用力（49.7%）和二硫鍵（相對含量28.3%）為主。

2.2 宣恩火腿加工過程中肌原纖維蛋白表面疏水性變化

肌原纖維蛋白占到蛋白質(zhì)總量的55%左右，它不僅在肌肉收縮中起重要作用，在肉制品加工過程中，與蛋白質(zhì)的功能特性如凝膠特性、乳化特性等緊密相關(guān)，對肉制品的感官品質(zhì)產(chǎn)生重要影響[7]。

蛋白質(zhì)表面疏水性主要體現(xiàn)的是蛋白質(zhì)表面疏水性氨基酸殘基分布的情況，它是體現(xiàn)蛋白質(zhì)功能特性的重要指標之一[17]，與氨基酸間的疏水相互作用及氧化有關(guān)[18]。常用溴酚藍結(jié)合量表征蛋白質(zhì)的表面疏水性，宣恩火腿在不同加工階段肌原纖維蛋白溴酚藍結(jié)合量變化見圖1。

圖1 宣恩火腿加工過程中肌原纖維蛋白溴酚藍結(jié)合量變化Fig.1 Changes of the bromophenol blue binding amount of myofibrillar proteins in different stages of Xuanen ham

從圖1可以看出，從原料腿到成品腿，肌原纖維蛋白溴酚藍結(jié)合量顯著性上升（P＜0.05），從9.09 μg增加到38.7 μg。在火腿整個加工階段，從原料期到腌制期，肌原纖維蛋白溴酚藍結(jié)合量從9.09 μg上升到13.3 μg，與廣式臘腸腌制期內(nèi)肌原纖維蛋白表面疏水性變化趨勢一致[19]，主要原因是鹽分的大量進入導(dǎo)致其含量的升高[20]。從腌制期到發(fā)酵初期，肌原纖維蛋白溴酚藍結(jié)合量從13.3 μg上升到25.4 μg，增幅在各階段中最大。肌原纖維蛋白的疏水性基團主要埋藏于蛋白質(zhì)內(nèi)部[21]，火腿在腌制結(jié)束后進入烘房（50℃～55℃）烘腿7 d～10 d，在此期間，蛋白質(zhì)發(fā)生部分變性，使得內(nèi)部的疏水性基團暴露出來，增強了其表面疏水性。進入發(fā)酵期，肌原纖維蛋白表面疏水性進一步增加，但幅度已經(jīng)減緩。此階段蛋白質(zhì)在酶的作用下逐步水解，使得蛋白質(zhì)分子重新取向定位[22]，一些疏水性基團暴露出來，也增強了其表面疏水性。

2.3 宣恩火腿加工過程中肌原纖維蛋白羰基值變化

任何能引起肉類肌纖維膜系統(tǒng)破壞的處理過程，如絞碎、加熱等，都能導(dǎo)致易氧化的成分暴露于氧氣中，從而加速蛋白質(zhì)的氧化[23]。有研究報道，蛋白質(zhì)的氧化可影響其表面疏水性[24]。宣恩火腿在不同加工階段肌原纖維蛋白羰基值變化見圖2。

從圖2可以看出，宣恩火腿的羰基值從原料腿的0.68 nmol/mg增加到成品的2.28 nmol/mg。在發(fā)酵初期之前，羰基值沒有發(fā)生顯著性變化（P＞0.05），進入發(fā)酵期后開始顯著上升（P＜0.05），尤其在發(fā)酵中后期羰基值的增加更快。宣恩火腿在整個加工階段羰基值的變化趨勢與脂肪氧化有關(guān)，因為脂肪氧化產(chǎn)生的丙二醛等二羰基化合物可與肌球蛋白發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生羰基[25]，而宣恩火腿的脂肪氧化在中后期更加活躍[26]。羰基值與表面疏水性的變化趨勢基本吻合。

圖2 宣恩火腿加工過程中肌原纖維蛋白羰基值變化Fig.2 Changes of the carbonyl content of myofibrillar proteins in different stages of Xuanen ham

2.4 宣恩火腿加工過程中肌原纖維蛋白巰基和二硫鍵變化

天然蛋白質(zhì)中的巰基主要包埋在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，但在蛋白質(zhì)發(fā)生變性、水解、氧化等情況下，巰基暴露出來并被氧化形成二硫鍵，促進了蛋白質(zhì)之間的相互交聯(lián)[27]。宣恩火腿在不同加工階段肌原纖維蛋白巰基和二硫鍵變化見圖3。

圖3 宣恩火腿加工過程中肌原纖維蛋白巰基和二硫鍵變化Fig.3 Changes of the sulfhydryl and disulfide bond content of myofibrillar proteins in different stages of Xuanen ham

從圖3可以看出，宣恩火腿巰基含量從原料腿的35.6 nmol/mg降低到成品的20.1 nmol/mg，二硫鍵含量從原料腿的9.65 nmol/mg增加到成品的21.6 nmol/mg，二硫鍵發(fā)酵期內(nèi)快速增加與2.1中二硫鍵是穩(wěn)定宣恩火腿蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的主要化學(xué)作用力之一的結(jié)果相吻合，與其他學(xué)者相關(guān)研究也基本一致[7]。

3 結(jié)論

宣恩火腿在生成過程中蛋白質(zhì)發(fā)生了不同程度的水解和氧化作用，維持其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用力發(fā)生了明顯變化，成品火腿中貢獻度最大的是疏水相互作用和二硫鍵。疏水相互作用是維持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的主要作用力，它對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性、構(gòu)象和功能性質(zhì)具有重要作用，二硫鍵也是穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的重要化學(xué)鍵，二硫鍵的生成可以降低蛋白質(zhì)的構(gòu)象熵，使蛋白質(zhì)達到穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和產(chǎn)生良好的熱穩(wěn)定性。宣恩火腿在長達一年的生成周期內(nèi)，蛋白質(zhì)經(jīng)過高溫、高鹽作用，以及漫長的發(fā)酵期，最終得到質(zhì)地優(yōu)良、風(fēng)味濃郁的成品，與這些蛋白質(zhì)作用力的轉(zhuǎn)變有重要關(guān)系。