進(jìn)展性缺血性腦卒中病人外周血miRNA的表達(dá)水平及臨床意義

羅 婷，邵祥忠，謝海洋，秦延昆，曹 建，何 輝

進(jìn)展性缺血性腦卒中(progressive ischemicstroke，PIS)通常是指缺血性腦卒中病人在48 h內(nèi)神經(jīng)功能缺失呈階梯狀加重，若不及時治療會嚴(yán)重影響病人中樞神經(jīng)功能及預(yù)后效果[1]。PIS病人局部腦組織長時間持續(xù)缺血會導(dǎo)致腦細(xì)胞壞死，臨床非常重視對腦卒中病人的早期治療[2]。因此，如何準(zhǔn)確評估PIS病人病情對后續(xù)治療具有指導(dǎo)作用。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，微小核糖核酸(micro RNA，miRNA)與PIS的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，可以在體液中被檢測到，有可能成為PIS病人診斷的標(biāo)志物[3]。既往研究指出，miR-30a、miR-409可能與細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)相關(guān)，miR-122、miR-126、miR-221與細(xì)胞缺血再灌注相關(guān)，這些均與PIS病因有一定的關(guān)系[4-5]。本研究觀察PIS病人外周血miR-30a、miR-122、miR-126、miR-221、miR-409的表達(dá)水平變化，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年3月—2019年3月南通大學(xué)附屬海安醫(yī)院收治的84例PIS病人作為PIS組，其中男54例，女30例，年齡44～73(56.20±6.31)歲。PIS組納入標(biāo)準(zhǔn)：符合中國急性缺血性腦卒中診治指南[6]對PIS的定義，經(jīng)影像學(xué)診斷確診為PIS病人。PIS組排除標(biāo)準(zhǔn)：①入院24 h內(nèi)搶救無效死亡；②合并血液系統(tǒng)疾病；③合并多臟器功能不全；④合并惡性腫瘤；⑤合并血栓性疾病；⑥精神疾病病人；⑦在住院過程中合并肺部感染。選取同期體檢健康者90名作為健康組，男55名，女35名，年齡45～75(55.96±6.27)歲。健康組納入標(biāo)準(zhǔn)：①體檢結(jié)果均正常；②體檢資料完整。健康組排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往有腦卒中病史；②合并心、肝、腎等重要器官疾患；③有腫瘤家族史。兩組性別、年齡等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

治療14 d后，PIS組病人進(jìn)行改良Rankin量表(Modified Rankin Scale，mRS)[7]評分，量表共6分，0～2分提示預(yù)后良好，3～6分提示預(yù)后不良，根據(jù)評分結(jié)果分為預(yù)后良好組(MRS評分0～2分)和預(yù)后不良組(MRS≥3分)。預(yù)后良好組67例，男42例，女25例；年齡44～72(56.21±6.13)歲；入院數(shù)字減影血管造影技術(shù)(digital subtraction angiography，DSA)檢查：顱內(nèi)無動脈狹窄27例，單純顱內(nèi)動脈狹窄21例，單純顱外動脈狹窄7例，顱內(nèi)外動脈狹窄12例；入院格拉斯哥昏迷量表(Glasgow Coma Scale，GCS)評分為(8.57±1.13)分。預(yù)后不良組17例，男12例，女5例；年齡46～73(56.17±6.22)歲；入院DSA檢查：顱內(nèi)無動脈狹窄2例，單純顱內(nèi)動脈狹窄7例，單純顱外動脈狹窄3例，顱內(nèi)外動脈狹窄5例；GCS評分(8.63±1.21)分。兩組性別、年齡、DSA檢查結(jié)果、入院GCS評分等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 基本資料收集 回顧性分析所有病人的基本資料，包括性別、年齡、服藥情況。在病人治療14 d后，對其預(yù)后情況進(jìn)行MRS測評。

1.3 實驗室檢查 收集全部研究對象入院時的外周血5 mL，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，取上層血漿移至1.5 mL離心管中，-80 ℃冰箱保存。血漿總核糖核苷酸(ribonucleic acid，RNA)的提?。簶?biāo)本解凍后進(jìn)行兩相分離，通常RNA分布于上層無色水相中；取上層液進(jìn)行RNA沉淀，管底出現(xiàn)白色沉淀，將獲得的白色沉淀進(jìn)行洗滌和溶解，DU800型分光光度計測定RNA的濃度及純度；隨即進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將獲得的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于-20 ℃的冰箱中。實時定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，Real-time qPCR)技術(shù)檢測miR-30a、miR-122、miR-126、miR-221、miR-409水平，Real-time qPCR引物合成由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司提供，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物序列miR-30a、miR-122 miR-126、miR-221、miR-409分別為：5′-ATGGTTCGTGGGTGTAAACATCCTCG-3′；5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；5′-TCGTACCGTGAGTAATAATGCG-3′；5′-GCAGCTACATTGTCTGCT-3′；5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′。內(nèi)參照基因為U6 RNA。嚴(yán)格按照Access RT-PCR System試劑盒說明書進(jìn)行操作。由SDS軟件計算每個樣品和內(nèi)參的Ct值，△Ct=Ct目標(biāo)基因-Ct內(nèi)參基因，受試者miRNA的相對表達(dá)水平計算公式2-△△Ct。

2 結(jié) 果

2.1 PIS組和健康組miRNA表達(dá)比較 PIS組外周血miR-30a、miR-122、miR-126、miR-221表達(dá)水平均高于健康組，外周血miR-409表達(dá)水平低于健康組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

2.2 預(yù)后良好組與預(yù)后不良組入院時miRNA表達(dá)比較 預(yù)后不良組外周血miR-30a、miR-122、miR-126、miR-221表達(dá)水平均高于預(yù)后良好組，外周血miR-409表達(dá)水平低于預(yù)后良好組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

2.3 外周血miRNA表達(dá)水平對PIS預(yù)后的預(yù)測價值分析 ROC曲線分析顯示miR-30a、miR-122、miR-126、miR-409的曲線下面積(AUC)分別為0.736、0.773、0.868、0.901，選取最佳截斷值分別為30.723、1.978、1.720、0.640，提示miR-30a、miR-122、miR-126、miR-409對PIS病人預(yù)后有一定的預(yù)測價值。詳見表3、圖1。

表3 外周血miRNA表達(dá)水平對PIS預(yù)后的預(yù)測價值分析

圖1 外周血miRNA表達(dá)水平預(yù)測PIS病人預(yù)后的ROC曲線

3 討 論

據(jù)統(tǒng)計，隨著社會老齡化進(jìn)程加快，腦卒中成為影響人們生活質(zhì)量的隱形殺手，我國每年新增腦卒中病人約200萬例[8-9]。在腦梗死發(fā)生后一段時間，神經(jīng)功能缺損癥進(jìn)一步加重，稱為PIS，發(fā)病率占腦卒中病人的20%～40%[10]。既往研究指出，感染、血壓和發(fā)熱等都是PIS的獨立危險因素，臨床上常通過病人臨床表現(xiàn)和影像學(xué)診斷來判斷病人預(yù)后情況，缺乏可靠的生物學(xué)指標(biāo)[11-12]。miRNA是一類非編碼單鏈小分子，參與多種疾病過程，同時調(diào)控細(xì)胞分化、免疫應(yīng)答等多種過程，存在于易提取的外周血循環(huán)系統(tǒng)中，對于疾病的無創(chuàng)診斷、評估病人預(yù)后具有重要臨床意義[13-14]。因此，本研究探討PIS病人外周血中5種miRNA的表達(dá)水平及其臨床價值。

miRNA-30a是miR30家族中一員，通過靶向調(diào)節(jié)線粒體分裂來促使細(xì)胞凋亡，在細(xì)胞自噬的過程中發(fā)揮作用[15]。既往研究指出，miRNA-30a在缺血性腦卒中小鼠的大腦中表達(dá)上調(diào)，對于腫瘤細(xì)胞和心肌細(xì)胞的自噬活性都有所影響，但對于PIS的研究較少[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-30a在PIS病人的外周血中表達(dá)上調(diào)，且預(yù)后不良組miRNA-30a表達(dá)高于預(yù)后良好組(P<0.05)，對病人預(yù)后有一定的預(yù)測價值。近年來，關(guān)于miR-122在腫瘤組織中的表達(dá)情況研究較多，提示miR-122的高表達(dá)可作為癌癥早期診斷的重要指標(biāo)[18]。羅斌等[19]通過建立腦缺血再灌注損傷小鼠模型，發(fā)現(xiàn)miR-122可能通過抑制胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R)的表達(dá)，加重腦部損傷。本研究中miR-122在PIS病人外周血中表達(dá)上調(diào)，且上調(diào)程度與預(yù)后情況相關(guān)，預(yù)后不良組miR-409水平低于預(yù)后良好組，推測miR-122的高表達(dá)和miR-409下調(diào)可能是PIS的潛在誘因，在PIS的診斷和預(yù)后判斷中都有一定的價值。俞嶺芳等[20]觀察急性缺血性腦卒中病人外周血miR-409、miR-122表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-122在病人體內(nèi)上調(diào)，miR-409出現(xiàn)下調(diào)，與本研究結(jié)果類似。miR-126具有抑制血管細(xì)胞黏附因子-1的作用，而且對血管內(nèi)皮生長因子的信號傳導(dǎo)有影響，而多項研究表明，miR-126表達(dá)水平和腦梗死嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[21-22]。本研究中miR-126在PIS病人的外周血中表達(dá)上調(diào)，預(yù)后不良組miR-126表達(dá)高于預(yù)后良好組(P<0.05)，推測可能預(yù)后不良病人缺血再灌注損傷加重，應(yīng)盡早預(yù)防。王芳等[23-24]研究顯示，miR-221在下肢缺血性疾病和腦膠質(zhì)瘤病人中異常表達(dá)，血清中miR-10b、miR-21和miR-221聯(lián)合檢測可作為腦膠質(zhì)瘤的早期診斷依據(jù)。本研究中miR-221在PIS病人中呈高表達(dá)(P<0.05)，但對病人預(yù)后情況無預(yù)測價值。

本研究分析miR-30a、miR-122、miR-126、miR-409對PIS病人預(yù)后的預(yù)測價值，4種miRNA均有中等水平的預(yù)測價值，其中miR-409的診斷價值最高，AUC達(dá)0.901，其敏感度和特異度分別為82.4%、85.1%。本研究選取病例較少，只監(jiān)測了PIS病人入院時外周血中5種miRNA表達(dá)，有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步分析治療過程中多種miRNA的動態(tài)變化，嘗試多種miRNA聯(lián)合診斷，為PIS病人提供更準(zhǔn)確的臨床評估。

綜上所述，PIS病人外周血miR-30a、miR-122、miR-126、miR-221表達(dá)高于健康者，miR-409表達(dá)低于健康者，且預(yù)后不良PIS病人miR-30a、miR-122、miR-126、miR-221表達(dá)更高，miR-409表達(dá)更低，miR-30a、miR-122、miR-126、miR-409對PIS病人的早期診斷和預(yù)后評估都有一定的價值，而miR-221對PIS病人預(yù)后的預(yù)測價值暫未明確。