椰子球蛋白多肽-亞鐵螯合物的制備工藝

鄭亞軍 史攀琪 王國龍 王賢 李艷 劉樂 李桂峰

摘 ?要：為提高椰子加工副產(chǎn)物的利用， 對椰子球蛋白進(jìn)行限制性水解制備多肽，并采用Sephadex G-25凝膠柱層析對多肽進(jìn)行純化，然后以椰子球蛋白多肽為原料與亞鐵離子反應(yīng)制備肽-亞鐵離子螯合物。重點(diǎn)分析水解度、溫度等因素對椰子球蛋白多肽亞鐵離子絡(luò)合能力的影響，并優(yōu)化制備工藝。結(jié)果表明，用堿性蛋白酶結(jié)合風(fēng)味蛋白酶制備的多肽的水解度最高（14.71%），產(chǎn)物的亞鐵離子螯合能力也最高（24.66%）;Sephadex G-25凝膠柱層析中分離出3個(gè)多肽組分，其中組分C的絡(luò)合能力最高（28.67%）;椰子球蛋白多肽C螯合亞鐵離子最佳條件是多肽濃度1 mg/mL、40 ℃、 pH 7.0、亞鐵離子濃度0.5 mg/mL、時(shí)間0.5 h，此時(shí)螯合率為30.67%。熒光光譜、紅外光譜等分析表明，椰子球蛋白多肽通過氨基、羧基和亞甲基與亞鐵離子配位而形成螯合物。研究結(jié)果表明，用椰子球蛋白多肽為原料制備肽-亞鐵螯合物切實(shí)可行，該螯合物可以應(yīng)用于功能食品中來改善鐵營養(yǎng)缺乏。

關(guān)鍵詞：椰子球蛋白;多肽-亞鐵螯合物;制備;Sephadex G-25凝膠色譜;優(yōu)化

中圖分類號：S667.4;TS255.4 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Abstract： To improve the utilization of coconut processing byproduct， peptides were obtained from coconut globulin using limited enzymatic hydrolysis technology and purified by Sephadex G-25 chromatography in this study. Then the selected coconut globulin peptides were reacted with ferrous to prepare peptides-ferrous chelate. The effects of hydro-lysis degree， pH， time， ferrous ion concentration and temperature on the chelating ability of coconut globulin peptides were studied. Moreover， the chelating conditions were optimized using an orthogonal test. Results showed that both hydrolysis degree （14.71%） and ferrous chelating ratio （24.66%） were the highest when coconut globulin was hydro-lyzed by alcalase and flavourzyme. There were three peptides peaks through Sephadex G-25 chromatography， of which the fraction C showed the highest chelating ability （28.67%）. The result of the orthogonal test demonstrated that the optimum preparation conditions were peptide concentration 1.0 mg/mL， 40 ℃， 0.5 h， pH 7.0 and ferrous ion concentration 0.5 mg/mL， then the chelating ratio of coconut globulin peptides was 30.67%. The results of fluorescence spectroscopy and infrared spectroscopy indicated that coconut globulin peptide could chelate iron with amino groups， carboxyl groups and methylene groups. The results showed that it is feasible to prepare peptide-iron chelate using co-conut globulin. Moreover， the coconut globulin peptide-iron chelate could be used as functional food ingredient to im-prove iron deficiency status.

Keywords： coconut globulin; peptide-ferrous chelate; preparation; Sephadex G-25 chromatography; optimum

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.05.038

鐵是機(jī)體正常生命活動中必不可少的微量元素，當(dāng)機(jī)體對鐵的需求量增加，而機(jī)體本身鐵的含量無法完全滿足正常紅細(xì)胞的生成，就使得血清中的鐵濃度以及鐵蛋白同時(shí)發(fā)生下降的情況，從表面可觀察到皮膚系統(tǒng)以及黏膜沒有血色等貧血表現(xiàn)[1]。缺鐵性貧血是當(dāng)前全人類面臨的營養(yǎng)問題之一。由于食物中的鐵主要以三價(jià)鐵形式存在，在體內(nèi)的吸收利用率低，因此改善缺鐵性貧血的有效方法是攝入適量的補(bǔ)鐵劑。補(bǔ)鐵劑從早期對人體刺激大、吸收效果差的無機(jī)鹽補(bǔ)鐵劑，逐漸發(fā)展成為現(xiàn)在無毒副作用、吸收作用較好的生物性補(bǔ)鐵劑[2]。其中，食源性肽-亞鐵螯合物由于能夠保證鐵以亞鐵離子的形式被機(jī)體吸收，同時(shí)具有干擾小、能耗低、吸收途徑獨(dú)特、無毒副作用、來源廣泛和成本低等優(yōu)點(diǎn)，成為最具潛力的新型補(bǔ)鐵劑[3]。椰子（Cocos nucifera L.）為木本油料作物之一，是來源豐富的植物蛋白質(zhì)資源。球蛋白在椰子蛋白質(zhì)中占61%，由于其富含含硫氨基酸、絲氨酸和二硫鍵，更兼產(chǎn)量巨大，因此椰子球蛋白是制備肽-亞鐵螯合物的潛在原料。然而，目前國內(nèi)外對于椰子球蛋白多肽-亞鐵螯合物制備工藝的相關(guān)研究極少[4-7]。本研究采用復(fù)合酶法水解椰子球蛋白，采用凝膠色譜技術(shù)對酶解多肽進(jìn)行分離純化和篩選，以活性最高的多肽制備肽-亞鐵螯合物，通過單因素試驗(yàn)分析水解度、溫度、pH、時(shí)間、亞鐵離子濃度對絡(luò)合率的影響，并以正交試驗(yàn)優(yōu)化其制備工藝。此項(xiàng)研究，可以有效提高椰子副產(chǎn)物的利用率，具有良好的應(yīng)用前景。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?材料與試劑 ?植物原料：脫脂椰麩，購于海南文昌南椰食品有限公司。

主要試劑：考馬斯亮藍(lán)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化亞鐵、鹽酸羥胺、鄰菲啰啉、乙酸鈉等均為分析純，上海素培生物科技有限公司;堿性蛋白酶（200 U/mg）、木瓜蛋白酶（800 U/mg）、風(fēng)味蛋白酶（20 U/mg）、胰蛋白酶（250 U/mg）、溴化鉀（光譜級）和維生素C，上海源葉生物科技有限公司。

1.1.2 ?儀器與設(shè)備 ?H-2恒流泵，上海滬西儀器設(shè)備有限公司;PHS-3CpH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;SHA-B雙功能數(shù)顯恒溫震蕩器，湖南衡陽儀器有限公司;TGL-15B離心機(jī)，山東博客儀器有限公司;101-3AB干燥箱，天津創(chuàng)新儀器有限公司;UV-1800PC紫外可見分光光度計(jì)，北京析元儀器有限公司;F9700熒光分光光度計(jì)，天津里安精密儀器公司;660 IR傅里葉變換紅外光譜儀，美國Varian公司。

1.2 ?方法

1.2.1 ?椰子球蛋白的提取 ?參考Li等[7]的方法，將脫脂椰麩在45 ℃下干燥，粉碎，過100目篩，得到脫脂椰麩粉。取50 g脫脂椰麩粉，加入500 mL濃度為0.4 mol/L NaCl溶液，35 ℃下攪拌提取2 h，過濾，重復(fù)提取3次，將合并的濾液在12 000 r/min下離心20 min，收集上清液，裝入透析袋（MW為3500 Da）中，4 ℃下透析24 h，每隔2 h換一次蒸餾水（dH2O）。將透析后的蛋白液冷凍干燥，得到椰子球蛋白（coconut globulin， CG）。蛋白濃度的測定采用考馬斯亮藍(lán)法[8]。

1.2.2 ?椰子球蛋白多肽的制備及各種酶的影響 ?參考Li等[6]的方法，取等份的椰子球蛋白溶液（2 g/100 mL），分別用堿性蛋白酶（Alcalase）、胰蛋白酶（Trypsin）、木瓜蛋白酶（Papain）和復(fù)合酶（堿性蛋白酶+風(fēng)味蛋白酶）水解120 min，然后在100 ℃加熱10 min以滅酶，冷卻至室溫后，將水解液離心（12 000 r/min，15 min），收集上清液。取6 mL上清液，用甲醛滴定法測定水解度[9]。同時(shí)，將上清液真空冷凍干燥后即得到椰子球蛋白多肽（coconut globulin peptides， CGP）。比較各種酶制備椰子球蛋白多肽的水解度和亞鐵離子螯合率，選擇螯合能力最強(qiáng)的椰子球蛋白水解肽進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.2.3 ?椰子球蛋白多肽的純化 ?參考文獻(xiàn)[9]進(jìn)行椰子球蛋白多肽的純化。將復(fù)合酶水解制備的椰子球蛋白多肽復(fù)溶于蒸餾水中（1 mg/mL），使其在Sephadex G-25凝膠柱層析系統(tǒng)中進(jìn)行分離純化。將Sephadex G-25浸泡于dH2O中，65 ℃下放置48 h，然后加入NaCl 溶液（0.4 mol/L），平衡24 h。超聲波脫氣20 min后，裝入層析柱（1.6 cm×100 cm）中，流動相為0.4 mol/L NaCl溶液，流速0.8 mL/min，平衡24 h后，上樣1～2 mL。每5 min收集1次，檢測波長220 nm，繪制洗脫曲線。將各峰分別收集，冷凍干燥后，測定各組椰子球蛋白多肽對亞鐵離子的螯合能力，以螯合能力最高的椰子球蛋白多肽為原料，制備多肽-亞鐵螯合物。

1.2.4 ?亞鐵離子螯合率的測定方法 ?采用鄰菲啰啉比色法[10]，取0.5 mL樣品加入9.5 mL蒸餾水，之后加入0.01 g維生素C、1 mg/mL氯化亞鐵溶液，在一定水浴溫度下螯合60 min。取出后從中吸取100 μL，稀釋50倍，取1 mL稀釋液置于50 mL容量瓶中，依次加入1 mol/L鹽酸1 mL、10%鹽酸羥胺1 mL、0.12%鄰菲啰啉1 mL、10%乙酸鈉5 mL，用蒸餾水定容，于510 nm 處比色?？瞻讓φ沼谜麴s水替代樣品，樣品對照組用蒸餾水替代氯化亞鐵。

式中：A1為樣品組吸光值;A2為樣品對照組吸光值;A0為空白對照組吸光值。

1.2.5 ?單因素試驗(yàn) ?（1）不同溫度對椰子球蛋白多肽螯合亞鐵離子能力的影響。取等份的椰子球蛋白多肽溶液（1 g/100 mL），加入氯化亞鐵溶液（0.5 mg/mL），在pH 8.0、不同溫度（20、30、40、50、60 ℃）下反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后測定反應(yīng)液中游離亞鐵離子的濃度，考察溫度對螯合率的影響。

（2）不同pH對椰子球蛋白多肽螯合亞鐵離子能力的影響。取等份的椰子球蛋白多肽溶液（1 g/100 mL），用0.1 mol/L NaOH或0.1 mol/L HCl分別滴定至pH 6.0、7.0、8.0、9.0、10.0后，各加入氯化亞鐵溶液（0.5 mg/mL），攪拌均勻，在40 ℃下反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后測定反應(yīng)液中游離亞鐵離子的濃度，測定不同pH對螯合率的影響。

（3）不同亞鐵離子濃度對椰子球蛋白多肽螯合亞鐵離子能力的影響。取等份的椰子球蛋白多肽溶液（1 g/100 mL），分別加入濃度為0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mg/mL的氯化亞鐵溶液，攪拌均勻后，置于恒溫振蕩器中，在40 ℃、pH 8.0下反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后測定反應(yīng)液中游離亞鐵離子的濃度，測定不同亞鐵離子濃度下椰子球蛋白多肽對亞鐵離子的螯合率。

（4）不同時(shí)間對椰子球蛋白多肽螯合亞鐵離子能力的影響。取等份的椰子球蛋白多肽溶液（1 g/100 mL），加入氯化亞鐵溶液（0.5 mg/mL），在40 ℃、pH 8.0下分別反應(yīng)30、60、90、120、150 min，反應(yīng)結(jié)束后測定反應(yīng)液中游離亞鐵離子的濃度。

1.2.6 ?椰子肽-亞鐵螯合物制備工藝的優(yōu)化 ?在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗(yàn)對椰子肽-亞鐵螯合物的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，各因素水平見表1。

1.2.7 ?椰子肽-亞鐵螯合物的性質(zhì)鑒定 ?按照1.2.6中所得最佳工藝條件，將椰子球蛋白多肽組分C與FeCl2螯合來制備椰子肽-亞鐵螯合物，冷凍干燥后，用于性質(zhì)分析與鑒定。

（1）紫外光譜掃描。參考文獻(xiàn)[11]進(jìn)行，分別對椰子多肽溶液（1 mg/mL）和椰子肽-亞鐵螯合物溶液（1 mg/mL）進(jìn)行紫外光譜掃描，波長范圍190～390 nm。

（2）熒光光譜掃描。分別對椰子多肽組分C和肽-亞鐵螯合物進(jìn)行熒光掃描。激發(fā)波長280 nm，掃描波長范圍為300～600 nm，激發(fā)和發(fā)射光狹縫分別為10 nm和5 nm。

（3）傅里葉變換紅外光譜掃描。參考文獻(xiàn)[2]進(jìn)行，取約0.2 mg椰子多肽和肽-亞鐵螯合物粉末，分別與干燥的KBr（約200 mg）混合、研磨，壓制成厚度約為1 mm的透明薄片，然后在傅里葉紅外光譜儀上進(jìn)行掃描，掃描范圍4000～ 400 cm?1。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

采用DPS 7.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，各實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，取平均值，多重比較采用鄧肯新復(fù)極差法。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?不同酶對椰子球蛋白水解度的影響

各種酶對椰子球蛋白的水解度與亞鐵離子螯合能力的影響見圖1。從圖1可以看出，所用5種酶中，用胰蛋白酶水解椰子球蛋白時(shí)所得水解物的水解度和亞鐵離子螯合能力最低;而采用復(fù)合酶（A+F）對椰子球蛋白進(jìn)行水解時(shí)，水解程度最高，水解產(chǎn)物的亞鐵離子螯合能力也最高。這可能是因?yàn)椋鹊鞍酌笩o法有效水解椰子球蛋白的氨基酸鏈，不能使鏈上的活性基團(tuán)充分暴露，從而使椰子球蛋白水解物表現(xiàn)出較低的絡(luò)合能力。而堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶分別屬于內(nèi)肽酶和外切酶，能夠分別從不同位點(diǎn)對椰子球蛋白的氨基酸鏈進(jìn)行水解，釋放出更多的活性片段，從而表現(xiàn)出較高的水解度和亞鐵離子螯合能力。

此外，分別單獨(dú)使用堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶時(shí)，椰子球蛋白的水解度和亞鐵離子螯合能力都明顯低于采用復(fù)合酶（A+F）時(shí)的。這表明堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶在水解椰子球蛋白時(shí)，可能有協(xié)同效應(yīng)。段秀[2]的研究也表明，羅非魚蛋白經(jīng)復(fù)合酶堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶水解后，釋放出大量的谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸，由于這些氨基酸具有大量的側(cè)鏈羧基，容易螯合金屬離子，因此使酶解產(chǎn)物的金屬螯合能力極大地提高。因此，選擇復(fù)合酶（A+F）為水解椰子球蛋白時(shí)的最佳酶。

2.2 ?椰子球蛋白多肽的純化

由圖2可知，椰子球蛋白多肽在Sephadex G-25凝膠柱層析中分離為3個(gè)組分：A、B和C。其各自的亞鐵離子螯合率分別為19.35%、22.43%和28.67%，因此選擇組分C為制備肽-亞鐵螯合物的原料。由于Sephadex G-25凝膠柱層析中決定蛋白質(zhì)流出次序的主要是分子量差異，即分子量較大的先被洗出，而分子量較小的后被洗出，因此組分C的分子量最小。研究表明，影響多肽螯合金屬離子能力的因素主要是其多肽鏈上氨基酸序列和分子量[11]。例如，當(dāng)多肽鏈上谷氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸含量較高時(shí)，多肽的羧基或巰基數(shù)量較多，這些基團(tuán)能夠直接或者通過氫鍵與亞鐵離子連接在一起，形成螯合物[12]?，F(xiàn)有的研究表明，具有螯合活性的多肽大多數(shù)是分子量較小的三肽和四肽。本研究的結(jié)果再次驗(yàn)證了這一點(diǎn)。

2.3 ?椰子肽-亞鐵螯合物制備工藝單因素試驗(yàn)

2.3.1 ?pH對椰子球蛋白多肽與亞鐵離子螯合率的影響 ?從圖3看出，在pH 5.0～7.0時(shí)，隨著pH的升高，椰子球蛋白多肽的亞鐵離子螯合能力隨之變大，并在pH7.0時(shí)達(dá)到最高值。而在pH 7.0～ 9.0的范圍內(nèi)，隨著pH的升高，椰子球蛋白多肽的亞鐵離子螯合能力反而下降。pH對多肽亞鐵離子螯合率的影響主要通過3個(gè)方面進(jìn)行：（1）pH變化對蛋白質(zhì)溶解度的影響。椰子球蛋白為鹽溶性蛋白，pH較低時(shí)其溶解度較低;而當(dāng)pH從5.0升高到7.0時(shí)，椰子球蛋白的溶解度增大，有更多的椰子球蛋白質(zhì)分子與亞鐵離子反應(yīng)中，從而表現(xiàn)出更高的螯合率。（2）pH變化對亞鐵離子的影響。在pH 5.0時(shí)，反應(yīng)體系中的H+會與Fe2+爭奪多肽的供電子基團(tuán)，導(dǎo)致螯合率較低;隨著pH的升高，參與爭奪的H+逐漸減少，使多肽對亞鐵離子的螯合能力提高;而當(dāng)pH升高到8.0～ 9.0時(shí)，OH?逐漸等多。OH?與Fe2+反應(yīng)形成金屬鹽沉淀，導(dǎo)致亞鐵離子不能螯合到多肽鏈上，降低螯合率[13]。（3）pH對螯合反應(yīng)體系中重要穩(wěn)定劑維生素C（Vc）的影響。Vc是良好的還原劑，可以使反應(yīng)體系中的鐵離子保持在二價(jià)鐵狀態(tài)。Vc在弱酸性條件下穩(wěn)定，但在堿性環(huán)境中容易失活，失去穩(wěn)定亞鐵離子的功能。在pH 8.0～9.0時(shí)，Vc失活，大量Fe2+被氧化為Fe3+，導(dǎo)致椰子球蛋白多肽與Fe2+的絡(luò)合率下降。因此，在這3方面的綜合作用下，椰子球蛋白多肽的亞鐵離子螯合能力在pH 7.0時(shí)最高。

2.3.2 ?螯合溫度對椰子球蛋白多肽與亞鐵離子螯合率的影響 ?由圖4可知，溫度從20 ℃升高至30 ℃時(shí)，椰子球蛋白多肽對亞鐵離子的螯合率呈現(xiàn)出上升趨勢，說明溫度適當(dāng)提高可增加椰子球蛋多肽與亞鐵離子的相互作用，有效提高螯合率。而在30～60 ℃的范圍內(nèi)，隨著溫度繼續(xù)升高，椰子球蛋白多肽對亞鐵離子的螯合率降低，可能是由于溫度升高，維系亞鐵離子價(jià)態(tài)穩(wěn)定的重要物質(zhì)Vc被破壞，使Fe2+被氧化為Fe3+，螯合率下降[3]。

2.3.3 ?反應(yīng)時(shí)間對椰子球蛋白多肽與亞鐵離子螯合率的影響 ?由圖5可知，反應(yīng)時(shí)間從0 h到1 h，椰子球蛋白多肽對亞鐵離子的螯合率隨時(shí)間延長而升高;在1.0～2.5 h內(nèi)，椰子球蛋白多肽的螯合率隨時(shí)間延長而逐漸下降，可能是部分原來被絡(luò)合的亞鐵離子重新成為游離狀態(tài)，使螯合率降低。

2.3.4 ?亞鐵離子濃度對椰子球蛋白與亞鐵離子螯合率的影響 ?從圖6可以看出，在較低的濃度范圍內(nèi)，隨著亞鐵離子濃度的增大，與椰子球蛋白多肽發(fā)生反應(yīng)的亞鐵離子數(shù)量增多，使螯合率上升，且當(dāng)濃度達(dá)到0.75 mg/mL時(shí)，螯合率最大。之后，亞鐵離子的濃度雖然進(jìn)一步增大，但由于椰子多肽上的螯合位點(diǎn)已經(jīng)飽和，因此螯合率趨于穩(wěn)定。

2.4 ?螯合工藝的優(yōu)化

在上述單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇四因素三水平L9（34）的正交試驗(yàn)對整個(gè)工藝進(jìn)行優(yōu)化，以亞鐵離子螯合率為指標(biāo)，正交試驗(yàn)的結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

根據(jù)表2中的極差分析可知，各因素對螯合率的影響大小排列為：D（亞鐵離子濃度）>C（pH）>A（溫度）>B（時(shí)間）。根據(jù)表3中方差分析可知，亞鐵離子濃度和pH對螯合率均有顯著影響（P<0.05），而溫度和時(shí)間對螯合率的影響均不顯著（P>0.05）。最佳試驗(yàn)方案是A3B1C2D1，即螯合溫度為35 ℃、螯合時(shí)間為0.5 h、pH 7.0、亞鐵離子濃度為0.5 mg/mL。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，在此條件下，椰子球蛋白肽對亞鐵離子的螯合率為30.67%。

2.5 ?椰子肽-亞鐵螯合物鑒定

2.5.1 ?紫外全波長掃描 ?分別對椰子球蛋白多肽組分C和椰子肽-亞鐵螯合物進(jìn)行紫外全波長掃描，結(jié)果見圖7。從圖7可以看出，椰子球蛋白水解肽組分C的特征吸收峰為230 nm，而椰子肽-亞鐵螯合物的特征吸收峰為224 nm，表明椰子肽-亞鐵螯合物是1種區(qū)別于椰子球蛋白的新物質(zhì)。多肽中的羧基、氨基等基團(tuán)可通過氫鍵或離子鍵與亞鐵離子結(jié)合，使多肽的空間構(gòu)象發(fā)生改變，從而影響其特征吸收波長[11]。

2.5.2 ?熒光光譜掃描 ?分別對椰子球蛋白多肽組分C和椰子肽-亞鐵螯合物進(jìn)行熒光掃描，結(jié)果見圖8。從圖8可以看出，椰子球蛋白多肽組分C在499 nm處出現(xiàn)最大熒光強(qiáng)度。與之相比，椰子肽-亞鐵螯合物的最大熒光強(qiáng)度變?nèi)?，最大吸收熒光波長也發(fā)生了紅移（遷移到508 nm）。Fe2+與多肽的結(jié)合會引起發(fā)射光譜的移動，并使熒光強(qiáng)度改變[3]。該結(jié)果再次證實(shí)了椰子肽-亞鐵螯合物是不同于椰子球蛋白多肽的新物質(zhì)。原洪等[14]的研究也證明，與亞鐵離子結(jié)合可以改變花椒多肽的熒光吸收特征波長。

2.5.3 ?紅外光譜分析 ?椰子球蛋白多肽組分C和椰子肽-亞鐵螯合物的傅里葉紅外變換光譜圖見圖9。

從圖9可以看出，椰子球蛋白多肽組分C表現(xiàn)出典型的蛋白質(zhì)紅外光譜圖，分別在3411、1656和1434 cm?1處出現(xiàn)吸收峰。其中1434 cm?1處的吸收峰對應(yīng)多肽中羧基（COO?）的振動伸縮，1656 cm?1處的吸收峰對應(yīng)羰基（C=O）的振動伸縮，而3411 cm?1處的吸收峰對應(yīng)多肽中氨基（—NH）的振動伸縮。羧基、氨基和羰基是多肽中主要基團(tuán)。與椰子球蛋白多肽組分C的紅外光譜相比，椰子肽?亞鐵螯合物的吸收峰和吸收強(qiáng)度均發(fā)生了變化。其中，椰子多肽-亞鐵螯合物中—NH振動吸收峰由3411 cm?1藍(lán)移到3497.1 cm?1，羧基振動吸收峰由1656 cm?1藍(lán)移到1672.4 cm?1，而羰基振動吸收峰由1434 cm?1藍(lán)移到1468 cm?1;同時(shí)，各吸收峰的強(qiáng)度都減弱。這表明，椰子球蛋白多肽鏈中的氨基和羧基都參與對Fe2+的絡(luò)合而形成肽-亞鐵螯合物。此外，與椰子球蛋白多肽相比，椰子肽-亞鐵螯合物在2978 cm?1處的吸收強(qiáng)度明顯變?nèi)?，?978 cm?1處的吸收峰對應(yīng)亞甲基（—CH2）的伸縮振動。因此，椰子球蛋白多肽中的亞甲基也可能參與了對Fe2+的絡(luò)合。前人的研究[2， 11-14]大多表明其他植物多肽主要由氨基和羧基與Fe2+配位而形成螯合物，本研究的結(jié)果表明椰子球蛋白多肽中部分亞甲基也參與螯合物的形成。由于多肽中亞甲基的數(shù)量更多，因此這可能是利用椰子球蛋白制備肽-亞鐵螯合物的優(yōu)勢之一。然而，椰子球蛋白多肽與Fe2+的螯合機(jī)理，還需要借助分子模擬等技術(shù)做進(jìn)一步的研究。

3 ?討論

與已報(bào)道的植物蛋白多肽-亞鐵螯合物相比，椰子球蛋白的來源更加廣泛、成本更低。由于椰子球蛋白中大量存在二硫鍵、氨基和谷氨酸，經(jīng)適當(dāng)水解后，可以將這些基團(tuán)暴露出來，使之與亞鐵離子迅速螯合，而制備的肽-亞鐵螯合物也更穩(wěn)定;此外，椰子球蛋白還具有低抗原、高消化吸收率、營養(yǎng)價(jià)值較高等優(yōu)點(diǎn)。因此，椰子球蛋白是制備肽-亞鐵螯合物的理想原料。同時(shí)，采用Sephadex G-25凝膠柱層析對蛋白質(zhì)多肽進(jìn)行分離純化，可以篩選出活性更高、純度更高的多肽組分，提高肽-亞鐵螯合物的制備率。本研究結(jié)果表明水解度、溫度、pH、亞鐵離子濃度、時(shí)間等因素對椰子球蛋白多肽的亞鐵離子螯合能力都有影響。其中，亞鐵離子濃度和pH對螯合率的影響顯著（P<0.05）。椰子球蛋白與亞鐵離子螯合的最佳條件為椰子球蛋白多肽溶液濃度為1 g/100 mL、40 ℃、時(shí)間0.5 h、pH 7.0、亞鐵離子濃度為0.5 mg/mL，此時(shí)的螯合率為30.67%。經(jīng)熒光光譜和傅里葉紅外光譜鑒定表明，椰子球蛋白多肽主要通過分子中的氨基、羧基和亞甲基與亞鐵離子配位而形成絡(luò)合物。該肽-亞鐵螯合物可作為功能食品的成分，應(yīng)用于改善人們鐵營養(yǎng)缺乏的狀況。

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責(zé)任編輯：崔麗虹