滁菊多酚氧化酶和過氧化物酶熱鈍化動力學研究

苗文娟，何鑫，夏玥，楊東東，孫昱，韋海陽

（1.滁州學院生物與食品工程學院，安徽滁州239000；2.安徽啟慧信息科技有限公司，安徽滁州239000）

滁菊又名“甘菊”、“白菊”，產(chǎn)于安徽省滁州市，素有“金心玉瓣、翠蒂天香”之美譽，是中國“四大名菊”之一[1]。滁菊富含黃酮、酚類、揮發(fā)油、氨基酸類及多糖等營養(yǎng)成分，具有抗腫瘤、抗炎、抑菌、抗病毒、抗氧化、調(diào)節(jié)機體免疫力等多種藥理作用[2-6]。

新鮮采摘的滁菊新陳代謝活躍，極易腐敗變色，有研究表明引起植物褐變的主要原因是酶促褐變和非酶褐變，其中多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和過氧化物酶（peroxidase，POD）在酶促褐變過程中發(fā)揮主要作用[7]。褐變不僅改變了滁菊的顏色，而且還破壞了滁菊的風味和活性成分，嚴重限制了滁菊的加工利用。因此，有必要對滁菊中的PPO和POD酶學特性和鈍化動力學進行分析，為滁菊的精準殺青工藝開發(fā)提供理論基礎。

一級鈍化動力學是最常用的鈍酶、殺菌過程的描述方法[8]。在熱鈍酶理論研究中，多名研究者采用一級反應動力學研究酶鈍化情況[9-11]，KUBO等[12]研究了微波處理過程中溫度和POD酶活性的變化情況，測定了鈍酶反應的D值和Z值，表明一級鈍化動力學可以很好地預測POD酶在微波處理過程中的活性變化情況。吳倩等[13]對橄欖PPO和POD的熱失活動力學研究表明，高溫處理能有效地鈍化橄欖PPO和POD，且高溫處理對橄欖PPO和POD的鈍化過程符合兩段模型，提高處理溫度和延長處理時間能顯著提高橄欖PPO和POD的鈍化速率。楊明冠等[14]通過對蘋果PPO進行超聲鈍化動力學研究，發(fā)現(xiàn)隨著超聲處理功率的提高和時間延長，蘋果PPO的熱敏感性降低，k值上升，D值下降，蘋果PPO的鈍化符合一級反應動力學模型。而關于滁菊PPO和POD的熱鈍化動力學研究尚未明確，因此對滁菊中酶熱鈍化動力學進行的研究，可為滁菊采摘后殺青過程中控制酶促褐變反應及提升滁菊品質(zhì)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

滁菊：2019年10月采自滁州市金玉滁菊生態(tài)科技有限公司種植基地；鄰苯二酚（分析純）：阿拉丁試劑有限公司；愈創(chuàng)木酚（化學純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

L3S紫外可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；TGL-16M高速臺式冷凍離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；DF101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限責任公司；PHS-3C pH計：上海越平科學儀器有限公司；BSA124S-CW電子分析天平：賽多利斯科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 滁菊PPO粗酶液提取

稱取新鮮滁菊10 g置于研缽中，加入適量石英砂，加入30 mL預冷的0.1 mol/L、pH6.5磷酸鹽緩沖液，快速研磨后用絹布過濾，濾渣重新加入pH6.5磷酸鹽緩沖液，重復上述操作，合并兩次濾液于4℃、9 000 r/min條件下離心15 min，上清液轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶并定容即得PPO粗酶液。

1.3.2 滁菊POD粗酶液提取

稱取新鮮滁菊10 g置于研缽中，加入適量石英砂，加入30 mL預冷的0.1 mol/L、pH6.0磷酸鹽緩沖液，快速研磨后用絹布過濾，濾渣重新加入pH6.0磷酸鹽緩沖液，重復上述操作，合并兩次濾液于4℃、9 000 r/min條件下離心15 min，上清液轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶并定容即得POD粗酶液。

1.3.3 PPO酶活的測定

參照何軍忠等[15]方法并加以修改：取2.0 mL磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH6.5）于比色皿中，加入 0.3 mL鄰苯二酚底物溶液（0.35 mol/L），加入0.2 mL PPO酶提取液后迅速混勻，立即放入分光光度計于420 nm處測定吸光值（動力學測量模式），從0 s開始每20 s讀數(shù)1次，計時1 min。每組平行測定3次并作空白對照。滁菊PPO酶活力定義為每分鐘每克滁菊鮮樣吸光值增加0.01為一個酶活力單位（U）。

1.3.4 POD酶活測定

參照宋麗軍等[16]方法并加以修改：分別取配好的1 mL愈創(chuàng)木酚溶液（0.090 mol/L）和1 mL過氧化氫溶液（0.010 mol/L）于比色皿中，再加入0.15 mL粗酶液迅速混合均勻，以空白組作為對照，檢測A470nm處的吸光度變化（動力學測量模式）。從0 s開始每20 s讀數(shù)1次，計時1 min。以每分鐘每克滁菊鮮樣吸光度變化0.01為1個酶活力單位（U）。

1.3.5 滁菊PPO和POD最適溫度的測定

分別取適量磷酸鹽緩沖液和底物溶液置于試管中，在相應溫度下水浴保溫，按照1.3.3和1.3.4方法測定PPO和POD酶活力，考察溫度對滁菊PPO和POD活性的影響。

1.3.6 滁菊PPO和POD熱穩(wěn)定性的測定

分別取5 mL滁菊PPO和POD粗酶液置于試管中，在50℃～100℃的水浴加熱磁力攪拌器中進行熱穩(wěn)定性試驗，采用磁力攪拌以保證水浴加熱過程中樣品受熱的均勻性。各個溫度下加熱保溫時間見表1。加熱結(jié)束后立即取出樣品置于冰水浴中，冷卻至室溫（25℃±5℃）后測定酶活，對照樣為室溫放置的PPO和POD酶溶液。采用殘存酶活表示熱處理前后PPO和POD酶活的變化。

表1 滁菊PPO和POD熱穩(wěn)定性測定條件設置Table 1 Condition setting for the thermostability measurement of Chuju PPO and POD

1.3.7 動力學分析

參考XU等[17]與LING等[18]采用一級動力學描述一個特定的食品體系中酶的熱失活。

式中：t為熱處理時間，min；A為t時刻的樣品酶活；A0為初始酶活；k為失活速率常數(shù)，min-1；D為指數(shù)遞減時間，min。

酶對溫度的敏感性可以用Ea（J/mol）來表示，Ea可從失活速率常數(shù)的自然對數(shù)ln（k）與溫度的倒數(shù)1/T（T為絕對溫度）作圖所得回歸曲線的斜率中求出[17]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗數(shù)據(jù)均重復3次，數(shù)據(jù)采用Excel 2007進行數(shù)據(jù)處理，用平均值±標準差的方式描述，采用Origin 2020軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 滁菊PPO和POD最適溫度

溫度對滁菊PPO和POD酶活性的影響結(jié)果見圖1。

圖1 溫度對滁菊PPO和POD酶活性的影響Fig.1 The effect of temperature on PPO and POD activities of Chuju

由圖1可見，滁菊PPO和POD的酶活性均隨著溫度的升高先上升再下降，但二者趨勢線有一定差別。滁菊PPO的最適反應溫度為30℃，同時在較低的溫度范圍內(nèi)（40℃～60℃）酶活即開始下降。滁菊POD的最適反應溫度是45℃，POD在30℃～60℃相對酶活力均可保持在85%以上。亳菊[19]PPO的最適反應溫度是25℃，POD的最適反應溫度是30℃～35℃[20]，橄欖[21]中PPO最適反應溫度60℃，POD最適反應溫度40℃，由此可以看出不同來源的原材料中的PPO和POD酶學特性有較大差異。因此，在后期試驗過程中選擇在50℃以上溫度對滁菊PPO和POD進行進一步熱處理，并進行詳細的動力學研究。

2.2 滁菊PPO和POD熱穩(wěn)定性分析

滁菊PPO和POD粗酶液分別在50℃～100℃處理一定時間后，殘存酶活試驗數(shù)據(jù)如表2所示。

表2 熱處理后PPO和POD相對酶活變化Table 2 The relative activity change of PPO and POD after heat processing

PPO和POD酶活隨著加熱時間的增加而降低，并且受到溫度的顯著影響。當PPO和POD在較低的溫度下處理時，酶活下降速率慢，隨著溫度升高，酶活下降速率增大。結(jié)果表明，加熱時間和溫度對PPO和POD失活有顯著影響。但需注意的是，在較低溫度下，如50℃，即使處理60 min后PPO仍殘存40.1%酶活，POD仍殘存86.4%酶活，處理75 min后二者酶活仍未顯著下降，表明在較低溫度下延長處理時間對酶的鈍化效果不顯著。

同時，由表2對比分析可見，滁菊PPO和POD對溫度的敏感性不同。在50℃處理30 min后PPO和POD的酶活分別降至初始值的51.8%和89.1%；60℃處理30 min后PPO和POD的酶活分別降至27.9%和60.1%；70℃處理1 min后PPO和POD的酶活分別降至76.1%和81.8%；80℃處理1 min后PPO和POD的酶活分別降至52.4%和59.1%，90℃處理1 min后PPO和POD的酶活分別降至17.5%和20.0%，100℃處理1 min后PPO和POD的酶活分別降至1.3%和4.7%，滁菊PPO對溫度的敏感性高于POD。

2.3 滁菊PPO和POD的熱失活動力學分析

2.3.1 熱處理對滁菊PPO和POD的k值和D值影響

基于滁菊PPO和POD熱穩(wěn)定性數(shù)據(jù)，設計試驗研究了PPO和POD在50℃～100℃下的詳細熱失活動力學。以加熱時間為橫坐標，ln（A/A0）為縱坐標作圖，圖2和圖3分別是不同溫度下加熱后PPO和POD失活一級動力學變化情況。

圖2 滁菊PPO的一級鈍化動力學擬合結(jié)果Fig.2 Fitting result of firs order inactivation kinetics of PPO in Chuju

由圖2和圖3可見，PPO和POD熱失活線性擬合結(jié)果較好，說明PPO和POD的熱鈍化符合一級反應動力學，這與CAO等[22]對藍莓汁中PPO和POD的熱鈍化動力學研究結(jié)果一致。同時滁菊PPO和POD擬合后的直線斜率均隨著溫度的增加而增加，說明升高溫度會增強對PPO和POD酶活性的鈍化效果。滁菊PPO鈍化的擬合R2范圍在0.810 2～0.981 5，POD鈍化的擬合R2范圍在0.701 4～0.985 9。

圖3 滁菊POD的一級鈍化動力學擬合結(jié)果Fig.3 Fitting result of first order inactivation kinetics of POD in Chuju

酶的失活反應速率常數(shù)k可以從相對酶活的自然對數(shù)ln（A/A0）與時間t作圖所得的回歸線斜率中求得[23]。根據(jù)圖2、圖3的擬合數(shù)據(jù)和公式1、公式2可以計算得到滁菊PPO和POD酶的熱鈍化動力學參數(shù)k值和D值，D值指的是在一定條件下鈍化90%酶活所需的時間[24]，D值可以反映酶對溫度的敏感程度，D值越高，酶對溫度敏感性越低，相同溫度下鈍化效果越差，具體數(shù)據(jù)如表3所示。

表3 滁菊PPO和POD一級熱鈍化動力學參數(shù)Table 3 Kinetic parameters of thermal inactivation of PPO and POD in Chuju

由表3可見，PPO和POD的k值隨著溫度的增加而增加，D值隨著溫度的增加而減小，說明升高溫度會增強PPO和POD的鈍化效果。

從各個溫度下PPO和POD的D值變化，可以更容易發(fā)現(xiàn)兩種酶對溫度的敏感性差異，在相同溫度下比如在60℃時，PPO的D值為47.192 6 min，POD的D值為111.256 0 min，而溫度上升到70℃時，PPO的D值為 10.052 4 min，POD的 D值為 21.051 2 min，在100℃時，PPO的D值為 0.563 8 min，POD的D值為0.9553min，由此表明滁菊PPO較POD容易鈍化。

2.3.2 熱處理對滁菊PPO和POD酶的Ea值影響

滁菊PPO和POD的Ea擬合曲線見圖4。

圖4 滁菊PPO和POD的Ea擬合曲線Fig.4 Ea fitting curve of chuju PPO and POD

反應活化能Ea可通過Arrhenius方程求得，常用來評價反應溫度對酶失活速率常數(shù)k的影響。Ea越小，代表反應速率越快。圖4表明PPO和POD的ln k與溫度的倒數(shù)之間具有良好的相關性，R2均在0.96以上。由其斜率求得熱處理鈍化PPO和POD的Ea分別為 13.495 kJ/mol和17.092 kJ/mol，即需要 13.459 kJ的能量才能將1 mol的PPO分子鈍化，需要17.092 kJ的能量才能將1 mol的POD分子鈍化。從活化能的數(shù)據(jù)也可以說明滁菊PPO較POD對溫度更敏感，在熱處理過程中更易失活。

通常認為Ea＜40 kJ/mol時，則該反應的反應速率非常大[25]。因此，由上述數(shù)據(jù)可知高溫下滁菊中PPO和POD雖反應活化能有一定差異，但均屬于易于高溫失活的酶，因此，對滁菊進行高溫處理可有效鈍酶。

3 結(jié)論

熱處理對新鮮滁菊PPO和POD的鈍化有顯著效果，隨著熱處理溫度的提高、熱處理時間的增加，鈍酶效果越好，當溫度大于80℃對滁菊PPO和POD的熱鈍化效果較好，低溫長時對降低PPO和POD酶的活性效果不佳。

通過對滁菊PPO和POD的熱鈍化動力學分析，確定了這兩種酶的熱失活動力學參數(shù)。動力學分析數(shù)據(jù)表明，在50℃～100℃的等溫熱處理過程中，滁菊PPO和POD的熱失活符合一級動力學模型，隨著處理溫度的上升，滁菊PPO和POD鈍化的k值逐漸增加，D值逐漸降低，滁菊PPO一級鈍化模型線性擬合系數(shù)均在0.8以上，Ea=13.495 kJ/mol；滁菊POD一級鈍化模型線性擬合系數(shù)均在0.7以上，Ea=17.092 kJ/mol；與滁菊POD相比，滁菊PPO的熱穩(wěn)定性較差，該結(jié)果為滁菊中PPO和POD酶的熱鈍化提供理論依據(jù)，也為滁菊殺青工藝研究提供了參考。