基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討伸膝湯治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制

賀豐 付玲玲 曾杰

摘要 目的：利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法從整體觀念探討中藥復(fù)方伸膝湯治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（Knee Osteoarthritis，KOA）的作用機(jī)制。方法：通過(guò)BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)伸膝湯所含活性成分進(jìn)行篩選并預(yù)測(cè)作用靶點(diǎn)，利用GeneCards、OMIM和CTD數(shù)據(jù)庫(kù)檢索KOA相關(guān)基因，利用韋恩圖篩選伸膝湯中活性成分治療KOA的作用靶點(diǎn)。利用Cytoscape軟件構(gòu)建活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。利用String數(shù)據(jù)庫(kù)繪制伸膝湯蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，分析計(jì)算出最重要的5個(gè)蛋白。利用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）及京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析。結(jié)果：伸膝湯所含8味中藥共篩選出184種活性成分，涉及1 491個(gè)靶點(diǎn)基因，其中有710個(gè)基因與KOA相關(guān)。網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明，伸膝湯治療KOA涉及的生物學(xué)過(guò)程主要包括毒性反應(yīng)、細(xì)胞外刺激反應(yīng)、激素水平調(diào)節(jié)等;涉及的分子功能主要包括輔因子結(jié)合、羧酸結(jié)合、維生素結(jié)合等。其作用機(jī)制可能與HIF-1信號(hào)通路、PI3K-AKT信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路、鈣離子信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、碳代謝、凋亡、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、非酒精性脂肪肝等信號(hào)通路有關(guān)。結(jié)論：本研究初步揭示了伸膝湯多靶點(diǎn)整體調(diào)節(jié)KOA的作用特點(diǎn)，為進(jìn)一步開(kāi)展此方治療KOA作用機(jī)制的研究提供了新的思路和方法。

關(guān)鍵詞 膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);伸膝湯;中藥

Abstract Objective：To explore the mechanism of traditional Chinese medicine compound Shenxi Decoction on knee osteoarthritis（KOA）with network pharmacology method from the overall concept.Methods：Through the BTAMAN-TCM database，the active ingredients in Shenxi Decoction were screened and the target of action was predicted.GeneCards，OMIM and CTD database were used to retrieve KOA-related genes.The Venn diagram was used to screen the target points of the active ingredients in the Shenxi Decoction for the treatment of KOA.Cytoscape software was used to construct the network diagram of active component-acting target.Protein interaction network was drawn up with String database，and the 5 most important proteins were analyzed and calculated.The GO（Gene Ontology）and KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）were for enrichment analysis by Metascape database.Results：A total of 184 active ingredients were screened out from 8 Chinese medicinals，involving 1 491 target genes，710 of which were KOA-related.The results of network analysis showed that the biological processes involved in Shenxi Decoction in the treatment of KOA mainly included toxic substance，response to extracellular stimulus and regulation of hormone levels etc.The molecular functions involved mainly included cofactor binding，carboxylic acid binding and vitamin binding etc.Its mechanism may be related to HIF-1 signaling pathway，PI3K-AKT signaling pathway，cAMP signaling pathway，calcium ion signaling pathway，TNF signaling pathway，carbon metabolism，apoptosis，fluid shear stress and atherosclerosis，non-alcoholic fat and other related signal pathway.Conclusion：This study initially reveals the characteristics of the multi-target overall regulation of KOA by Shenxi Decoction，providing new ideas and methods for further research on the mechanism of action of this prescription in the treatment of KOA.

Keywords Knee osteoarthritis; Network pharmacology; Shenxi Decoction; Chinese medicinal

中圖分類號(hào)：R285;R274文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.07.009

骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA），是最常見(jiàn)的關(guān)節(jié)疾病，影響多達(dá)15%的成年人，這種疾病的特點(diǎn)是關(guān)節(jié)軟骨退化，滑膜炎和軟骨下骨的破骨細(xì)胞活化[1]。OA不僅是關(guān)節(jié)的局部疾病，而且還與全身性疾病有關(guān)，如炎癥、代謝失調(diào)和肥胖，且慢性、輕度炎癥會(huì)加重癥狀和疾病進(jìn)展[2-3]。膝關(guān)節(jié)是最常發(fā)生骨關(guān)節(jié)炎的部位，膝關(guān)節(jié)軟骨體積與血液炎癥介質(zhì)的濃度呈負(fù)相關(guān)，如白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和C反應(yīng)蛋白（CRP）。此外，一些炎癥介質(zhì)（趨化因子和細(xì)胞因子，如IL-1β和危險(xiǎn)信號(hào)分子）影響軟骨細(xì)胞的活性并使軟骨細(xì)胞發(fā)生表型變化，如細(xì)胞肥大等。CRP和一些炎癥介質(zhì)（前列腺素E2、IL-1、IL-6）的增加可能在OA患者并發(fā)癥的發(fā)生中起到關(guān)鍵作用，如心血管損傷[4]。事實(shí)上，與一般人群相比，OA患者的總死亡率更高，主要是由于心血管損傷的增加[5]?；谏鲜鲈颍琌A不僅應(yīng)被視為局部關(guān)節(jié)疾病，而且應(yīng)被視為全身性疾病。

中醫(yī)認(rèn)為關(guān)節(jié)炎屬于“痹癥”“骨痹”范疇?！端貑?wèn)·痹論》有“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹也”的記載。外感風(fēng)邪，遇寒或受熱，加之濕邪偏勝，是本病的外因。而素體骨髓虧虛，肌腠不能抵御邪氣，是導(dǎo)致本病發(fā)生的內(nèi)在因素。伸膝湯方是東直門醫(yī)院院內(nèi)制劑，由經(jīng)典方劑獨(dú)活寄生湯化裁而來(lái)，由獨(dú)活、秦艽、桑寄生、牛膝、雞血藤、川芎、白芍、陳皮8味藥組成，具有祛風(fēng)濕、止痹痛、強(qiáng)筋骨之效。其中獨(dú)活、秦艽祛風(fēng)勝濕，通絡(luò)止痛，共為君藥;桑寄生、牛膝祛風(fēng)濕，活血通經(jīng)，且助君藥補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨為臣藥。雞血藤、川芎行血補(bǔ)血，舒筋活絡(luò)為佐藥。白芍、陳皮養(yǎng)血止痛，理氣燥濕共為使藥。諸藥合用祛風(fēng)勝濕，通絡(luò)止痛，強(qiáng)筋健骨臨床治療KOA效果明顯，且經(jīng)濟(jì)適用。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種新興的研究方法，該方法在網(wǎng)絡(luò)分析計(jì)算的基礎(chǔ)上，建立“藥物-靶點(diǎn)-疾病-基因”之間的相互作用關(guān)系，并以線性關(guān)系呈現(xiàn)出來(lái)，可更加清晰的顯示多種因素間的相互作用[6]。因其整體、高效的特點(diǎn)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在探尋中藥復(fù)方的配伍規(guī)律方面正發(fā)揮越來(lái)越重要的作用[7-8]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對(duì)伸膝湯治療KOA的機(jī)制進(jìn)行探討，為深入研究中藥復(fù)方從整體觀念治療KOA提供參考。

1 材料與方法

1.1 伸膝湯所含成分與對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的收集與篩選 ? 伸膝湯由8味中藥組成，分別是獨(dú)活、秦艽、桑寄生、牛膝、雞血藤、川芎、白芍、陳皮。通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研和BATMAN-TCM（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）數(shù)據(jù)庫(kù)，收集以上8味中藥的活性成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。參數(shù)設(shè)置：Score cut-off=20，P<0.05[9]。

1.2 KOA相關(guān)基因靶點(diǎn)的篩選 通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.genecards.org，Version 4.11.0）、人類孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）（https：//omim.org/）和CTD數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//ctdbase.org/）檢索與KOA相關(guān)基因，匯總后去除重復(fù)基因。

1.3 伸膝湯活性成分靶點(diǎn)與KOA相關(guān)靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 利用韋恩圖將伸膝湯活性成分作用的靶點(diǎn)基因與KOA相關(guān)基因進(jìn)行合并，交集的部分很有可能是伸膝湯活性成分治療KOA的靶點(diǎn)基因。將交集基因及與之對(duì)應(yīng)化合物導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件構(gòu)建伸膝湯活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，保存網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果。在網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點(diǎn)（Node）表示成分和靶點(diǎn)，邊（Edge）表示成分與靶點(diǎn)之間的相互作用。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將伸膝湯作用于KOA的靶點(diǎn)基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org，Version 11.0）[10]，限定物種為人類，獲取被調(diào)控蛋白間的相互作用關(guān)系，保存結(jié)果并導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件，繪制PPI網(wǎng)路圖。然后使用Cytohubba插件，根據(jù)最大團(tuán)中心性（Maximal Clique Centrality，MCC）值，篩選最重要的10個(gè)蛋白[11]。

1.5 GO分析與KEGG通路分析 將伸膝湯作用于KOA的靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，Input as species和Analysis as species均設(shè)置為H.sapiens，選擇自定義分析（Custom Analysis）中的富集（Enrichment），分別進(jìn)行GO生物過(guò)程，GO分子功能，GO細(xì)胞組分和KEGG通路富集分析，篩選統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的條目[12]。使用GraphPad Prism 7.0軟件，分別對(duì)GO和KEGG通路分析結(jié)果進(jìn)行條形圖或氣泡圖繪制。

2 結(jié)果

2.1 伸膝湯方所含成分及靶點(diǎn)的收集與篩選 通過(guò)BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)，以Score cutoff=20，P<0.05為參數(shù)收集伸膝湯中符合條件的活性成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，結(jié)果獨(dú)活所含活性成分54個(gè)，對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)1 272個(gè);秦艽所含活性成分4個(gè)，對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)66個(gè);桑寄生所含活性成分6個(gè)，對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)117個(gè);川芎所含活性成分69個(gè)，對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)940個(gè);牛膝所含活性成分8個(gè)，對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)79個(gè);雞血藤所含活性成分9個(gè)，對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)188個(gè);白芍所含活性成分18個(gè)，對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)144個(gè);陳皮所含活性成分33個(gè)，對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)603個(gè)。去重后共得到184個(gè)活性成分及1 491個(gè)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。

2.2 KOA相關(guān)基因靶點(diǎn)篩選 分別在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)和CTD數(shù)據(jù)庫(kù)中，以關(guān)鍵詞“knee osteoarthritis”進(jìn)行檢索，獲得1 543、315、4 518個(gè)相關(guān)基因靶點(diǎn)，刪除重復(fù)后共得到5 583個(gè)KOA相關(guān)基因。

2.3 伸膝湯活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)互作 將伸膝湯作用靶點(diǎn)基因與KOA相關(guān)靶點(diǎn)基因進(jìn)行映射比較，發(fā)現(xiàn)710個(gè)共同基因，推測(cè)這些可能為伸膝湯治療KOA的基因靶點(diǎn)。將交集基因靶點(diǎn)與對(duì)應(yīng)活性成分輸入Cytoscape3.8.0軟件構(gòu)建伸膝湯活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。見(jiàn)圖1。圖中共涉及1 675個(gè)節(jié)點(diǎn)，9 152條邊，其中紅色圓形節(jié)點(diǎn)代表伸膝湯活性成分，藍(lán)色正方形節(jié)點(diǎn)代表KOA被調(diào)控靶點(diǎn)，邊代表活性成分和被調(diào)控靶點(diǎn)間具有作用關(guān)系。從圖中可看出伸膝湯多成分靶點(diǎn)間相互作用關(guān)系。其中獨(dú)活獨(dú)有成分墨蓋蘑菇氨酸（Coprine/386個(gè)靶點(diǎn)），壬酸（Nonanoic Acid/263個(gè)靶點(diǎn)），川芎獨(dú)有成分十五酸甲酯（Methyl Pentadecanoate/226個(gè)靶點(diǎn)），棕櫚酸（Hexadecanoic Acid/226個(gè)靶點(diǎn)），陳皮獨(dú)有成分月桂酸（Lauric Acid/226個(gè)靶點(diǎn)）是擁有靶點(diǎn)最多5種化合物。

2.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 PPI網(wǎng)絡(luò)中，共涉及707個(gè)節(jié)點(diǎn)，13 024條邊（其中SEC14L3、AP3D、GLYATL2與其他蛋白沒(méi)有相互作用）。使用Cytohubba插件中MCC方法計(jì)算后，確定最重要的10個(gè)蛋白靶點(diǎn)，分別為白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）、白蛋白（ALB）、蘇氨酸激酶1（AKT1）、前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2（PTGS2）、胰島素（INS）、Toll樣受體4（TLR4）、Jun原癌基因（JUN）、CC趨化因子配體2（CCL2）、腫瘤壞死因子（TNF）結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.5 基因功能分析 使用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)伸膝湯活性成分所調(diào)控的靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（GO）分析，并篩選統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的生物學(xué)過(guò)程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）和細(xì)胞組分（Cellular Component，CC），用GraphPad Prism7.0軟件繪圖。見(jiàn)圖3～5。其中生物學(xué)過(guò)程（圖3）主要富集在對(duì)有毒物質(zhì)的反應(yīng)（Response to Toxic Substance）、對(duì)細(xì)胞外刺激的反應(yīng)（Response to Extracellular Stimulus）、激素水平的調(diào)節(jié)（Regulation of Hormone Levels）、血液循環(huán)（Blood Circulation）、對(duì)無(wú)機(jī)物的反應(yīng)（Response to Inorganic Substance）等條目。分子功能（圖4）主要富集在輔因子結(jié)合（Cofactor Binding）、羧酸結(jié)合（Carboxylic Acid Binding）、維生素結(jié)合（Vitamin Binding）、受體配體活性（Receptor Ligand Activity）、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合（Protein Domain Specific Binding）等條目。細(xì)胞組分（圖5）主要富集在線粒體基質(zhì)（Mitochondrial Matrix）、膜筏（Membrane Raft）、神經(jīng)細(xì)胞體（Neuronal Cell Body）、軸突（Axon）、線粒體被膜（Mitochondrial Envelope）等條目。

2.6 KEGG通路分析 使用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)KOA被調(diào)控的710個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG分析，根據(jù)LogP值篩選靠前的10個(gè)代表性通路見(jiàn)圖6。圖中節(jié)點(diǎn)的顏色反映了LopP值的大小，節(jié)點(diǎn)大小與基因數(shù)量成正比。結(jié)果顯示，伸膝湯調(diào)控KOA的機(jī)制主要涉及癌癥相關(guān)通路（Pathways in Cancer）、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化（Fluid Shear Stress and Atherosclerosis）、非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic Fatty Liver Disease）、HIF-1信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路（Calcium Signaling Pathway）、PI3K-AKT信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、碳代謝（Carbon Metabolism）、細(xì)胞凋亡（Apoptosis）等通路。因此推測(cè)，伸膝湯治療KOA的作用機(jī)制可能與上述信號(hào)通路密切相關(guān)。

3 討論

目前，雖然骨關(guān)節(jié)炎的病因及病理生理學(xué)機(jī)制仍存在爭(zhēng)議，但相關(guān)致病危險(xiǎn)因素，特別是多種因素結(jié)合導(dǎo)致疾病進(jìn)展已得到廣泛的記錄，如年齡、性別、基因和骨密度增加等[13-16]。此外，局部生物力學(xué)危險(xiǎn)因素，如損傷、肥胖、解剖畸形和肌肉無(wú)力，決定了疾病的部位和嚴(yán)重程度[17]。Cicuttini等[2]研究表明KOA早期以全身代謝因素為主，晚期以機(jī)械因素為主。軟骨損傷和軟骨下骨重建的起始和進(jìn)展與肥胖相關(guān)代謝物，尤其是脂肪因子，炎癥細(xì)胞啟動(dòng)因子有關(guān)[18]。

中醫(yī)認(rèn)為膝痹屬于痹癥的一種，可受身體多種臟腑影響，并由身體生理功能異常，局部再次受到病理刺激導(dǎo)致。如肝腎不足，軀體經(jīng)脈不通瘀血痹阻，膝關(guān)節(jié)局部感受風(fēng)寒濕等邪氣。中藥治療KOA一般采取辨證論治，主要使用祛風(fēng)散寒除濕、活血行氣通絡(luò)、補(bǔ)肝腎強(qiáng)筋骨等治療方法及藥物。伸膝湯是北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院院內(nèi)協(xié)定方，臨床治療KOA效果明顯，但其藥理學(xué)機(jī)制尚不明確。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法從伸膝湯所含8味中藥中，說(shuō)明了伸膝湯多成分、多靶點(diǎn)共同作用治療KOA的特點(diǎn)。靶點(diǎn)最多的前2種化合物分別為墨蓋蘑菇氨酸（Coprine）和壬酸（Nonanoic Acid），它們是獨(dú)活的獨(dú)有成分，說(shuō)明獨(dú)活作為君藥，在此方中的重要作用。川芎獨(dú)有成分十五酸甲酯（Methyl Pentadecanoate），棕櫚酸（Hexadecanoic Acid），陳皮獨(dú)有成分月桂酸（Lauric Acid）擁有靶點(diǎn)的數(shù)量分別處于第3～5位。

PPI結(jié)果顯示伸膝湯通過(guò)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系調(diào)控KOA，經(jīng)計(jì)算后發(fā)現(xiàn)IL6、IL10、ALB、AKT1、PTGS2、INS、TLR4、JUN、CCL2、TNF等可能是伸膝湯影響KOA的10個(gè)最主要靶蛋白。IL6與多種炎癥相關(guān)的疾病狀態(tài)有關(guān)[19]。IL10基因編碼的蛋白質(zhì)是一種細(xì)胞因子，主要由單核細(xì)胞產(chǎn)生，這種細(xì)胞因子在免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)中具有多效性，可作用于免疫系統(tǒng)的許多細(xì)胞，限制了由炎癥引起的過(guò)度組織破壞[20]。TLR4可介導(dǎo)核因子κB活化、細(xì)胞因子分泌和炎癥反應(yīng)[21]。CCL2趨化因子是參與免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)的分泌蛋白的超家族，它與多種疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[22]。TNF主要由巨噬細(xì)胞分泌，可誘導(dǎo)某些腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞凋亡。它是一種通過(guò)直接作用或刺激白細(xì)胞介素-1分泌而引起發(fā)熱的強(qiáng)致熱原，與誘導(dǎo)惡病質(zhì)有關(guān)，在一定條件下可刺激細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞分化[23]。ALB基因編碼人類血液中最豐富的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有調(diào)節(jié)血漿膠體滲透壓的功能，并作為多種內(nèi)源性分子（包括激素、脂肪酸、代謝物以及外源性藥物）的載體蛋白[24]。INS基因編碼胰島素，一種肽激素，在調(diào)節(jié)碳水化合物和脂質(zhì)代謝中起著至關(guān)重要的作用。AKT1在發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)中，AKT是生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的神經(jīng)元成活的關(guān)鍵介質(zhì)。生長(zhǎng)因子可以通過(guò)激活絲氨酸/蘇氨酸激酶AKT1以一種獨(dú)立于轉(zhuǎn)錄的方式抑制凋亡，然后AKT1磷酸化并使凋亡機(jī)制的組分失活[25]。PTGS2負(fù)責(zé)產(chǎn)生炎性前列腺素。PTGS2的上調(diào)還與細(xì)胞黏附增加、表型改變、抗凋亡和腫瘤血管生成有關(guān)[26]。JUN編碼一種與病毒蛋白高度相似的蛋白質(zhì)，并與特定的靶DNA序列直接相互作用，以調(diào)節(jié)基因表達(dá)。由此可見(jiàn)伸膝湯影響的蛋白質(zhì)涉及免疫、炎癥和細(xì)胞成活，代謝等多種功能。

GO及KEGG分析發(fā)現(xiàn)，伸膝湯對(duì)體內(nèi)多種信號(hào)通路都具有調(diào)控作用。對(duì)于流體剪應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化通路而言，剪切應(yīng)力是血流在血管壁內(nèi)皮表面施加的摩擦力，在血管生物學(xué)中起著重要作用，是動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的重要因素。Ekim等[27]研究表明，頸動(dòng)脈內(nèi)膜-中膜厚度、動(dòng)脈粥樣硬化與超聲下的膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎分級(jí)有相關(guān)性。對(duì)于非酒精性脂肪肝（Non-alcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD）通路而言，NAFLD是一種范圍廣泛的疾病，從簡(jiǎn)單的脂肪變性到伴有肝炎癥和纖維化的更嚴(yán)重的脂肪性肝炎，在NAFLD的第一階段，已經(jīng)證實(shí)有過(guò)多的脂肪堆積。其主要原因是誘導(dǎo)胰島素抵抗，導(dǎo)致游離脂肪酸（FAAs）處理的胰島素抑制缺陷。研究發(fā)現(xiàn)，肥胖人群不僅會(huì)增加患膝蓋骨關(guān)節(jié)炎的風(fēng)險(xiǎn)，還會(huì)增加患手部骨關(guān)節(jié)炎的風(fēng)險(xiǎn)。這支持了脂肪組織可能不僅通過(guò)超載與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的概念。事實(shí)上，肥胖會(huì)誘發(fā)一種低等級(jí)的全身炎癥狀態(tài)，其特征是產(chǎn)生和分泌多種脂肪細(xì)胞因子，而這些脂肪細(xì)胞因子可能在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮作用。此外，高血壓、受損的葡萄糖和脂質(zhì)代謝，這些與肥胖相關(guān)的共病，已經(jīng)被證明可以改變關(guān)節(jié)組織的穩(wěn)態(tài)[28]。對(duì)于HIF-1通路，HIF-1在低氧條件下的主動(dòng)調(diào)控其他因子，以適應(yīng)缺氧環(huán)境。HIF-1的靶基因編碼蛋白質(zhì)，增加O2的傳遞，介導(dǎo)對(duì)O2剝奪的適應(yīng)性反應(yīng)。OA的特點(diǎn)是軟骨破壞，分解代謝酶和軟骨細(xì)胞死亡[包括凋亡和（或）自噬]等因素被認(rèn)為是其發(fā)病機(jī)制。關(guān)節(jié)軟骨一生都在低氧環(huán)境中維持，因此軟骨細(xì)胞適應(yīng)這些低氧條件。HIF-1α通過(guò)調(diào)節(jié)SOX9基因水平表達(dá)調(diào)節(jié)軟骨形成，HIF-1也可以調(diào)節(jié)自噬和凋亡。因此，HIF-1α可能通過(guò)促進(jìn)軟骨細(xì)胞形成，維持軟骨細(xì)胞的生存能力，支持代謝、適應(yīng)缺氧環(huán)境等作用對(duì)關(guān)節(jié)軟骨產(chǎn)生保護(hù)作用[29]。鈣離子信號(hào)通路屬于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在軟骨形成過(guò)程中，復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路調(diào)控一系列復(fù)雜的事件，包括軟骨祖細(xì)胞凝聚和結(jié)節(jié)形成，然后是軟骨分化，鈣信號(hào)是分化軟骨祖細(xì)胞的中心調(diào)控因子[30]。cAMP是最常見(jiàn)、最普遍的第二信使之一，其形成是通過(guò)G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）與包括激素、神經(jīng)遞質(zhì)等信號(hào)分子的配體連接后，腺苷酸環(huán)化酶（AC）激活而促進(jìn)的。Qadri等[31]研究表明，滑膜細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的增加通過(guò)增加透明質(zhì)酸和蛋白聚糖4的產(chǎn)生來(lái)減輕滑膜纖維化，這可能提示了一種治療OA滑膜纖維化的新方法。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）-AKT信號(hào)通路被多種細(xì)胞刺激或毒性損傷激活，調(diào)控轉(zhuǎn)錄、翻譯、增殖、生長(zhǎng)和成活等細(xì)胞基本功能。Xue等[32]研究表明炎癥可抑制大鼠軟骨細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期，降低自噬率，抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路可促進(jìn)OA大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬，減輕炎癥反應(yīng)[32]。腫瘤壞死因子（TNF）是一個(gè)關(guān)鍵的炎癥介質(zhì)，在炎癥過(guò)程中起著主要的作用[33]，最近的數(shù)據(jù)表明TNF參與OA軟骨變性發(fā)展[34]，皮質(zhì)抑素可競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合到TNFR1和TNFR2，抑制促炎TNF-α的功能，從而對(duì)軟骨變性和OA產(chǎn)生延緩作用[35]。Song等[36]分別從人OA軟骨和正常軟骨組織中分離關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，通過(guò)safranin O染色檢測(cè)軟骨降解程度，發(fā)現(xiàn)OA軟骨細(xì)胞中SHMT-2和MECP-2表達(dá)水平升高，3′URT報(bào)告基因檢測(cè)顯示SHMT-2和MECP-2分別是miR-370和miR-373在人類關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的直接靶點(diǎn)。將miR-370或miR-373引入內(nèi)側(cè)半月板（DMM）失穩(wěn)的小鼠軟骨中，顯著降低了本模型中軟骨的破壞，而引入SHMT-2或MECP-2則增加了軟骨破壞的嚴(yán)重程度。因此miR-370和miR-373分別通過(guò)SHMT-2和MECP-2調(diào)控單碳代謝，調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)伸膝湯治療KOA的機(jī)制進(jìn)行探討，發(fā)現(xiàn)此方包含多種活性成分，涉及多種信號(hào)通路和生物過(guò)程，與中醫(yī)整體論治的觀點(diǎn)相吻合。還為研究伸膝湯治療作用的分子機(jī)制及藥理學(xué)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為其他復(fù)方中藥的研究提供了思路和方法。本研究的不足之處在于數(shù)據(jù)庫(kù)中信息可能不完全，伸膝湯所含中藥的化合物及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)可能會(huì)被遺漏;伸膝湯中化學(xué)成分復(fù)雜，在關(guān)鍵化合物挑選的過(guò)程中應(yīng)當(dāng)結(jié)合更多的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)。以后的研究目標(biāo)是對(duì)伸膝湯的作用靶點(diǎn)進(jìn)行更加精確的篩選和驗(yàn)證，對(duì)其機(jī)制進(jìn)行更加深入的研究。

參考文獻(xiàn)

[1]Bijlsma JW，Berenbaum F，Lafeber FP.Osteoarthritis：an update with relevance for clinical practice[J].Lancet，2011，377（9783）：2115-2126.

[2]Cicuttini FM，Wluka AE.Osteoarthritis：Is OA a mechanical or systemic disease？[J].Nat Rev Rheumatol，2014，10（9）：515-516.

[3]Pers YM，Ruiz M，Nol D，et al.Mesenchymal stem cells for the management of inflammation in osteoarthritis：state of the art and perspectives[J].Osteoarthritis Cartilage，2015，23（11）：2027-2035.

[4]Danesh J，Wheeler JG，Hirschfield GM，et al.C-reactive protein and other circulating markers of inflammation in the prediction of coronary heart disease[J].N Engl J Med，2004，350（14）：1387-1397.

[5]Gkretsi V，Simopoulou T，Tsezou A.Lipid metabolism and osteoarthritis：lessons from atherosclerosis[J].Prog Lipid Res，2011，50（2）：133-140.

[6]Ye H，Wei J，Tang K，et al.Drug Repositioning Through Network Pharmacology[J].Curr Top Med Chem，2016，16（30）：3646-3656.

[7]Harrold JM，Ramanathan M，Mager DE.Network-based approaches in drug discovery and early development[J].Clin Pharmacol Ther，2013，94（6）：651-658.

[8]Chen L，Cao Y，Zhang H，et al.Network pharmacology-based strategy for predicting active ingredients and potential targets of Yangxinshi tablet for treating heart failure[J].J Ethnopharmacol，2018，219：359-368.

[9]Liu Z，Guo F，Wang Y，et al.BATMAN-TCM：a Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine[J].Sci Rep，2016，6：21146.

[10]von Mering C，Jensen LJ，Snel B，et al.STRING：known and predicted protein-protein associations，integrated and transferred across organisms[J].Nucleic Acids Res，2005，33（Database issue）：D433-7.

[11]Meghanathan N.Maximal clique size versus centrality：a correlation analysis for complex real-world network graphs[C].New Delhi：Proceedings of 3rd International Conference on Advanced Computing，Networking and Informatics.Springer，2016：95-101.

[12]Tripathi S，Pohl MO，Zhou Y，et al.Meta-and Orthogonal Integration of Influenza “OMICs” Data Defines a Role for UBR4 in Virus Budding[J].Cell Host Microbe，2015，18（6）：723-735.

[13]Mueller AJ，Peffers MJ，Proctor CJ，et al.Systems approaches in osteoarthritis：Identifying routes to novel diagnostic and therapeutic strategies[J].J Orthop Res，2017，35（8）：1573-1588.

[14]Neame RL，Muir K，Doherty S，et al.Genetic risk of knee osteoarthritis：a sibling study[J].Ann Rheum Dis，2004，63（9）：1022-1027.

[15]Valdes AM，Spector TD.The genetic epidemiology of osteoarthritis[J].Curr Opin Rheumatol，2010，22（2）：139-143.

[16]Teichtahl AJ，Wang Y，Wluka AE，et al.Associations between systemic bone mineral density and early knee cartilage changes in middle-aged adults without clinical knee disease：a prospective cohort study[J].Arthritis Res Ther，2017，19（1）：98.

[17]Pereira D，Ramos E，Branco J.Osteoarthritis[J].Acta Med Port.2015 Jan-Feb;28（1）：99-106.

[18]Wang X，Hunter D，Xu J，et al.Metabolic triggered inflammation in osteoarthritis[J].Osteoarthritis Cartilage，2015，23（1）：22-30.

[19]Gómez MI，Sokol SH，Muir AB，et al.Bacterial induction of TNF-alpha converting enzyme expression and IL-6 receptor alpha shedding regulates airway inflammatory signaling[J].J Immunol，2005，175（3）：1930-1936.

[20]Hashimoto SI，Komuro I，Yamada M，et al.IL-10 inhibits granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent human monocyte survival at the early stage of the culture and inhibits the generation of macrophages[J].J Immunol，2001，167（7）：3619-3625.

[21]Stewart CR，Stuart LM，Wilkinson K，et al.CD36 ligands promote sterile inflammation through assembly of a Toll-like receptor 4 and 6 heterodimer[J].Nat Immunol，2010，11（2）：155-161.

[22]Jarnagin K，Grunberger D，Mulkins M，et al.Identification of surface residues of the monocyte chemotactic protein 1 that affect signaling through the receptor CCR2[J].Biochemistry，1999，38（49）：16167-1677.

[23]Nie H，Zheng Y，Li R，et al.Phosphorylation of FOXP3 controls regulatory T cell function and is inhibited by TNF-α in rheumatoid arthritis[J].Nat Med，2013，19（3）：322-328.

[24]Lu J，Stewart AJ，Sadler PJ，et al.Albumin as a zinc carrier：properties of its high-affinity zinc-binding site[J].Biochem Soc Trans，2008，36（Pt 6）：1317-1321.

[25]Lee SB，Kwon IS，Park J，et al.Ribosomal protein S3，a new substrate of Akt，serves as a signal mediator between neuronal apoptosis and DNA repair[J].J Biol Chem，2010，285（38）：29457-2968.

[26]Lucido MJ，Orlando BJ，Vecchio AJ，et al.Crystal Structure of Aspirin-Acetylated Human Cyclooxygenase-2：Insight into the Formation of Products with Reversed Stereochemistry[J].Biochemistry，2016，55（8）：1226-1238.

[27]Ekim AA，nal EE，Kaya DS，et al.Relationship between atherosclerosis and knee osteoarthritis as graded by radiography and ultrasonography in females[J].J Phys Ther Sci，2016，28（11）：2991-2998.

[28]Belluzzi E，El Hadi H，Granzotto M，et al.Systemic and Local Adipose Tissue in Knee Osteoarthritis[J].J Cell Physiol，2017，232（8）：1971-1978.

[29]Zhang FJ，Luo W，Lei GH.Role of HIF-1α and HIF-2α in osteoarthritis[J].Joint Bone Spine，2015，82（3）：144-147.

[30]Matta C，Mobasheri A.Regulation of chondrogenesis by protein kinase C：Emerging new roles in calcium signalling[J].Cell Signal，2014，26（5）：979-1000.

[31]Qadri MM，Jay GD，Ostrom RS，et al.cAMP attenuates TGF-β′s profibrotic responses in osteoarthritic synoviocytes：involvement of hyaluronan and PRG4[J].Am J Physiol Cell Physiol，2018，315（3）：C432-C443.

[32]Xue JF，Shi ZM，Zou J，et al.Inhibition of PI3K/AKT/mTOR signaling pathway promotes autophagy of articular chondrocytes and attenuates inflammatory response in rats with osteoarthritis[J].Biomed Pharmacother，2017，89：1252-1261.

[33]Croft M，Benedict CA，Ware CF.Clinical targeting of the TNF and TNFR superfamilies[J].Nat Rev Drug Discov，2013，12（2）：147-168.

[34]Qu R，Chen X，Wang W，et al.Ghrelin protects against osteoarthritis through interplay with Akt and NF-κB signaling pathways[J].FASEB J，2018，32（2）：1044-1058.

[35]Zhao Y，Li Y，Qu R，et al.Cortistatin binds to TNF-α receptors and protects against osteoarthritis[J].EBioMedicine，2019，41：556-570.

[36]Song J，Kim D，Chun CH，et al.miR-370 and miR-373 regulate the pathogenesis of osteoarthritis by modulating one-carbon metabolism via SHMT-2 and MECP-2，respectively[J].Aging Cell，2015，14（5）：826-837.

（2020-04-17收稿 責(zé)任編輯：徐穎）