花生硫氧還蛋白AhTRXh基因的克隆及表達(dá)分析

李霞 潘春柳 蘇桂軍 詹潔 王愛勤 肖冬 何龍飛

摘 ?要：h型硫氧還蛋白（TRX h）是最多的一類硫氧還蛋白，在種子萌發(fā)、氧化還原、信號(hào)傳遞以及響應(yīng)生物和非生物脅迫等多種途徑中起重要作用。以花生鋁敏感品種‘中花2號(hào)和耐鋁品種‘99-1507為材料，對(duì)h型硫氧還蛋白亞族成員AhTRX h進(jìn)行克隆和表達(dá)分析。結(jié)果表明：該基因包含長(zhǎng)為429 bp的完整開放閱讀框，編碼142個(gè)氨基酸;進(jìn)化樹分析表明，花生TRX h與鷹嘴豆TRX h、擬南芥TH9親緣關(guān)系較近，且含有保守活性位點(diǎn)WCGPC;亞細(xì)胞定位顯示，AhTRX h定位于葉綠體;構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-AhTRX h，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta菌種，在上清和沉淀均有表達(dá)，純化獲得可溶的具活性的重組蛋白，體外檢測(cè)重組蛋白沒有明顯的發(fā)生亞硝基化的趨勢(shì)。酵母雙雜顯示，AhTRX h蛋白沒有自激活性，篩選花生文庫(kù)獲得互作蛋白——鈣網(wǎng)蛋白和金屬硫蛋白。該結(jié)果表明AhTRX h可能通過與鈣網(wǎng)蛋白和金屬硫蛋白相互作用，參與花生對(duì)鋁脅迫響應(yīng)。

關(guān)鍵詞：花生;硫氧還蛋白;鋁脅迫;基因克隆

中圖分類號(hào)：S565.2 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： Thioredoxin plays an important role in seed germination， redox homeostasis， signal transduction and res-ponses to biotic and abiotic stresses. In this study， AhTRX h， a member of h-thioredoxin subfamily， was cloned from peanut varieties ZH2 （Al-sensitive） and 99-1507 （Al-tolerant）. Sequence analysis showed that AhTRX h contained an open reading frame （ORF） of 429 bp encoding 142 amino acids with a conservative active site-WCGPC. Phylogenetic analysis showed that AhTRX h was closely related to TRX h in Cicer arietinum and Th9 in Arabidopsis. AhTRX h was located in chloroplast. The recombinant plasmid pGEX-6p-1-AhTRX h was transformed into Escherichia coli （Rosetta）， recombinant proteins induced by IPTG were founded in supernatant and precipitate. Soluble recombinant proteins with activity were purified， and had no obvious trend of S-nitrosylation in vitro. The results of yeast two hybrid showed that potentially interactional proteins were calreticulin and metallothionein. The results indicate that AhTRX h play an important role in response to Al toxicity by likely interacting with calreticulin and metallothionein.

Keywords： Arachis hypogaea; thioredoxin; aluminum stress; gene cloning

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.05.008

活性氧（ROS）為細(xì)胞正常代謝過程的一種代謝產(chǎn)物，以極低的含量存在，但在逆境脅迫條件下ROS含量迸發(fā)，影響植物代謝，對(duì)植物產(chǎn)生脅迫等，如在干旱、高溫、強(qiáng)光等逆境脅迫條件下，植物會(huì)產(chǎn)生大量ROS[1]。ROS含量受到眾多調(diào)控因子的調(diào)節(jié)，氧化還原系統(tǒng)是主要的調(diào)控因子之一。硫氧還蛋白（thioredoxin，TRX）是一類普遍存在的二硫化物還原酶，在保守基序WC[G/P]PC中存在2個(gè)活性半胱氨酸位點(diǎn)，是氧化還原系統(tǒng)中重要的成員之一。依據(jù)序列特征以及亞細(xì)胞定位，植物硫氧還蛋白可分為f、m、o、h、y和x型等不同類型，可以通過半胱氨酸殘基上的硫醇基團(tuán)翻譯后修飾，如S-谷胱甘肽化和S-亞硝基化等[2]，參與氧化還原狀態(tài)調(diào)控，參與不同的細(xì)胞進(jìn)程。如f和m型主要分布在葉綠體中，通過對(duì)f1f2雙缺突變體擬南芥短日照下生長(zhǎng)緩慢的現(xiàn)象研究證明f型是卡爾文循環(huán)酶快速還原的關(guān)鍵[3];如果缺失4類m型TRX，擬南芥光系統(tǒng)II則會(huì)明顯受損[4]，故目前普遍認(rèn)為f和m型可能在光合代謝途徑中有一定的作用。而o型主要分布在線粒體中，在對(duì)煙草o型TRX研究中發(fā)現(xiàn)TRX o1與GSH共同為DNA的復(fù)制提供一個(gè)有利的還原環(huán)境保護(hù)DNA，影響細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期[5]。x和y型則主要在質(zhì)體中分布，對(duì)y2擬南芥突變體研究則發(fā)現(xiàn)y2型TRX在光合器官中充當(dāng)質(zhì)體甲硫氨酸亞砜還原酶（MSR）的電子受體起修復(fù)蛋白功能[6];而x突變體表型與野生型擬南芥并無明顯差異，推測(cè)可能與其他類型TRX功能有重疊，可以彌補(bǔ)x型TRX的缺失[7]。

h型硫氧還蛋白在植物中存在種類最多，功能廣泛，可在種子萌發(fā)中起作用，減少小麥種子貯藏蛋白，促進(jìn)發(fā)芽[8];Liu等[9]在玉米中發(fā)現(xiàn)一個(gè)不具硫氧還蛋白通用活性位點(diǎn)半胱氨酸的蛋白ZmTrx h，其在抗甘蔗花葉病毒（sugarcane mosaic virus，SCMV）病毒中起作用，與水楊酸與茉莉酸相關(guān)的防御信號(hào)路徑?jīng)]有明顯聯(lián)系，而且不同等位基因存在差異，可能與基因上游不同轉(zhuǎn)座子的插入有關(guān);AtTrx h9被發(fā)現(xiàn)可在不同細(xì)胞之間流動(dòng)，推測(cè)其可能在細(xì)胞間信號(hào)傳遞發(fā)揮作用[10];AtTrx h3不僅具有氧化還原功能，還可以作為分子伴侶提高過表達(dá)擬南芥耐熱性[11]，h型硫氧還蛋白還可在水稻韌皮部通過胞間連絲實(shí)現(xiàn)細(xì)胞之間穿梭，激活RipAY，促進(jìn)GSH降低，進(jìn)而抑制植物抗病害的免疫反應(yīng)[12];過表達(dá)Trxs基因的（該基因與h型TRX同源性達(dá)94%）大麥會(huì)增加APX、CAT、GSH-PX等抗氧化酶活性，緩解根系蛋白質(zhì)和膜脂的氧化損傷，提高對(duì)鋁脅迫的抗性[13]，但是h型硫氧還蛋白在鋁脅迫中的作用及機(jī)制尚不清楚。

花生（Arachis hypogaea）屬油料作物和經(jīng)濟(jì)作物，在中國(guó)油料作物的種植規(guī)模方面僅次于油菜[14]，是我國(guó)重要的食用植物油來源。保障花生生產(chǎn)對(duì)我國(guó)植物油安全供給、滿足國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)需求具有重要意義。我國(guó)南北種植環(huán)境差異較大，形成南北不同的花生生產(chǎn)格局，南方土壤多以粘稠紅、黃壤為主，雨水較多，生態(tài)條件復(fù)雜，土壤貧瘠，多呈酸性，鋁（Al）在酸性條件下主要以Al3+形式存在，對(duì)作物產(chǎn)生毒害，毒害癥狀主要表現(xiàn)為植株矮小、葉片黃化、卷曲，出現(xiàn)類似缺乏營(yíng)養(yǎng)元素的癥狀，抑制根的生長(zhǎng)，引起細(xì)胞程序性死亡[15-16]，ROS大量積累，引起膜脂過氧化等[17]，影響花生等作物的生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)量及品質(zhì)。鋁脅迫導(dǎo)致的ROS積累、細(xì)胞程序性死亡是否受到TRX的調(diào)控需要進(jìn)行研究。

我們?cè)谇捌阡X處理轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，鋁處理下硫氧還蛋白基因表達(dá)水平會(huì)發(fā)生明顯變化，不同h硫氧還蛋白之間也存在差異（待發(fā)表），也說明花生TRX與鋁脅迫響應(yīng)有關(guān)。因此，本研究以鋁敏感性不同的2個(gè)花生品種為材料，克隆硫氧還蛋白基因，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，解析不同鋁處理時(shí)間下基因表達(dá)模式及亞細(xì)胞定位，誘導(dǎo)并測(cè)定其重組蛋白活性及修飾方式，篩選互作基因，為深入探討AhTRX h在花生鋁脅迫中的作用機(jī)制提供參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料與處理

試驗(yàn)材料為實(shí)驗(yàn)室前期篩選獲得的鋁敏感品種‘中花2號(hào)（‘ZH2號(hào)）、鋁耐性品種‘99- 1507[15， 18]。材料的培養(yǎng)方法參考詹潔等[19]的方法，當(dāng)幼苗長(zhǎng)出第3片葉時(shí)，用0.1 mmol/L CaCl2溶液（pH 4.2）預(yù)處理24 h后，再用0.1 mmol/L AlCl3溶液（含0.1 mmol/L CaCl2，pH 4.2）分別處理0、4、8、12、24 h;取根尖（約1 cm）速凍后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

試驗(yàn)所用克隆載體為pMD19T（TaKaRa），酵母雙雜載體為PGBKT7和PGADT（TaKaRa）;原核表達(dá)載體pGEX-6P-1和亞細(xì)胞定位載體pSAT6-EYFP-N1為實(shí)驗(yàn)室保存，感受態(tài)細(xì)胞自行制備保存。

1.2 ?RNA提取及基因克隆

RNA提取及cDNA的合成參照Liu等[20]的方法進(jìn)行。利用花生轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選獲得目的基因，并在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）查找獲得基因的CDS序列，利用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物（表1，小寫字母代表同源臂）。分別以‘中花2號(hào)和‘99-1507的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系包含1 ?L LA Tap、10 ?L 10×LA Tap Buffer II、16 ?L 2.5 mmol/L dNTP mixture、4 ?L Forward primer、4 ?L Reverse primer、4 ?L Tem-plate DNA，加水補(bǔ)到100 ?L。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)，并用DNA回收試劑盒（TIANGEN）回收目的片段;將目的片段連接至pMD19T，并轉(zhuǎn)化DH5α，挑選陽(yáng)性克隆送測(cè)（北京奧科鼎盛生物科技有限公司），保存測(cè)序正確菌液，完成克隆。

1.3 ?生物信息學(xué)分析

利用NCBI-BLAST （https：//blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi）查找與花生AhTRX h相似的序列，利用MEGA5軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，通過DNAMAN軟件分析保守序列，通過在線網(wǎng)站http：//ca.expasy. org/tools/myristoylator和http：//csspalm.biocuckoo. org分別預(yù)測(cè)AhTRX h氨基酸是否發(fā)生豆蔻?；妥貦磅；?/p>

1.4 ?亞細(xì)胞定位

亞細(xì)胞定位所用載體為帶黃綠色熒光蛋白的pSAT6-EYFP-N1質(zhì)粒，根據(jù)AhTRX h基因的全長(zhǎng)，以及載體序列，最終確定Xhol和Sal I兩個(gè)酶切位點(diǎn)，由CE Design V1設(shè)計(jì)引物（表1），利用ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit（南京諾唯贊生物科技有限公司）重組，得到AhTRX h-EYFP融合表達(dá)質(zhì)粒。

1.5 ?原生質(zhì)體的提取與瞬時(shí)轉(zhuǎn)化

參考Yoo等[21]方法提取原生質(zhì)體并瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。

1.6 ?AhTRX h蛋白的原核表達(dá)及活性測(cè)定

1.6.1 ?誘導(dǎo)表達(dá) ?構(gòu)建原核表達(dá)所用的載體為pGEX-6P-1，重組方法如1.4，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞Rosetta，37 ℃培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8，加入IPTG至0.1 mmol/L，在18 ℃條件下誘導(dǎo)蛋白，12 h后離心收集菌體，PBS重懸后超聲破碎，收集上清和沉淀，經(jīng)SDS-PAGE分離后，用考馬斯來亮藍(lán)染色40 min，脫色拍照，確定重組蛋白的表達(dá)形式。

1.6.2 ?蛋白純化與Western Blot驗(yàn)證 ?根據(jù)親和層析原理，參考GE公司Glutathione Sepharose 4B 填料說明手冊(cè)，進(jìn)行上清蛋白的鎳柱純化，并用抗GST標(biāo)簽鼠單克隆抗體和山羊抗小鼠IgG（H+L）驗(yàn)證。

1.6.3 ?重組蛋白的亞硝基化檢測(cè) ?參考Aimé等[22]的實(shí)驗(yàn)步驟及試劑配制方法對(duì)重組蛋白進(jìn)行體外亞硝基化驗(yàn)證。

1.7 ?AhTRX h自激活鑒定與酵母篩庫(kù)

根據(jù)AhTRX h基因的全長(zhǎng)，以及PGBKT7載體圖譜設(shè)計(jì)引物（表1），重組方法如1.4，最終將AhTRX h連接到PGBKT7載體。采用LiAC法轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞Y2HGold，以Y2H Gold [pGBKT7-53]和Y187[pGADT7-T] 為陽(yáng)性對(duì)照，以Y2H Gold[pGBKT7-Lam]和Y187[pGADT7-T]做陰性對(duì)照，驗(yàn)證AhTRX h-BD自激活性：轉(zhuǎn)化好的酵母細(xì)胞涂布到SD/-Trp （SDO）、SD/-Trp+ X-α-gal （SDO+X）、SD/-Trp+X-α-gal+AbA（SDO+ X+A），觀察酵母的生長(zhǎng)情況，如果酵母在SDO或SDO+X上生長(zhǎng)，但是在SDO+X+A沒有生長(zhǎng)，則代表此基因沒有自主激活的活性。利用‘ZH2號(hào)根尖構(gòu)建cDNA文庫(kù)（TaKaRa），按Clontech酵母操作說明篩選AhTRX h-BD可能的互作蛋白。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?AhTRX h基因克隆和生物信息學(xué)分析

以ZH2號(hào)cDNA為模板，擴(kuò)增獲得603 bp，連接pMD19-T，轉(zhuǎn)化并進(jìn)行PCR檢測(cè)（圖1A），以‘99-1507cDNA為模板擴(kuò)增得到的檢測(cè)結(jié)果見圖1B，位置與‘ZH2號(hào)的結(jié)果一致，挑陽(yáng)性克隆送測(cè)，比對(duì)測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從2個(gè)花生品種中獲得的序列完全一致（圖2），并且該序列含硫氧還蛋白保守結(jié)構(gòu)域（圖3）。在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，其與XM_025785254同源性高達(dá)100%，故將其命名為AhTRX h。為進(jìn)一步探究AhTRX h與其他物種h型硫氧還蛋白的進(jìn)化關(guān)系，利用MEGA5軟件對(duì)擬南芥、水稻、煙草、大豆、鷹嘴豆的核酸序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析。結(jié)果顯示（圖4），AhTRX h與AtTH9、CaTRX h在同一進(jìn)化支上，說明蝶形花亞科親緣關(guān)系較近，且AhTRX h與擬南芥TH9可能具有相近的基因功能。進(jìn)一步通過DNAMAN對(duì)上述物種的h型硫氧還蛋白進(jìn)行保守序列分析，發(fā)現(xiàn)AhTRX h與其他物種一致，含TRX家族保守的WCGPC活性中心五肽序列（圖3）。

2.2 ?AhTRX h基因在不同鋁處理時(shí)間下的表達(dá)

利用定量PCR檢測(cè)AhTRX h基因在不同抗鋁花生中的表達(dá)。由圖5可知，隨著鋁處理時(shí)間延長(zhǎng)，AhTRX h基因的表達(dá)量在2個(gè)品種中均呈先增加后降低再增加的趨勢(shì)，在0.1 mmol/L Al處理24 h后，AhTRX h表達(dá)量在2個(gè)品種中均達(dá)到最高。與無Al處理相比，‘ZH2號(hào)在Al處理24 h后AhTRX h表達(dá)量高達(dá)4倍之多;在同一Al時(shí)間下，與‘99-1507相比，AhTRX h在‘ZH2號(hào)中表達(dá)量變化更顯著。表明AhTRX h在花生響應(yīng)鋁脅迫中發(fā)揮作用。

2.3 ?AhTRX h蛋白定位

擬南芥原生質(zhì)體經(jīng)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，在激光共聚焦顯微鏡下觀察AhTRX h蛋白的定位，結(jié)果顯示，AhTRX h-pSAT6-EYFP-N1的融合蛋白在擬南芥只在葉綠體能觀察到強(qiáng)烈的綠色熒光信號(hào)，在葉綠體激發(fā)光下觀察發(fā)現(xiàn)信號(hào)重疊（圖6），表明AhTRX h蛋白定位在葉綠體中。

2.4 ?AhTRX h的蛋白活性

將AhTRX h全長(zhǎng)基因序列連接到pGEX-6P-1質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，表明獲得序列與原始序列一致，原核表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株Rosetta，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，取樣檢測(cè)，結(jié)果如圖7所示，沒有經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，沒有目的大小的蛋白表達(dá)，但是經(jīng)12 h低溫、低速以及IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，在43～55 kDa之間的位置出現(xiàn)一條特異條帶，由于GST標(biāo)簽大小約為29 kDa，所以AhTRX h蛋白的實(shí)際大小為43 kDa，與理論預(yù)測(cè)的AhTRX h蛋白大小一致，并且誘導(dǎo)得到的重組蛋白主要是以可溶性的形式存在于上清中。

為進(jìn)一步測(cè)定重組蛋白的活性，對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，結(jié)果顯示，經(jīng)谷胱甘肽洗脫后可得到條帶清晰的蛋白條帶（圖8），且經(jīng)GST抗體檢測(cè)有單一的特異性條帶，且位置正確（圖9），故得到AhTRX h的純化蛋白。將純化蛋白經(jīng)胰島素孵育測(cè)定活性，結(jié)果如圖10顯示，AhTRX h重組蛋白在650 nm處有吸收峰，并隨著時(shí)間發(fā)生變化，證明AhTRX h重組蛋白在體外有活性，但是在體外亞硝基化檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)AhTRX h重組蛋白并沒有明顯的亞硝基化趨勢(shì)（圖11）。

2.5 ?AhTRX h互作蛋白的篩選

為了驗(yàn)證AhTRX h蛋白在酵母中是否具自激活性，利用LiAc法將AhTRX h-BD轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，如圖13所示，轉(zhuǎn)化AhTRX h-BD的酵母細(xì)胞在SDO培養(yǎng)基上能生長(zhǎng)（圖12A），在SDO/X培養(yǎng)基上長(zhǎng)淺藍(lán)色菌落（圖12B），但是不能在SDO/X/ A中生長(zhǎng)（圖12C），陽(yáng)性對(duì)照在SDO/X/A生長(zhǎng)，陰性對(duì)照在SDO/X/A不生長(zhǎng)相比較，表明AhTRX h蛋白沒有自主激活活性。

為研究AhTRX h蛋白參與的信號(hào)通路，利用LiAc轉(zhuǎn)化酵母的方法對(duì)AhTRX h-PGBKT7基因進(jìn)行篩庫(kù)，通過PCR驗(yàn)證陽(yáng)性菌株（圖13），并測(cè)序比對(duì)，獲得目的基因：calreticulin（LOC112775527）和metallothionein-like protein 2（LOC112716772），表明2個(gè)基因在花生響應(yīng)鋁脅迫中起重要作用。

A：轉(zhuǎn)AhTRX h-BD質(zhì)粒的Y2HGold在SD-Trp（SDO）的生長(zhǎng)情況;B：轉(zhuǎn)AhTRX h-BD質(zhì)粒的Y2HGold在SDO/X的生長(zhǎng)情況;C：轉(zhuǎn)AhTRX h-BD質(zhì)粒的Y2HGold在SDO/X/A的生長(zhǎng)情況。

3 ?討論

通過NCBI比對(duì)，克隆到的AhTRX h與XM_025785254的同源性高達(dá)100%，表明屬于h型硫氧還蛋白。在進(jìn)化樹分析中，AhTRX h與AtTH9、CaTRX h在同一進(jìn)化支上，說明蝶形花亞科親緣關(guān)系較近，且AhTRX h與擬南芥TH9可能具有相近的基因功能。

硫氧還蛋白依賴于保守活性位點(diǎn)催化硫醇-二硫化物發(fā)生氧化還原反應(yīng)，可調(diào)控多個(gè)代謝途徑，在維持細(xì)胞氧化還原狀態(tài)中發(fā)揮重要作用[23]，脅迫條件下植物通常會(huì)產(chǎn)生大量H2O2以及其他活性氧來保護(hù)自身免受氧化脅迫造成的傷害[24]，花生經(jīng)0.1 mmol/L鋁處理后會(huì)導(dǎo)致O2-和H2O2大量積累[17]，鋁處理也會(huì)刺激AhTRX h表達(dá)水平顯著增加，表明AhTRX h在鋁脅迫下通過提高轉(zhuǎn)錄水平來作出響應(yīng)，推測(cè)其可能通過控制硫氧還蛋白含量以及通過不同修飾方式調(diào)控靶蛋白參與調(diào)控ROS水平等來緩解鋁脅迫下受到的氧化脅迫，響應(yīng)鋁脅迫。同時(shí)，AhTRX h重組蛋白在體外測(cè)定具有活性，推測(cè)其在花生體內(nèi)可通過活性位點(diǎn)來發(fā)揮作用，是有活性的一類h型硫氧還蛋白。由于在對(duì)AhTRX h重組蛋白體外亞硝基化檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)沒有明顯的發(fā)生亞硝基化趨勢(shì)，那么亞硝基化應(yīng)不是AhTRX h主要的翻譯后修飾方式，但是在對(duì)Trx h5功能的探究中，發(fā)現(xiàn)其可以調(diào)控一些轉(zhuǎn)錄激活因子的亞硝基化水平，如使NPR1去亞硝基化生成單體形式影響植物的免疫反應(yīng)[25]。Trx h1還可減少鳥苷酸環(huán)化酶半胱氨酸亞硝基化，進(jìn)而降低氧化或亞硝基化脅迫[26]。所以，盡管沒有檢測(cè)到AhTRX h發(fā)生亞硝基化，那么其是否也有可能以去亞硝基化或轉(zhuǎn)亞硝基化方式在脅迫中起作用？同時(shí)Meng等[10]發(fā)現(xiàn)，AtTH9在N端具保守的位點(diǎn)WGS（/L/G）C，其中甘氨酸位點(diǎn)可能發(fā)生豆蔻酰基化，還預(yù)測(cè)靠近N端的半胱氨酸位點(diǎn)也可能發(fā)生棕櫚?；确g后修飾，考慮到相近的親緣關(guān)系，分析AhTRX h氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)AhTRX h的N端同樣具G和C兩個(gè)保守位點(diǎn)，經(jīng)在線網(wǎng)站（http：//ca.expasy.org/tools/myristoylator）預(yù)測(cè)其可能發(fā)生豆蔻?；姆种蹈哌_(dá)0.955，在CSS-PALM（http：//csspalm.biocuckoo.org）預(yù)測(cè)棕櫚酰化發(fā)生的分值高達(dá)41.84，故AhTRX h雖不發(fā)生亞硝基化，那么是否也極有可能發(fā)生豆蔻?；妥貦磅；瘉韰⑴c代謝途徑。但需要進(jìn)一步研究。

不同類型及不同物種中的h型硫氧還蛋白在細(xì)胞內(nèi)分布不同，OsTrx h1多分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核[27]，但也有報(bào)道OsTrx h1分布在水稻的質(zhì)外體中[28]，OsTrx h4多分布在細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[27]，ZmTrx h分布在細(xì)胞質(zhì)[29]，而AhTRX h定位于葉綠體，也許會(huì)影響光系統(tǒng)發(fā)揮作用。這也證實(shí)h型種類繁多，可位于不同細(xì)胞器發(fā)揮作用，參與不同細(xì)胞作用途徑。

鈣網(wǎng)蛋白（CRT）是一類內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣結(jié)合蛋白，存在于藻類到高等植物中。鈣網(wǎng)蛋白依據(jù)其氨基酸序列多數(shù)可分為含信號(hào)肽的N端結(jié)構(gòu)域、富含脯氨酸的P結(jié)構(gòu)域、富含酸性氨基酸的C端結(jié)構(gòu)域[30]3個(gè)結(jié)構(gòu)域，過表達(dá)小麥CRT基因的煙草植株對(duì)干旱抗性增強(qiáng)，并且C端區(qū)域在抗旱中發(fā)揮主要作用，含更多的抗氧化酶[31]。植物CRTs同樣具有結(jié)合Ca2+的能力，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平，對(duì)冷害和干旱脅迫等逆境作出響應(yīng)[32-33]。金屬硫蛋白與生物體重金屬脅迫密切相關(guān)[34]，是一類富含半胱氨酸熱穩(wěn)定的小分子蛋白，不僅在基本金屬元素的過量清除和非必需金屬元素清除中起作用[35]，也被認(rèn)為在抗氧化過程和清除自由基的進(jìn)程中起作用[36]，所以AhTRX h也可能通過與鈣網(wǎng)蛋白和金屬硫蛋白相互作用，提高花生鋁毒的抗氧化水平，減少鋁毒產(chǎn)生的氧化脅迫。

4 ?結(jié)論

本研究從花生栽培種中克隆到硫氧還蛋白家族的一個(gè)成員AhTRX h，其氨基酸富含WCGPC活性中心，是一類定位于葉綠體且有活性的蛋白質(zhì)。在鋁脅迫下，AhTRX h轉(zhuǎn)錄水平明顯提高，可能與鈣網(wǎng)蛋白、金屬硫蛋白互作，一方面調(diào)控鋁脅迫下的抗氧化水平，另一方面激活花生體內(nèi)鋁解毒系統(tǒng);盡管體外驗(yàn)證亞硝基化不是其翻譯后修飾方式，但其可能發(fā)生棕櫚?；投罐Ⅴ；诨ㄉX脅迫中發(fā)揮作用。

參考文獻(xiàn)

[1] Suzuki N， Koussevitzky S， Mittler R， et al. Invited review ROS and redox signalling in the response of plants to abiotic stress[J]. Plant Cell and Environment， 2012， 35： 259-270.

[2] Zaffagnini M， Fermani S， Marchand C H， et al. Redox ho-meostasis in photosynthetic organisms： novel and established thiol-based molecular mechanisms[J]. Antioxid Redox Signal， 2019， 31（3）： 155-210.

[3] Naranjo B， Diaz-Espejo A， Lindahl M， et al. Type-f thiore-doxins have a role in the short-term activation of carbon metabolism and their loss affects growth under short-day conditions in Arabidopsis thaliana[J]. Journal of Experimental Botany， 2016， 67（6）： 1951-1964.

[4] Wang P， Liu J， Liu B， et al. Evidence for a role of chlorop-lastic m-type thioredoxins in the biogenesis of photosystem II in Arabidopsis[J]. Plant Physiology， 2013， 163（4）： 1710-1728.

[5] Calderóna A， Ortiz-Espína A， Iglesias-Fernándezb R， et al. Thioredoxin （TRXo1） interacts with proliferating cell nuc-lear antigen （PCNA） and its overexpression affects the growth of tobacco cell culture[J]. Redox Biology， 2017， 11： 688-700.

[6] Laugier E， Tarrago L， Courteille A， et al. Involvement of thioredoxin y2 in the preservation of leaf methionine sulfoxide reductase capacity and growth under high light[J]. Plant Cell and Environment， 2012， 36（3）： 670-682.

[7] Pulido P， Spínola M C， Kirchsteiger K， et al. Functional analysis of the pathways for 2-Cys peroxiredoxin reduction in Arabidopsis thaliana chloroplasts[J]. Journal of Experi-mental Botany， 2010， 61（14）： 4043-4054.

[8] Kobrehel K， Wong J H， Balogh A， et al. Specific reduction of wheat storage proteins by thioredoxin H[J]. Plant Physiology， 1992， 99（3）： 919-924.

[9] Liu Q Q， Liu H H， Gong Y Q， et al. An atypical thioredoxin imparts early resistance to sugarcane mosaic virus in ma-ize[J]. Molecular Plant， 2017， 10（3）： 483-497.

[10] Meng L， Wong J H， Feldman L J， et al. A mem-brane-associated thioredoxin required for plant growth moves from cell to cell， suggestive of a role in intercellular communication[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2010， 107（8）： 3900-3905.

[11] Park S K， Jung Y J， Lee J R， et al. Heat-shock and re-dox-dependent functional switching of an h-type Arabidopsis thioredoxin from a disulfide reductase to a molecular chaperone[J]. Plant Physiology， 2009， 150（2）： 552-561.

[12] Ishiwatari Y， Fujiwara T， Mcfarland K C， et al. Rice phloem thioredoxin h has the capacity to mediate its own cell-to-cell transport through plasmodesmata[J]. Planta， 1998， 205（1）： 12-22.

[13] 李巧云， 牛洪斌， 王孟本， 等. 過量表達(dá)Trxs對(duì)鋁脅迫下轉(zhuǎn)基因大麥幼苗根系抗氧化酶系的影響[J]. 麥類作物學(xué)報(bào)， 2007， 27（6）： 1111-1116.

[14] 魯 ?清， 李少雄， 陳小平， 等. 我國(guó)南方產(chǎn)區(qū)花生育種現(xiàn)狀、存在問題及育種建議[J]. 中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)， 2017， 39（4）： 556-566.

[15] Huang W J， Oo T L， He H Y， et al. Aluminum induces rapidly mitochondria-dependent programmed cell death in Al-sensitive peanut root tips[J]. Botanical Studies， 2014， 55（1）： 67.

[16] He H， Huang W， Oo T L， et al. Nitric oxide inhibits alumi-num-induced programmed cell death in peanut （Arachis hy-poganea L.） root tips[J]. Journal of Hazardous Materials， 2017， 333： 285-292.

[17] Pan C L， Yao S C， Xiong W J， et al. Nitric oxide inhibits Al-induced programmed cell death in root tips of peanut （Arachis hypogaea L.） by affecting physiological properties of antioxidants systems and cell wall[J]. Frontiers in Physi-ology， 2017， 8： 1037.

[18] Zhan J， He H Y， Wang T J， et al. Aluminum-induced pro-grammed cell death promoted by AhSAG， a senes-cence-associated gene in Arachis hypoganea L.[J]. Plant Science， 2013， 210： 108-117.

[19] 詹 ?潔， 寇瑞杰， 何龍飛. 鋁對(duì)花生根尖細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響[J]. 中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)， 2008， 30（1）： 79-83.

[20] Liu D， Gong Q Q， Ma Y Y， et al. cpSecA， a thylakoid pro-tein translocase subunit， is essential for photosynthetic development in Arabidopsis[J]. Journal of Experimental Botany， 2010， 61（6）： 1655-1669.

[21] Yoo S D， Cho Y H， Sheen J. Arabidopsis mesophyll protop-lasts： a versatile cell system for transient gene expression analysis[J]. Nature Protocols， 2007， 2（7）： 1565-1572.

[22] Aimé S， Hichami S， Wendehenne D， et al. Analysis of re-combinant protein S-nitrosylation using the biotin-switch technique[J]. Methods in Molecular Biology， 2018， 1747： 131-141.

[23] Potters G， Horemans N， Jansen M A. The cellular redox state in plant stress biology： a charging concept[J]. Plant Physiology & Biochemistry， 2010， 48（5）： 292-300.

[24] Blokhina O， Fagerstedt K V. Reactive oxygen species and nitric oxide in plant mitochondria： origin and redundant regulatory systems[J]. Physiologia Plantarum， 2010， 138（4）： 447-462.

[25] Kneeshaw S， Gelineau S， Tada Y， et al. Selective protein denitrosylation activity of thioredoxin-h 5 modulates plant immunity[J]. Molecular Cell， 2014， 56（1）： 153-162.

[26] Huang C， Alapa M， Shu P， et al. Guanylyl cyclase sensitiv-ity to nitric oxide is protected by a thiol oxidation-driven interaction with thioredoxin-1[J]. Journal of Biological Chemistry， 2017， 292（35）： 14362-14370.

[27] Ying Y H， Yue W H， Wang S D， et al. Two h-type thioredox-ins interact with the E2 ubiquitin conjugase PHO2 to fine-tune phosphate homeostasis in rice[J]. Plant Physiology， 2017， 173（1）： 812-824.

[28] Zhang C J， Zhao B C， Ge W N， et al. ?An apoplastic h-type thioredoxin is involved in the stress response through regulation of the apoplastic reactive oxygen species in rice[J]. Plant Physiology， 2012， 157（4）：1884-1899.

[29] Sun L J， Ren H Y， Liu R X， et al. An h-type thioredoxin functions in tobacco defense responses to two species of viruses and an abiotic oxidative stress[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions， 2010， 23（11）： 1470-1485.

[30] Joshi R， Paul M， Kumar A， et al. Role of calreticulin in biotic and abiotic stress signalling and tolerance mechanisms in plants[J]. Gene， 2019， 714： 144004.

[31] Xiang Y， Lu Y H， Song M， et al. Overexpression of a Triti-cum aestivum calreticulin gene （TaCRT1） improves salinity tolerance in tobacco[J]. PLoS One， 2015， 10（10）： e0140591.

[32] Saijo Y， Tintor N， Lu X， et al. Receptor quality control in the endoplasmic Reticulum for plant innate immunity[J]. EMBO Journal， 2009， 28（21）： 3439-3449.

[33] Jia X Y， Xu C Y， Jing R L， et al. Molecular cloning and characterization of wheat calreticulin （CRT） gene involved in drought-stressed responses[J]. Journal of Experimental Botany， 2008， 59（4）： 739-751.

[34] Machreki-Ajmi M， Ketata I， Ladhar-Chaabouni R， et al. The effect of in situ cadmium contamination on some bio-markers in Cerastoderma glaucum[J]. Ecotoxicology， 2008， 17（1）： 1-11.

[35] Vasák M. Advances in metallothionein structure and func-tions[J]. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology， 2005， 19（1）： 13-17.

[36] Viarengo A， Lowe D， Bolognesi C， et al. The use of bio-markers in biomonitoring： a 2-tier approach assessing the level of pollutant-induced stress syndrome in sentinel organisms[J]. Comparative Biochemistry and Physiology， 2007， 146（3）： 281-300.

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