潤燥活血湯對干燥綜合征模型小鼠血清及頜下腺M3R 表達的影響

張丹娜 葉麗紅 劉喜德

干燥綜合征（sjogren's syndrome，SS）是一種以外分泌腺受損為主的慢性炎癥性自身免疫病，以口干、眼干、關節(jié)疼痛為主要臨床表現(xiàn)，亦可造成血液、腎、肺等全身各系統(tǒng)受損，甚至危及生命[1]。毒蕈堿樣乙酰膽堿3 型受體（muscarinic acethyleholine receptor 3，M3R）主要分布于外分泌腺及平滑肌，阻斷乙酰膽堿能神經(jīng)信號的有效傳遞，損傷頜下腺和減少唾液輸出量，造成涎腺分泌減少，從而引起口干眼干等SS癥狀。國內(nèi)外多項研究證實，M3R 參與SS 的發(fā)病[2]。筆者臨床觀察發(fā)現(xiàn)，應用中醫(yī)潤燥活血湯治療SS，可明顯緩解患者口干、眼干等臨床表現(xiàn)。本研究探討潤燥活血湯對SS 模型小鼠血清及頜下腺M3R 表達的影響及作用機制。

1 實驗材料

1.1 動 物 8 周齡SPF 級健康BALB/c 雄性小鼠47 只，體質(zhì)量（25.0±2.0）g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供[SCXK（滬）2017-0005]。溫度（20±2）℃，相對濕度50%～60%，光照12h 明暗交替，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心清潔級小鼠實驗室[動物實驗條件合格證號：SYXK（浙）2013-0184；動物實驗設施使用許可證編號：2015071]。

1.2 藥 物（1）潤燥活血湯（麥冬15g，生地10g，赤芍、丹參各9g，桃仁6g，玄參、白芍各9g，紫苑6g，生甘草3g）中藥飲片與水以1∶7 的比例混合，浸泡2h，煮沸30min，過濾，藥渣與水以1∶5 的比例混合，繼續(xù)煎煮20min，過濾，合并2 次濾液，于水浴鍋上濃縮成每毫升含生藥1g 的藥液，由浙江省中西醫(yī)結合醫(yī)院制劑室提供煎藥制劑。（2）羥氯喹（HCQ）混懸液：將硫酸羥氯喹片（Sanofi-Synthelabo Ltd，批號H20090258，規(guī)格：200mg/片，碾磨成粉劑，與生理鹽水按1.5mg/mL 的藥物濃度配制成混懸液[3-4]。

1.3 試劑與儀器 弗氏不完全佐劑（Sigma，IFA）（Chondrex 公司提供，批號232-455-8）；小鼠血清M3R 試劑盒（Mouse M3R ELISA Kit）（廈門慧嘉生物科技有限公司，產(chǎn)品編號MG3782）；吸附無細胞百白破聯(lián)合疫苗（武漢生物制品研究所有限責任公司，國藥準字S19980016）；PBS 磷酸鹽緩沖液、4%多聚甲醛、水合氯醛、二甲苯、95%乙醇、無水乙醇（浙江省中西醫(yī)結合醫(yī)院制劑室，批號20161008、20161017、20161014、1610113602、20161002、20160918）；一 抗（Chrm3 Polyclonal Anti-body，Mouse）、二抗（抗兔生物素化二抗）和兔免疫組化試劑盒（北京四正柏生物科技有限公司，批號4ab010986、FXP020-060、FXP020-060。BIOTEK 酶標儀，美國BIOTEK 公司，規(guī)格：Power WaveXS+洗板機ELX50；TQZ312 臺式全溫振蕩器、BMJ-B 型包埋機和DNP-9162E 電熱恒溫培養(yǎng)箱，均購自上海精宏試驗設備有限公司；4℃低溫離心機，德國，規(guī)格：EPPENDORF 543OR；CM1950 冷凍切片機和LEICA HI1210 撈片機，均為德國LEICA 公司；OLYMPUS BX50 顯微攝像系統(tǒng)，日本OLYMPUS 公司；電子天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司，型號：BT125D；-20℃科龍BCD-246AK3 低溫冰箱，廣東科龍電器股份有限公司。

2 實驗方法

2.1 模型建立與分組 SPF 級健康8 周齡BALB/c小鼠47 只，適應性喂養(yǎng)7 天，按隨機區(qū)組法，隨機選取5 只處死摘取頜下腺，余下的小鼠隨機分為正常組10 只，模型組32 只。參照文獻[5]的造模方法。在低溫條件下，按照脫頸椎處死法，先用75%乙醇浸泡5 只BALB/c 小鼠10min，然后在無菌工作臺上解剖頸部，先取出小鼠兩側頜下腺，將包膜和結締組織等附著物分離出來，生理鹽水漂洗干凈后，用無菌濾紙吸干腺體，然后稱出0.1g 腺體，用顯微剪剪碎，將碎塊置入10mL 無菌試管中，加入2mL 生理鹽水，按3000r/min 漿速，在冰浴中用勻漿器將其勻漿30s，然后在4℃低溫離心機中以3000r/min 速度離心，持續(xù)15min，將試管中上層脂質(zhì)吸除，余下的上清液置入10mL 無菌試管中作為抗原備用。用PBS 緩沖液將上述制備抗原稀釋到100μg/mL，加入同體積弗氏完全佐劑，調(diào)配成濃度為200μg/mL 的注射用抗原。隨機在32 只小鼠背部取多點注射，每只小鼠注射總量為1mL。同時各小鼠背部注射百白破聯(lián)合疫苗0.05mL進行造模。10 只正常組小鼠背部隨機多點注射等體積生理鹽水。5 周后，隨機處死2 只造模小鼠，若小鼠頜下腺有特征性淋巴細胞浸潤或腺體萎縮等SS 典型病理表現(xiàn)，證實造模成功。將造模成功的另30 只小鼠采用隨機數(shù)字表法分為HCQ 組、潤燥活血湯組、模型組，每組10 只。

2.2 給藥方法 根據(jù)小鼠的平均體質(zhì)量25g，按照實驗動物與人體每公斤體質(zhì)量劑量換算比例算出用藥劑量。臨床成人HCQ 用量為400mg·60kg-1·d-1，臨床成人中藥干重用量為76g·60kg-1·d-1。模型組每次灌胃1mL 生理鹽水；HCQ 組按濃度為1.5mg/mL 的HCQ 混懸液灌胃，用量為0.06g·kg-1·d-1；潤燥活血湯組以潤燥活血湯煎劑灌胃，用量為11.4g·kg-1·d-1。以上造模小鼠灌胃均每天1 次，連續(xù)灌胃30 天。正常組小鼠給予正常飲食，無特殊處理。

2.3 標本處理 給藥30 天后，所有小鼠眼眶取血后脫頸椎處死。在4℃的溫度下，按3000r/min 離心15min，吸取血清5mL，放入離心管中。并將所有小鼠頜下腺、脾臟取出，4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，厚度2μm，蘇木素-伊紅（HE）染色。

2.4 觀察指標及方法

2.4.1 唾液量 每14 天測定唾液分泌量變化。計算方法：測定前做好棉球稱干重，重量范圍4.5～5.0mg。測唾液分泌時將已經(jīng)稱好干重的棉球放入實驗小鼠口頰內(nèi)，5min 后取出，電子天平上稱濕重。唾液分泌量（mg）=濕重－干重。

2.4.2 病理形態(tài)學觀察及評價 用眼科剪取下所有小鼠頜下腺，用4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，厚度2μm，HE 染色，光鏡下觀察照相。參照Cutler[3]方法，進行淋巴細胞浸潤情況病理形態(tài)學評價：（1）偶見淋巴細胞浸潤，0 分；（2）少量散在淋巴細胞浸潤，1 分；（3）淋巴細胞中度浸潤（未成灶），伴有輕度實質(zhì)損傷，2 分；（4）偶見0～1 個淋巴細胞浸潤灶/5個低倍視野，伴有中度實質(zhì)損傷，3 分；（5）2～3 個淋巴細胞浸潤灶/5 個低倍視野，伴有重度實質(zhì)損傷，4分；>2 分為發(fā)病。

2.4.3 ELISA 法測定小鼠血清M3R 水平 包被過程（同時設置空白對照，陰性對照）：將抗原用包被稀釋液稀釋到適當濃度入孔，置37℃，4h，棄去孔中液體；封閉酶標反應孔：按試劑盒操作步驟；加入離心稀釋后的小鼠血清；加入酶標抗體并洗滌；加入底物液；終止反應；結果判斷。

2.4.4 免疫組化法檢測小鼠頜下腺M3R 表達（1）脫蠟、水化：為防脫片，行免疫組化檢驗的切片需在65.0℃烤箱過夜。二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各浸泡10min，無水乙醇、95%和75%乙醇各浸泡5min，然后蒸餾水洗5min。再以磷酸鹽緩沖液（PBS）浸泡10min，3%過氧化氫-甲醇溶液37.0℃溫育10min。純化水沖洗，PBS 浸泡5min。（2）抗原修復：將切片置于濃度為1mol/L、pH 為6.00 的枸櫞酸液修復液中，煮沸15min。自然冷卻30min。用PBS 洗3 次，每次2min。（3）血清封閉：室溫下，組織切片上滴加10%山羊血清封閉液，置于37.0℃濕盒，孵育10min，甩去多余液體，每片滴加1∶500 的一抗100μL，再37.0℃濕盒孵育60min。陰性對照用PBS 代替一抗。PBS 洗3次，每次2min。（4）滴加抗兔生物素化二抗，37.0℃濕盒孵育10min。PBS 洗3 次，每次2min。（5）每片滴加HRP 標記鏈親和素，37.0℃濕盒孵育10min。（6）制備并滴加DAB 顯色液2min，自來水充分沖洗后，蘇木素復染，鹽酸乙醇分化，脫水，透明，封片，鏡檢。光鏡下觀察結果，每張切片選取5 個視野，陽性顯示為棕黃色或棕褐色。圖像分析：隨機選取5 個高倍視野（×200），計算每個視野的陽性面積比，取其平均值。陽性面積=每個視野陽性目標面積/整個統(tǒng)計面積×100%。

2.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結果

3.1 各組小鼠一般情況 正常組小鼠皮毛光潤潔白，毛發(fā)濃密均勻柔軟，精力充沛。模型組、潤燥活血湯組、HCQ 組小鼠均存在不同程度、不同部位脫毛現(xiàn)象，精神及活動狀態(tài)不及正常組。

3.2 各組小鼠唾液量比較 與正常組比較，模型組、潤燥活血湯組和HCQ 組小鼠治療前唾液量減少（P均＜0.05）。治療第30 天，與模型組比較，潤燥活血湯組、HCQ 組小鼠唾液量明顯增加（P 均＜0.05）；潤燥活血湯組和HCQ 組之間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與本組治療前比較，治療后潤燥活血湯組、HCQ組小鼠唾液量均增加（P 均＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠治療前后唾液量比較（mg，）

表1 各組小鼠治療前后唾液量比較（mg，）

注：正常組為正常小鼠，常規(guī)飼養(yǎng)，無特殊處理；模型組為干燥綜合征小鼠，予1mL 生理鹽水灌胃；潤燥活血湯組予潤燥活血湯11.4g·kg-1·d-1灌胃；HCQ 組予硫酸羥氯喹片0.06g·kg-1·d-1 灌胃；與正常組同期比較，aP＜0.05；與模型組同期比較，bP＜0.05；與本組治療前比較，cP＜0.05

3.3 各組小鼠血清M3R 水平比較 與正常組比較，模型組小鼠血清M3R 表達量增加（P＜0.05）；與模型組比較，潤燥活血湯組、HCQ 組M3R 表達量減少（P均＜0.05）。潤燥活血湯組和HCQ 組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組小鼠血清M3R 表達水平比較（pg/mL，）

表2 各組小鼠血清M3R 表達水平比較（pg/mL，）

注：正常組為正常小鼠，常規(guī)飼養(yǎng)，無特殊處理；模型組為干燥綜合征小鼠，予1mL 生理鹽水灌胃；潤燥活血湯組予潤燥活血湯11.4g·kg-1·d-1灌胃；HCQ 組予硫酸羥氯喹片0.06g·kg-1·d-1 灌胃；M3R 為毒蕈堿樣乙酰膽堿3 型受體；與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

3.4 各組小鼠頜下腺M3R 表達量比較 與正常組比較，模型組頜下腺M3R 表達量增加（P＜0.01）；與模型組比較，潤燥活血湯組、HCQ 組小鼠頜下腺M3R表達量減少（P 均＜0.05）。潤燥活血湯組和HCQ 組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3，圖1。

表3 各組小鼠頜下腺M3R 表達量比較（%，）

表3 各組小鼠頜下腺M3R 表達量比較（%，）

注：正常組為正常小鼠常規(guī)飼養(yǎng)，無特殊處理；模型組為干燥綜合征小鼠，予1mL 生理鹽水灌胃；潤燥活血湯組予潤燥活血湯11.4g·kg-1·d-1灌胃；HCQ 組予硫酸羥氯喹片0.06g·kg-1·d-1 灌胃；M3R 為毒蕈堿樣乙酰膽堿3 型受體；與正常組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05

圖1 各組小鼠頜下腺M3R 表達免疫組化圖（SP ×400）

3.5 各組小鼠頜下腺病理形態(tài)學比較 正常組頜下腺呈現(xiàn)分葉狀，腺泡結構正常，多表現(xiàn)為卵圓形，大小均一，無明顯聚集，腺泡導管無擴張，導管和上皮未見變性、壞死，腺體間質(zhì)無明顯充血、水腫，未見明顯淋巴細胞浸潤等病理變化（見圖2A）。模型組小鼠頜下腺腺泡上皮可見變性、增生，周圍淋巴細胞浸潤，部分成灶，導管管壁增厚，部分纖維化，但未見明顯腺體萎縮（見圖2B）。HCQ 組（見圖2C）和潤燥活血湯組（見圖2D）頜下腺腺泡結構較模型組明顯改善，間質(zhì)充血水腫減輕，腺體萎縮得到抑制，浸潤的淋巴細胞數(shù)量減少。與正常組比較，模型組小鼠頜下腺淋巴細胞浸潤病理評分明顯增高（P＜0.01）；與模型組比較，潤燥活血湯組和HCQ 組小鼠頜下腺淋巴細胞浸潤病理評分明顯降低（P 均＜0.05）；潤燥活血湯組和HCQ 組之間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表4。

圖2 各組小鼠頜下腺病理表現(xiàn)（HE ×400）

表4 各組小鼠頜下腺淋巴細胞浸潤病理評分比較（分，）

表4 各組小鼠頜下腺淋巴細胞浸潤病理評分比較（分，）

注：正常組為正常小鼠常規(guī)飼養(yǎng)，無特殊處理；模型組為干燥綜合征小鼠，予1mL 生理鹽水灌胃；潤燥活血湯組予潤燥活血湯11.4g·kg-1·d-1灌胃；HCQ 組予硫酸羥氯喹片0.06g·kg-1·d-1 灌胃；與正常組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05

4 討論

SS 發(fā)病機制與效應蛋白M3R 以及跨膜轉運水分子蛋白AQP5 的異常表達密切相關。M3R 抗體主要分布于外分泌腺，是腺細胞分泌的重要分子基礎[6-7]，可阻斷乙酰膽堿能神經(jīng)信號的有效傳遞。當腺體受到攻擊，就會釋放乙酰膽堿和神經(jīng)肽等物質(zhì)。結合并激活M3R，從而使頜下腺受損、血流反應減慢、唾液輸出量減少，阻斷腺泡內(nèi)APQ5 的正常分布，造成涎腺分泌減少[2，8]，并可同時激活磷脂酶c 信號傳導通路，增加腺體局部NO 水平，破壞涎腺組織結構，進一步減少唾液、淚液的分泌[9]。實驗結果表明，敲除M3R 基因后，小鼠唾液流量明顯減少，表明M3R 參與唾液分泌的過程[10]。同時，小鼠被M3R 結構肽段免疫后，動物模型出現(xiàn)類似SS 的臨床表現(xiàn)[11]。秦源等[12]研究證實，通過調(diào)節(jié)AQP5 和M3R 通道，可改善腺體水分分布，維持人體正常的生理功能。因此，M3 受體是SS 的致病抗原，并且被抗M3R 抗體特定攻擊?？筂3R 抗體與腺泡細胞上的M3 受體結合，發(fā)揮類似M3 受體阻滯劑的作用，促使炎癥因子釋放，損害腺體分泌功能，使腺體細胞凋亡[13]。

筆者通過臨床實踐總結出SS 的病機在于燥毒與瘀血。燥邪日久，使血脈干澀，停而成瘀，瘀血阻滯，致使氣機失常，津液不能正常敷布，加重燥癥。如此循環(huán)反復，漸成燥痹。劉丹等[14]認為，SS 病機總屬氣虛，陰虧和血瘀為本，燥熱為標。因此，SS 的中醫(yī)辨證并非單純的陰液虧虛致使津液不足或者熱邪熾盛灼傷津液所能概括，而是陰津虧虛的基礎上，燥、毒、虛、瘀相互作用而致病。潤燥活血湯是治療燥痹的大法。根據(jù)臨床經(jīng)驗總結出潤燥活血湯為治療主方。方中重用麥冬為君，生地為臣，君臣相輔，胃陰得養(yǎng)，津液得生；赤芍散邪行血，白芍既養(yǎng)陰生津，又解燥毒之邪，兩藥配伍斂陰涼血而不戀邪；桃仁為佐，活血祛瘀潤燥，泄滯血，生新血，去血中之熱；紫菀宣肺氣，輸津液，引諸藥直達病所。諸藥合用共奏養(yǎng)陰生津、潤燥活血之功。本實驗結果表明，潤燥活血法能下調(diào)SS 小鼠M3R 表達，減輕淋巴細胞浸潤，改善頜下腺腺分泌能力。[本文受浙江省中西醫(yī)結合醫(yī)院院內(nèi)課題（No.hhyn201904）支持。]