桔梗的真?zhèn)舞b別和質量評價方法研究進展

劉春娟 張波

摘 要 目的：為中藥桔梗的真?zhèn)舞b別和質量評價提供參考，保障其臨床用藥的安全性。方法：從性狀鑒別、顯微鑒別、理化鑒別和分子鑒別等方面對桔梗的真?zhèn)芜M行鑒別;并從化學成分和安全性兩個方面對其質量評價方法進行綜述。結果與結論：桔梗真?zhèn)舞b別和質量評價方法研究較為廣泛，形成了多元化的鑒別和質量評價體系。理化鑒別在桔梗的單味藥及復方中的鑒別應用最為廣泛，而分子鑒別還可用于其產地鑒別和品種鑒別;紫外分光光度法和指紋圖譜技術在桔梗整體質量評價上的應用最廣，液相色譜法更適于其指標性成分的檢測;桔梗的安全性評價方法則以氣相色譜法、氣質聯(lián)用技術、電感耦合等離子體質譜法和原子吸收光譜法為主，分別用于其農藥、重金屬殘留的檢測。目前，雖然桔梗的真?zhèn)舞b定及質量評價方法較為豐富，但還應進一步圍繞“成分-功效”之間的對應關系，建立符合中藥“多成分、多靶點、多功效”特性的質量評價體系或基于質量標志物研究（Q-Marker）理念深入研究其質量評價方法。

關鍵詞 桔梗;鑒別;質量評價;化學成分;安全性

桔梗為桔?？浦参锝酃latycodon grandiflorum （Jacq.）A.DC.的干燥根，主產于我國東北、內蒙古、安徽、山東等地;其具有宣肺、利咽、祛痰、排膿等功效，多用于咳嗽痰多、胸悶不暢、咽痛音啞、肺癰吐膿等的治療[1]。近年來，由于主觀摻入或無意混用，市場上出現(xiàn)多種桔梗偽品或誤用品[2][如石竹科植物絲石竹Gypsophila oldhamiana Mig.，又稱霞草[3];又如石竹科植物瓦草Silene viscidula Franch.[4]和桔?？浦参镙喨~沙參Adenophora tetraphylla （Thunb.）Fisch 或沙參A. stricta Miq.[5]等藥用植物的干燥根]，加之在桔梗的質量評價歷史沿革中出現(xiàn)了“南桔?！迸c“北桔?！钡臓幷揫6]，又有品種之差異[7]，加上產地、栽培與野生、生長年限、采收期、炮制加工等諸多不同[8-12]，導致桔梗的質量參差不齊，嚴重影響其臨床用藥的安全性與有效性。桔梗為臨床常用中藥，是我國出口量較多的中藥材之一，具有較高經濟價值，加強其真?zhèn)舞b別和品質評價方法的研究對保障該藥材的用藥安全性以及促進其進出口貿易具有重要意義。鑒于此，本研究對桔梗的真?zhèn)舞b別、質量評價方法進行綜述，旨在為其臨床安全使用提供保障。

1 真?zhèn)舞b別方法

1.1 性狀鑒別方法

經比較發(fā)現(xiàn)，桔梗與其常見混偽品（如絲石竹、瓦草和南沙參）在形狀、大小和表面顏色等3個方面較為相似，但在表皮特征、斷面特征、質地及氣味方面具有一定差異。其中，桔梗根莖有數(shù)個半月形莖痕，而絲石竹、瓦草和南沙參沒有此特征;桔梗斷面有裂隙且形成層環(huán)、呈棕色，而瓦草皮部無裂隙，絲石竹斷面具有同心環(huán)紋，南沙參斷面裂隙較多;桔梗體輕質脆，而絲石竹體輕質堅實，瓦草體重質脆，南沙參則體輕質松泡;桔梗味甜后苦無麻味，但絲石竹和瓦草均有麻味，而南沙參則僅微甘而無后苦。桔梗與其常見混偽品的性狀鑒別特征詳見表1。

1.2 顯微鑒別方法

中藥顯微鑒別多從橫切面特征和粉末特征2個方面鑒別。桔梗橫切面主要特征為：①木栓層細胞含草酸鈣小棱晶;②韌皮部乳汁管群散在，乳汁管壁厚且內含微細顆粒狀黃棕色物;③木質部導管單個散在或數(shù)個相聚，呈放射狀排列;④薄壁細胞含菊糖[1]。絲石竹橫切面有同心環(huán)紋異常的維管束，薄壁組織中有裂隙且無乳汁管，因此易于鑒別[13];瓦草雖然含有草酸鈣簇晶且導管排列特征與桔梗相似，但不含乳汁管，因此也易于鑒別[14];南沙參橫切面特征與桔梗較為相似，兩者均含有乳汁管、草酸鈣結晶、菊糖和類似的導管特征，其不同之處在于桔梗的形成層為環(huán)形，而南沙參的為弧形，且南沙參木栓層有厚化且呈長方形的木栓細胞環(huán)帶1～3列，與桔梗有一定區(qū)別[15]。

桔梗粉末特征主要為：①扇形或類圓形的菊糖結晶;②含乳汁管;③導管主要為梯紋和網紋導管;④去皮者無草酸鈣簇晶;⑤木薄壁細胞長方形[1]。絲石竹和瓦草粉末中均含有大量草酸鈣簇晶，可據(jù)此與桔梗鑒別[4]。另外，南沙參粉末中含有石細胞[15]，而桔梗中不含，可作為兩者鑒別特征。

1.3 理化鑒別方法

薄層色譜法是較為常用的理化鑒別方法，2020版《中國藥典》（一部）[1]收載的桔梗薄層色譜方法為：以三氯甲烷-乙醚（2 ∶ 1）為展開劑、硅膠G薄層板為固相載體，通過噴加10%硫酸乙醇溶液并置105 ℃烤板中進行斑點顯色，再與標準藥材對照鑒別。除桔梗生品和飲片采用上述方法外，含桔梗的中成藥的鑒別也多采用此法，其主要差異在于展開系統(tǒng)不同，如桑菊感冒沖劑使用的展開系統(tǒng)為三氯甲烷-石油醚（4 ∶ 6）[16]，復方桔梗止咳片的展開系統(tǒng)為環(huán)己烷-乙酸乙酯（4 ∶ 1）[17]，桔梗冬花片的展開系統(tǒng)為氯仿-乙醚（1 ∶ 1）[18]，四季感冒片的展開系統(tǒng)為三氯甲烷-乙醚（1 ∶ 1）[19]。薄層色譜鑒別在桔梗的真?zhèn)舞b別中應用十分廣泛，但其供試品制備過程較為繁瑣，例如需要使用7%硫酸乙醇-水（1 ∶ 3）加熱回流3 h，并需三氯甲烷分步萃取后濃縮，方可應用[1]。

除薄層色譜法外，韓靈國等[5]還通過不同溶劑（水、氯仿、乙醇、10% NaOH、10% HCl）提取桔梗后，根據(jù)提取物紫外燈下熒光顏色的差異進行桔梗的真?zhèn)舞b別。該方法通過多種提取液結果進行綜合判定，其準確性較高，但樣品制備過程同樣較為復雜。

1.4 分子鑒別方法

近年來，分子鑒別技術在中藥鑒別領域的應用發(fā)展十分迅速，形成了多個具有代表性的理論或技術方法，如分子生藥學和DNA條形碼技術。ITS基因片段是植物DNA條形碼的有效候選基因之一，已廣泛應用于中草藥的真?zhèn)舞b別。趙月梅等[20]基于桔梗及其混偽品絲石竹和沙參的ITS序列，通過雙參數(shù)遺傳距離法計算發(fā)現(xiàn)，桔梗的種內遺傳距離為0.006，而其與南沙參的遺傳距離為0.198、與絲石竹的遺傳距離為0.328，具有顯著差異;另外，通過NJ聚類分析發(fā)現(xiàn)，桔梗、絲石竹和南沙參均能獨自聚為單系分支。這說明ITS序列分析可實現(xiàn)桔梗及其混偽品的真?zhèn)舞b別。

2 質量評價方法

目前，中藥質量評價多從化學成分的角度進行，且大致可分為整體評價和代表性成分評價兩方面。

對于桔梗的整體質量評價包括水分、總灰分、醇溶性浸出物、揮發(fā)油、總皂苷、總黃酮和總多糖等多個指標。羅益遠等[21]即是基于以上多個指標的含量測定并構建TOPSIS模型用于不同產地桔梗的質量優(yōu)劣評價。桔梗中水分、總灰分和醇溶性浸出物的測定均有《中國藥典》通則可尋，且技術均較成熟，并無異議;揮發(fā)油的含量測定以氣相色譜-質譜聯(lián)用技術（GC-MS）為主;總皂苷、總黃酮和總多糖的測定方法均采用紫外分光光度法（UV）。此外，從宏觀角度對桔梗進行質量評價的還有指紋圖譜技術和紅外光譜法（IR）。

對于桔梗的指標性成分的評價則是以其皂苷類成分含量評價為主。目前桔梗中已發(fā)現(xiàn)的皂苷類成分多達70余種，其中桔梗皂苷D具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗肥胖、神經保護作用等多種生物活性[22]，是桔梗的主要活性物質，亦是歷版《中國藥典》中規(guī)定的指標性成分。桔梗皂苷類成分的含量測定方法主要有高效液相色譜法（HPLC）、酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）和一測多評法等。

2.1 GC-MS法

揮發(fā)油是植物化學成分的重要組成部分，其含量的差異與植物種質及其生長環(huán)境密切相關，因此通過比較桔梗揮發(fā)油的成分組成及含量差異可以從一定程度上反映藥材的質量差異。He等[23]采用GC-MS法檢測了我國9個不同產地桔梗揮發(fā)油的成分組成，共從中鑒別出了121個化學成分，同時發(fā)現(xiàn)不同產區(qū)桔梗藥材揮發(fā)油含量及組成具有一定差異。龔敏等[24]采用GC-MS法分析了桔梗生品、清炒品和蜜炙品中揮發(fā)油的成分組成，發(fā)現(xiàn)桔梗不同炮制品之間揮發(fā)性成分的差異顯著，可為桔梗及其炮制品的質量評價和臨床合理用藥提供參考。

2.2 UV法

桔梗中總皂苷的含量分析方法多以桔梗皂苷D作為對照品，并通過UV法進行檢測。楊壯等[25]以桔梗皂苷D為對照品，以香草醛-高氯酸為顯色劑，通過UV法比較分析了山東和安徽兩大主產區(qū)桔梗的質量，發(fā)現(xiàn)產區(qū)間和產區(qū)內不同桔梗藥材的總皂苷含量均存在顯著差異。

姜登軍等[26]以蘆丁為對照品，通過UV法比較分析了重慶不同海拔梯度產桔梗的質量，結果發(fā)現(xiàn)不同海拔梯度間桔梗總黃酮的含量差異顯著。

桔梗多糖具有抗氧化和抗癌活性，是桔梗的活性組分之一[27]。黃嬌等[28]采用苯酚-硫酸染色-UV檢測法測定了重慶不同產區(qū)桔梗藥材中的多糖含量，發(fā)現(xiàn)桔梗多糖含量在13.06%～58.70%之間;通過主成分分析法判定質量最優(yōu)的桔梗含糖量也最高;且桔梗總多糖與總黃酮和總皂苷的含量之間呈顯著相關性。以上結果說明，桔梗多糖是桔梗質量評價的重要指標成分。

2.3 指紋圖譜技術

指紋圖譜技術可從整體上反映藥材質量，避免了以單個或少數(shù)幾個指標性成分為依據(jù)的中藥質量評價略顯片面的問題，在中藥質量評價領域應用十分廣泛。目前所建立的桔梗的指紋圖譜主要分為HPLC指紋圖譜和聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）兩類。

產地、品種或生長年限的差異均會導致藥用植物基因表達的差異，進而導致其化學成分的差異，最終形成不同質量的藥材。指紋圖譜技術是以多批次藥材的成分分析結果來評價藥材質量的一致性或穩(wěn)定性，而HPLC指紋圖譜[可串聯(lián)蒸發(fā)光散射檢測區(qū)（ELSD）或二極管矩陣檢測器（PDA）]與PAGE指紋圖譜的區(qū)別主要在于，前者是以小分子化合物為研究對象，后者則是以蛋白質等大分子為研究對象。桔梗指紋圖譜研究情況詳見表2。

2.4 IR法

IR法具有快速、無損、無污染以及可視化等優(yōu)點，可有效反映藥材組織上的官能團信息。司雨柔等[38]結合傅里葉變換IR法和顯微IR法對內蒙古、湖南、陜西、安徽等不同產地的9批次桔梗的化學成分整體變化規(guī)律進行研究。結果顯示，不同產地桔梗的一階IR光譜圖差異不明顯，二階導數(shù)IR光譜圖中產地特征峰差異明顯，且同省內桔梗的成分差異不大，而省間樣品的差異明顯，說明IR法可用于初步鑒別桔梗產地，可作為桔梗質量評價方法之一。

2.5 HPLC法

HPLC法靈敏度高、重復性好、易于標準化，2010版《中國藥典》（一部）首次收載了桔梗皂苷D的HPLC檢測方法，并規(guī)定其“含量不得少于0.1%”，從而取代了2005版《中國藥典》（一部）中重量法的“總皂苷不得少于6.0%”的含量測定標準[39]。除《中國藥典》規(guī)定方法以外，多位學者嘗試了更多的HPLC條件[39-48]，以期更好地對桔梗進行質量評價，其目的大致分為兩類：①同一色譜條件下檢測包含桔梗皂苷D在內的更多的皂苷類成分;②檢測桔梗中的其他化學成分，可作為其質量評價的有效補充。桔梗中化學成分的HPLC法研究情況見表3。

2.6 ELISA法

ELISA法是基于抗原抗體的特異性結合反應與酶催化顯色反應相結合的檢測技術，具有簡便快速、高通量等優(yōu)勢，近年來在中藥質量快速評價領域應用廣泛[49]。Luo等[50]以桔梗皂苷D為半抗原，通過高碘酸鈉法將其與載體蛋白偶聯(lián)制備了完全抗原，進一步通過免疫新西蘭大耳兔后分離制備了可識別桔梗皂苷D的抗血清，最終基于完全抗原與抗血清建立了桔梗皂苷D的ELISA檢測方法。該方法的靈敏度以半數(shù)抑制濃度（IC50）計為2.70 μg/mL，檢測范圍為0.032～2.70 μg/mL;且該方法對其他皂苷類成分（包括桔梗皂苷D2、D3、E，去芹糖桔梗皂苷E，遠志皂苷D2）無明顯交叉反應，說明其檢測結果準確可靠，可用于桔梗的質量評價。

2.7 一測多評法

一測多評法的評價模式是以藥材中一種典型成分為參照，通過建立參照物與其他成分之間的相對校正因子（RCF），并根據(jù)RCF計算其他成分的含量的方法。該方法可實現(xiàn)利用一個標準品達到多成分同步快速測定的目的，具有經濟、穩(wěn)定、快捷等優(yōu)點，在中藥質量評價領域應用廣泛，如今已被2015版《中國藥典》（一部）收錄[51]。蔣齡周等[52]以桔梗皂苷D為內標，通過HPLC-ELSD建立了桔梗皂苷D與桔梗皂苷D3和桔梗皂苷E的RCF，實現(xiàn)了三者含量的同步檢測;進一步通過10批次桔梗藥材的驗證發(fā)現(xiàn)，一測多評法測定結果與外標法一致。

2.8 其他

除上述方法外，其他先進技術[如超高液相色譜（UPLC）]和先進理念[如質量標志物（Q-Marker）理論]也逐漸應用于桔梗藥材的質量評價中。

陳寶等[53]利用UPLC法同時測定了不同產地桔梗藥材中的13種核苷類成分，結果發(fā)現(xiàn)，桔梗中含有豐富的核苷類成分，但不同產地樣品間核苷類成分含量的差異顯著;同時，該方法檢測準確、快速、重復性好，為桔梗的質量評價提供了新思路。

Q-Marker理論是劉昌孝院士等在2016年基于中醫(yī)藥理論和植物學科相關理論，以化學生物學技術為手段，系統(tǒng)解析中藥有效性的內在化學成分而建立的多元質量評價理論[54]。韋金玉等[55]通過系統(tǒng)分析桔梗的質量控制現(xiàn)狀及其化學成分組成，從Q-Marker的核心理論出發(fā)，推薦桔梗皂苷A、D、D3、E，桔梗炔苷A、B，黨參炔苷，木犀草素，芹菜素，桔梗多糖和苦味氨基酸等為桔梗Q-Marker的首選成分，為進一步評價桔梗的質量提供了參考。

3 安全性評價方法

桔梗作為一種集藥、食、賞為一體，具有較高綜合經濟價值的藥用植物，在我國的栽培歷史可追溯至20世紀70年代，距今約50年。另一方面，桔梗在朝鮮、韓國、日本等國有較高需求量，是我國主要的出口中藥材之一。因此，為追求高產量或便于田間管理，在桔梗的栽培過程中經常會使用農藥，常用的以有機氯、有機磷等殺蟲劑和撲草凈、萘氧丙草胺等除草劑為主，容易導致農藥殘留，影響桔梗的質量和安全性。再者，由于栽培地區(qū)土壤污染或桔梗生產加工過程污染，均會導致桔梗重金屬超標，故有必要對重金屬含量進行監(jiān)測，以保障桔梗藥材的安全性。

3.1 農藥殘留檢測方法

目前，桔梗中有機氯農藥殘留的檢測主要以氣相色譜法（GC）為主，而有機磷殺蟲劑或其他廣譜殺蟲劑以及除草劑的檢測以GC-MS法為主。焦陽等[56]采用分散固相萃取結合GC法建立了檢測11種有機氯農藥殘留的方法并用于3批待出口桔梗的檢測，結果發(fā)現(xiàn)3批桔梗均無農藥殘留。該方法檢出限低（1.5～9.8 μg/kg）、線性關系好、精密度高，可滿足桔梗中農藥殘留檢測的需要。湯軍華等[57]建立了包含有機磷和廣譜殺蟲劑以及殺螨劑在內的6種農藥殘留的GC-MS檢測方法，結果發(fā)現(xiàn)，栽培桔梗較野生品種含有更多農藥殘留，需引起重視。吳明根等[58]建立了桔梗藥材中撲草凈和萘氧丙草胺的GC-MS檢測方法，其分別以40%撲草凈（0.2、0.4? g/m2）和50%萘氧丙草胺（0.2、0.4 g/m2）處理桔梗，半年后收獲藥材并檢測，發(fā)現(xiàn)撲草凈殘留量分別為0.028? mg/kg和0.036 mg/kg，超出日本和德國等國家標準，而萘氧丙草胺則未檢出。

3.2 重金屬檢測方法

桔梗中重金屬的檢測方法主要以電感耦合等離子體質譜法（ICP-MS）和原子吸收光譜法（AAS）為主。趙宏蘇等[59]采用ICP-MS法測定了山東、安徽、內蒙古等主產地桔梗中銅、砷、鉛、鎘、汞等5種重金屬的含量，結果發(fā)現(xiàn)，其重金屬含量均符合《藥用植物及其制劑進出口綠色行業(yè)標準》的限量規(guī)定。同時，在檢測過程中ICP-MS法呈現(xiàn)出檢測限低、精密度好、干擾少、多種重金屬可同時測定等優(yōu)勢，利用此技術檢測桔梗中重金屬含量簡便可行。魏慶紅等[60]利用AAS法測定了出口桔梗飲片中鉛和鎘的含量，結果發(fā)現(xiàn)，桔梗中鉛含量為0.96 mg/kg，鎘含量為0.083 mg/kg;且該方法操作較為簡單、檢測快速、靈敏度較高，同樣適用于桔梗中藥材的重金屬含量測定。

4 結語

桔梗的主要偽品為絲石竹、瓦草和南沙參，其真?zhèn)舞b別方法主要包括性狀鑒別、顯微鑒別、理化鑒別和分子鑒別。在這些鑒別方法中，以理化鑒別方法準確性較高、結果客觀且在單味藥及復方中應用最為廣泛;分子鑒別方法結果最為準確，且不但可以用于真?zhèn)舞b別，還可用于產地和品種鑒別，是現(xiàn)代生藥學研究的熱點。桔梗的質量評價方法主要包括總體評價和指標性成分評價，其中GC-MS、UV、指紋圖譜和IR等技術方法主要用于整體評價，而HPLC、ELISA、UPLC、一測多評法和Q-Marker等技術、方法和理念多是以桔梗中的單個或多個指標性成分為依據(jù)進行的質量評價。其中，指紋圖譜和HPLC是目前應用最多的質量評價方法，且以桔梗皂苷D為代表的皂苷類成分是桔梗質量評價的主要指標性成分。GC、GC-MS、ICP-MS和AAS等方法多用于桔梗的安全性評價;且通過對目前桔梗的檢測發(fā)現(xiàn)，其農藥殘留和重金屬殘留均符合相應標準，安全性較好。

為進一步完善桔梗的真?zhèn)舞b別和質量評價體系，筆者認為應圍繞真?zhèn)?、?yōu)劣、安全、有效等核心問題開發(fā)高效、實用且符合中藥特征的方法。具體可從以下兩個方面加強：（1）開發(fā)適用于現(xiàn)場化鑒別與評價的技術方法，因為中藥的鑒別任務處在中藥產業(yè)的最前端，往往在中藥采購和生產環(huán)節(jié)應用最多，故簡便、高效、現(xiàn)場化的鑒別方法將極大地便利產業(yè)化應用;（2）圍繞“成分-功效”之間的對應關系，建立符合中藥“多成分、多靶點、多功效”特性的質量評價體系，以及基于Q-Marker理念的桔梗質量評價方法。

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（收稿日期：2021-01-16 修回日期：2021-04-26）

（編輯：羅 瑞）