三七通舒膠囊聯(lián)合丁苯酞治療腦梗死的通用分子機(jī)制研究

陳瑤 周德生 顏思陽(yáng)

摘要 目的：采用生物信息學(xué)方法，分析腦梗死氣虛血瘀證、陰虛血瘀證證型相關(guān)特異性基因及共性基因，并對(duì)三七通舒膠囊聯(lián)合丁苯酞治療腦梗死血瘀證的通用分子機(jī)制進(jìn)行探討，為中西醫(yī)結(jié)合防治腦梗死提供理論依據(jù)。方法：分析GEO芯片數(shù)據(jù)，篩選獲得腦梗死氣虛血瘀證、陰虛血瘀證差異基因，將2種血瘀證差異基因取交集得證型相關(guān)特異性基因與血瘀證共性基因3個(gè)子集。從蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)、基因本體（GO）及京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）富集分析角度，探討2種血瘀證特異基因的作用異同。篩選三七通舒膠囊聯(lián)合丁苯酞活性成分靶點(diǎn)與血瘀證共性基因整合，獲得“藥物-疾病-證型”共同靶點(diǎn)，拓?fù)浞治鼍劢购诵陌悬c(diǎn)并行分子對(duì)接，并構(gòu)建共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)并行富集分析，探討三七通舒膠囊聯(lián)合丁苯酞治療腦梗死血瘀證的作用機(jī)制。結(jié)果：獲取腦梗死氣虛血瘀證差異基因2 092個(gè)、陰虛血瘀證差異基因2 160個(gè)，其中氣虛血瘀證特異基因422個(gè)、陰虛血瘀證特異基因490個(gè)及血瘀證共性基因1 670個(gè)。其中氣虛血瘀證、陰虛血瘀證差異基因均通過(guò)多組分、多功能、多途徑發(fā)揮作用，但氣虛血瘀證中MMP-9、EIF4A3等靶點(diǎn)相互作用最強(qiáng)，主要通過(guò)T細(xì)胞受體信號(hào)通路等發(fā)揮作用;陰虛血瘀證中EGFR、STAT3等靶點(diǎn)相互作用最強(qiáng)，并通過(guò)ErbB信號(hào)通路發(fā)揮作用。篩選獲得274個(gè)藥物靶點(diǎn)，整合血瘀證共性基因后得32個(gè)共同靶點(diǎn)，拓?fù)浞治龊缶劢购诵陌悬c(diǎn)SRC，分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)氫鍵連接、混合Pi鍵連接和疏水作用可能是主要作用形式。三七通舒膠囊聯(lián)合丁苯酞以多組分、多功能、多途徑的形式介導(dǎo)趨化因子信號(hào)通路，cAMP信號(hào)通路等在腦梗死血瘀證中發(fā)揮作用。結(jié)論：2種血瘀證證型相關(guān)特異基因分析揭示了證型富集特點(diǎn)，為證型相關(guān)研究提供依據(jù)?！八幬?疾病-證型”共同靶點(diǎn)的分析結(jié)果揭示了三七通舒膠囊聯(lián)合丁苯酞治療腦梗死血瘀證可能的通用分子機(jī)制。為中西醫(yī)結(jié)合治療腦梗死提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞 三七通舒膠囊;丁苯酞;腦梗死;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);分子對(duì)接

Abstract Objective：To analyze the specific and common genes related to qi deficiency and blood stasis syndrome and yin deficiency and blood stasis syndrome of cerebral infarction by bioinformatics method，and to explore the mechanism of Sanqi Tongshu Capsule combined with butylphthalide in the treatment of blood stasis syndrome of cerebral infarction in order to provide theoretical basis for the prevention and treatment of cerebral infarction with combination of traditional Chinese and Western medicine.Methods：GEO chip data was analyzed，differential genes of qi deficiency and blood stasis syndrome was obtained and screened.From the perspective of PPI co-expression network，GO and KEGG enrichment analysis，the similarities and differences of the 2 blood stasis syndrome-specific genes were discussed.Sanqi Tongshu Capsules combined with butylphthalide active ingredient targets and blood stasis syndrome common gene integration was screened，and a common target of “drug-disease-syndrome” was obtained.Topological analysis focusing on core targets and parallel molecular docking，and common targets PPI network parallel enrichment analysis was constructed to explore the mechanism of Sanqitongshu Capsule combined with butylphthalide in the treatment of cerebral infarction with blood stasis syndrome.Results：A total of 2 092 differential genes of qi deficiency and blood stasis syndrome and 2 160 differential genes of yin deficiency and blood stasis syndrome of cerebral infarction were obtained，including 422 specific genes of qi deficiency and blood stasis syndrome，490 specific genes of yin deficiency and blood stasis syndrome and 1 670 common genes of blood stasis syndrome.Among them，there were 422 specific genes for qi deficiency and blood stasis syndrome，490 specific genes for Yin deficiency and blood stasis syndrome，and 1 670 common genes for blood stasis syndrome.Among them，the differential genes of qi deficiency and blood stasis syndrome and yin deficiency and blood stasis syndrome play a role through multi-component，multi-function，and multiple pathways.However，targets such as MMP-9 and EIF4A3 in qi deficiency and blood stasis syndrome have the strongest interaction，mainly through T cell receptors.In yin deficiency and blood stasis syndrome，EGFR，STAT3 and other targets have the strongest interaction，and they play a role through the ErbB signaling pathway.A total of 274 drug targets were screened and 32 common targets were obtained after integration of the common genes of blood stasis syndrome.After topological analysis，the core target SRC was focused.Hydrogen bond connection，mixed Pi bond connection and hydrophobic interaction were found to be the main action forms in molecular docking.The enrichment results of GO and KEGG showed that Sanqi Tongshu Capsule combined with butylphthalide mediated chemokine signaling pathway and cAMP signaling pathway in the form of multi-component，multi-function and multi-pathway in the blood stasis syndrome of cerebral infarction.Conclusion：The analysis of specific genes related to the 2 types of blood stasis syndrome reveals the enrichment characteristics of syndrome types and provides a basis for the related research of syndrome types.The analysis of the common target of “drug-disease-syndrome” reveals the possible general mechanism of Sanqi Tongshu Capsule combined with butylphthalide in the treatment of blood stasis syndrome of cerebral infarction，which provides basis for the treatment of cerebral infarction with the combination of traditional Chinese medicine and Western medicine.

Keywords Sanqi Tongshu Capsule; Butylphthalide; Cerebral infarction; Network pharmacology; Molecular docking

中圖分類(lèi)號(hào)：R285文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.07.006

腦梗死是一種神經(jīng)內(nèi)科常見(jiàn)病、多發(fā)病，具有高病死率、致殘率的特點(diǎn)[1-2]。超早期溶栓或橋接機(jī)械取栓是目前治療腦梗死最為有效的手段，但嚴(yán)格的時(shí)間窗限制了溶栓比率，出血轉(zhuǎn)化限制了治療效果，故積極恢復(fù)腦循環(huán)，縮小缺血區(qū)域，改善神經(jīng)功能是亟待解決的臨床問(wèn)題，而中西醫(yī)結(jié)合防治策略具有重要意義[3]。中國(guó)腦梗死中西醫(yī)結(jié)合診治指南指出中西醫(yī)應(yīng)當(dāng)結(jié)合治療，互相補(bǔ)充，且在辨證的基礎(chǔ)上活血通絡(luò)應(yīng)貫穿于治療的始終[4]。急性缺血性卒中指南指出丁苯酞目前是國(guó)內(nèi)改善腦血循環(huán)的主要藥物之一，但丁苯酞以化學(xué)單體為有效成分，作用靶點(diǎn)較為單一，而三七通舒膠囊作為活血化瘀中成藥制劑之一，具有多種成分，可通過(guò)多靶點(diǎn)發(fā)揮作用，二者聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同治療、增加作用靶點(diǎn)的特點(diǎn)，二者臨床常聯(lián)合使用治療腦梗死[3]。本研究從生物信息學(xué)出發(fā)，整合多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，分析腦梗死氣虛血瘀證、陰虛血瘀證差異基因，探討證型相關(guān)特異基因的異同，并對(duì)三七通舒膠囊聯(lián)合丁苯酞治療腦梗死血瘀證通用分子機(jī)制進(jìn)行探討，為中西醫(yī)結(jié)合防治腦梗死提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 腦梗死氣虛血瘀證與陰虛血瘀證差異基因（DEGs）的篩選 利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），以“cerebral infarction”O(jiān)R“Blood Stasis”為檢索詞，獲取GSE100235數(shù)據(jù)集，數(shù)據(jù)集中各模型組均為再灌注24 h后取材，考慮為腦梗死早期。包括有假手術(shù)組（Sham組）：GSM2675543、GSM2675544、GSM2675545;氣虛血瘀模型組（QDBS組）：GSM2675543、GSM2675544、GSM2675545;陰虛血瘀模型組（YDBS組）：即GSM2675546、GSM2675547、GSM2675548。

利用R語(yǔ)言分別對(duì)QDBS組（3組）和Sham組、YDBS組（3組）和Sham組數(shù)據(jù)表達(dá)矩陣進(jìn)行質(zhì)量控制，繪制箱式圖及主成分分析圖;并采用limma包對(duì)表達(dá)矩陣進(jìn)行差異性分析，以|logFC|≥1與adj.P.Val<0.05為篩選條件，分別篩選出腦梗死氣虛血瘀證與陰虛血瘀證DEGs，繪制火山圖及前50位熱圖。

進(jìn)一步將腦梗死氣虛血瘀證與陰虛血瘀證DEGs取交集，獲得氣虛血瘀證、陰虛血瘀證證型相關(guān)特異基因與血瘀證共性基因3個(gè)子集，并利用韋恩圖將結(jié)果可視化。

1.2 2種血瘀證證型相關(guān)特異性基因分析 利用String功能蛋白關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)定“Multiple proteins”模式，分別導(dǎo)入腦梗死陰虛血瘀證、氣虛血瘀證證型相關(guān)特異基因，物種選定“Homo sapiens”，余均為默認(rèn)設(shè)置，獲取蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）相關(guān)信息[5]。利用Cytoscape對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化，采用Cytoscape cytoHubba對(duì)PPI進(jìn)行Degree、Betweenness、Closeness算法拓?fù)浞治?，篩選出各算法前10位差異基因。同時(shí)利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，分別對(duì)2種證型特異基因進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）及京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）富集。以“OFFICIAL GENE SYMBOL”格式導(dǎo)入，設(shè)定“Background”為“Homo sapiens”，設(shè)定P<0.05，分別導(dǎo)出細(xì)胞組分（Cellular Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）、生物過(guò)程（Biological Process，BP）和KEGG通路富集，對(duì)P值取負(fù)對(duì)數(shù)，得出“-lgP”，P值越小，-lgP值越大，富集程度越大，并按-lgP排序，利用R語(yǔ)言ggplot2軟件包對(duì)前10位進(jìn)行可視化。

1.3 潛在藥物靶點(diǎn)預(yù)測(cè)與腦梗死血瘀證共性基因共同靶點(diǎn)的篩選 藥物有效成分及結(jié)構(gòu)式的收集：1）三七通舒膠囊為三七三醇皂苷制劑，主要活性成分為三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、三七皂苷Re[6];丁苯酞有效成分為消旋-3-正丁基苯酞。2）采用PubChem[7]（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)收集各有效成分SDF結(jié)構(gòu)式。潛在藥物靶點(diǎn)收集：將有效成分結(jié)構(gòu)式導(dǎo)入Swiss Target Prediction[5]（http：//www.swisstargetprediction.ch/）數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取三七通舒膠囊聯(lián)合丁苯酞潛在藥物靶點(diǎn)。

將潛在藥物靶點(diǎn)與腦梗死血瘀證共性基因取交集，獲得三七通舒膠囊聯(lián)合丁苯酞治療腦梗死血瘀證可能作用的共同靶點(diǎn)，并利用韋恩圖將結(jié)果可視化。

1.4 共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及拓?fù)浞治?將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)獲取PPI相關(guān)信息，并利用Cytoscape對(duì)PPI信息進(jìn)行可視化。利用Network analyzer對(duì)PPI進(jìn)行拓?fù)浞治?，根?jù)Degree值篩選。同時(shí)利用cytoHubba插件進(jìn)行Degree、Betweenness、Closeness拓?fù)浞治霁@取前10位靶點(diǎn)，篩選藥物作用核心靶點(diǎn)。

1.5 共同靶點(diǎn)GO和KEGG富集分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集與KEGG通路富集分析。設(shè)定P<0.05，分別導(dǎo)出CC、MF、BP和KEGG通路富集，對(duì)P值取負(fù)對(duì)數(shù)，得出“-lgP”，并按-lgP排序，利用R語(yǔ)言ggplot2軟件包對(duì)前10位進(jìn)行可視化。

1.6 分子對(duì)接模擬 將1.3中獲得的藥物主要活性成分導(dǎo)入Chem3D進(jìn)行優(yōu)化;將1.4項(xiàng)下篩選出的核心蛋白靶點(diǎn)通過(guò)PDB[8]（https：//www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇最佳蛋白晶體結(jié)構(gòu)并下載其“PDB”格式文件。AutoDock Tools對(duì)活性成分進(jìn)行預(yù)處理，使能量最小化。Discovery Studio對(duì)蛋白進(jìn)行除水、加氫并預(yù)測(cè)對(duì)接活性位點(diǎn)，獲得配置參數(shù)坐標(biāo)。利用AutoDock Vina將活性成分分別與核心蛋白對(duì)接。PyMOL、Discovery Studio軟件對(duì)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 腦梗死氣虛血瘀證與陰虛血瘀證差異基因（DEGs）篩選結(jié)果 利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取GSE100235數(shù)據(jù)集，采用R語(yǔ)言limma包分別對(duì)QDBS-Sham組、YDBS-Sham組數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化與差異分析，并分別繪制QDBS-Sham組與YDBS-Sham組箱式圖（圖1A、圖1B）、主成分分析（PCA）圖（圖1C、圖1D）、差異基因火山圖（圖2A、圖2B）及前50位差異基因熱圖（圖3A、圖3B）。

歸一化、主成分分析結(jié)果顯示QDBS-Sham組、YDBS-Sham組各數(shù)據(jù)均處于同一數(shù)量級(jí)，可進(jìn)行綜合分析?；鹕綀D、熱圖結(jié)果顯示：腦梗死氣虛血瘀證差異基因共2 092個(gè)，其中1 825個(gè)表達(dá)上調(diào)，267個(gè)表達(dá)下調(diào);陰虛血瘀證差異基因共2 160個(gè)，其中1 985個(gè)差異基因表達(dá)上調(diào)，175個(gè)差異基因表達(dá)下調(diào)。

進(jìn)一步對(duì)腦梗死氣虛血瘀證、陰虛血瘀證差異基因取交集，并利用韋恩圖將結(jié)果可視化見(jiàn)圖4A、圖4B，其中有1 552個(gè)差異基因在2種證型中均表達(dá)上調(diào)（如JAK2、CASP3、CXCR5等），腦梗死氣虛血瘀證特異性上調(diào)基因273個(gè)（如EIF2AK3、CCR9等）、陰虛血瘀證特異性上調(diào)基因433個(gè);118個(gè)差異基因在2種證型中均表達(dá)下調(diào)，149個(gè)氣虛血瘀證特異性下調(diào)基因，57個(gè)陰虛血瘀證特異性下調(diào)基因。綜合可得3個(gè)子集，即腦梗死氣虛血瘀證特異基因（422個(gè)）、陰虛血瘀證特異基因（490個(gè)）及血瘀證共性基因（1 670個(gè)）。

2.2 腦梗死2種血瘀證證型相關(guān)特異基因富集分析結(jié)果 通過(guò)String數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape軟件分別對(duì)腦梗死氣虛血瘀證、陰虛血瘀證特異基因進(jìn)行Degree、Betweenness、Closeness算法拓?fù)浞治?，分別篩選出各算法前10位基因。見(jiàn)表1～2。其中氣虛血瘀特異基因主要聚集在CCT7、MMP-9、EIF4A3等，陰虛血瘀特異基因主要聚集在EGFR、STAT3、ITGAM等。

GO和KEGG富集結(jié)果表明：氣虛血瘀證特異基因主要分布于膜、核質(zhì)、外泌體、核仁、細(xì)胞質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體等細(xì)胞組分，通過(guò)蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP依賴(lài)性解旋酶活性、凝血酶受體活性、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等，調(diào)控血小板活化、DNA修復(fù)、rRNA加工、免疫反應(yīng)、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控等生物途徑，通過(guò)T細(xì)胞受體信號(hào)通路、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、血小板活化、泛素介導(dǎo)的蛋白水解等信號(hào)通路發(fā)揮作用。陰虛血瘀證差異基因主要分布于細(xì)胞外泌體、胞質(zhì)溶膠、高爾基體、核膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、吞噬溶酶體等，通過(guò)蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合、受體活性、微管結(jié)合等，調(diào)控炎癥反應(yīng)、凋亡過(guò)程、信號(hào)傳導(dǎo)、趨化性、免疫反應(yīng)、白細(xì)胞遷移等生物過(guò)程，主要富集于Toll樣受體信號(hào)通路、造血細(xì)胞譜系、ErbB信號(hào)通路等發(fā)揮作用。利用R語(yǔ)言ggplot2軟件包，按-lgP排序，將2組前10位結(jié)果可視化。見(jiàn)圖5A、圖5B、圖6A、圖6B。

2.3 潛在藥物靶點(diǎn)與腦梗死血瘀證共性基因共同靶點(diǎn)篩選結(jié)果 通過(guò)文獻(xiàn)挖掘，收集三七通舒膠囊、丁苯酞主要活性成分4個(gè)，利用Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)獲得其結(jié)構(gòu)式，通過(guò)Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)活性成分相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，得到三七通舒膠囊聯(lián)合丁苯酞274個(gè)潛在靶點(diǎn)，其中丁苯酞108個(gè)，三七通舒膠囊175個(gè)靶點(diǎn)。

將藥物靶點(diǎn)與腦梗死血瘀證共性基因取交集，獲得三七通舒膠囊聯(lián)合丁苯酞治療腦梗死血瘀證靶點(diǎn)32個(gè)，并利用韋恩圖將結(jié)果可視化。見(jiàn)圖7，具體靶點(diǎn)見(jiàn)表3。

2.4 共同靶點(diǎn)蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用String數(shù)據(jù)庫(kù)及Cytoscape軟件對(duì)共同靶點(diǎn)進(jìn)行PPI分析，得出PPI網(wǎng)絡(luò)圖。設(shè)定1≤Degree值<5為綠色，5≤Degree值<10為粉色，Degree值≥10為大紅色。見(jiàn)圖8。該網(wǎng)絡(luò)圖中共有31個(gè)靶點(diǎn)（PLA2G7無(wú)相互作用），其中CASP3（Degree值=15），SRC（Degree值=13），NR3C1（Degree值=10）等，表明三七通舒膠囊聯(lián)合丁苯酞可通過(guò)多個(gè)作用靶點(diǎn)在腦梗死中發(fā)揮作用。

進(jìn)一步利用Cytoscape中cytoHubba插件進(jìn)行Degree、Closeness、Betweenness算法拓?fù)浞治觯Y選出各算法前10位差異基因。見(jiàn)表4。根據(jù)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果，明確共同靶點(diǎn)核心基因?yàn)镃ASP3、SRC、NR3C1，與Degree值分析結(jié)果一致。

2.5 共同靶點(diǎn)GO和KEGG富集分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)32個(gè)共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO及KEGG富集分析，共富集92個(gè)BP、17個(gè)CC、26個(gè)MF以及69個(gè)KEGG通路。對(duì)P值取負(fù)對(duì)數(shù)，篩選出富集程度前10位進(jìn)行分析，可視化見(jiàn)圖9A、圖9B。GO富集結(jié)果顯示，共同靶點(diǎn)主要分布于細(xì)胞表面、胞質(zhì)溶膠、質(zhì)膜、神經(jīng)元投射、磷脂酰肌醇-3-激酶復(fù)合物、細(xì)胞質(zhì)等細(xì)胞成分中，通過(guò)調(diào)節(jié)多種激酶（如蛋白激酶、氨肽酶、磷脂酰肌醇-3-激酶）的活性、激酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合等方式，參與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路、白細(xì)胞遷移、蛋白質(zhì)磷酸化、磷脂酰肌醇介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)、血小板活化等生物過(guò)程。而這些生物過(guò)程主要通過(guò)趨化因子信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路等發(fā)揮作用。提示三七通舒膠囊聯(lián)合丁苯酞可通過(guò)多細(xì)胞組分、多途徑參與多種生物過(guò)程，并富集于多種通路治療腦梗死血瘀證。

2.6 分子對(duì)接模擬結(jié)果 共同靶點(diǎn)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果表明，核心基因主要為CASP3、SRC等，結(jié)合KEGG富集結(jié)果，CASP3主要富集通路與腫瘤相關(guān)，與本研究所探討的內(nèi)容無(wú)關(guān)，且CASP3常作為下游效應(yīng)蛋白發(fā)揮作用，故暫不將其列為核心基因。而KEGG富集結(jié)果表明，SRC主要通過(guò)參與趨化因子信號(hào)通路在腦梗死中發(fā)揮調(diào)控作用。SRC原癌基因?yàn)榉鞘荏w酪氨酸激酶，其主要磷酸化位點(diǎn)包括一個(gè)由相鄰SRC分子在激酶域中磷酸化產(chǎn)生的pTyr419激活性位點(diǎn)和由C端SRC激酶（CSK）或CSK同源激酶（CHK）產(chǎn)生的pTyr530抑制性位點(diǎn)[9]。研究表明，SRC抑制劑在缺血性腦損傷早期有效[10-11]，抑制SRC不會(huì)影響中風(fēng)后急性的腦血流量或缺血半球的灌注[11]，且在腦梗死早期，活化的SRC激酶可通過(guò)上調(diào)VEGFA的產(chǎn)生，加重缺血后的血腦屏障滲漏[12]。所以在腦梗死早期應(yīng)當(dāng)抑制SRC激酶的磷酸化，減輕血腦屏障的破壞，以保護(hù)神經(jīng)功能。所以腦梗死急性期治療藥物應(yīng)當(dāng)作用于SRC的C端抑制性位點(diǎn)。

在PDB官網(wǎng)中獲取c-SRC結(jié)構(gòu)式，利用AutoDock vina分別將丁苯酞、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、三七皂苷Re與其進(jìn)行分子對(duì)接模擬，利用PyMOL、Discovery Studio軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化。見(jiàn)圖10。分子對(duì)接模擬結(jié)果表明，丁苯酞與三七通舒膠囊活性成分主要通過(guò)氫鍵、烷基疏水鍵、混合Pi/烷基疏水鍵等與c-SRC相結(jié)合。

3 討論

腦梗死屬于中醫(yī)“缺血中風(fēng)”范疇，為神經(jīng)內(nèi)科常見(jiàn)病，因其起病急驟，病情變化迅速兇險(xiǎn)，通常遺留后遺癥，不僅給患者身心健康造成威脅，且增加了醫(yī)療負(fù)擔(dān)。中醫(yī)學(xué)對(duì)于中風(fēng)的認(rèn)識(shí)可追溯至《黃帝內(nèi)經(jīng)》，如《素問(wèn)·生氣通天論》曰“陽(yáng)氣者，大怒則形氣絕，而血菀于上，使人薄厥”;《素問(wèn)·調(diào)經(jīng)論》云：“血之與氣并走于上，則為大厥?！倍鴼v代醫(yī)家對(duì)于中風(fēng)的認(rèn)識(shí)頗多，現(xiàn)認(rèn)為其主要為虛（陰虛、氣虛）、火（肝火、心火）、風(fēng)（肝風(fēng)、外風(fēng)）、痰（風(fēng)痰、濕痰）、氣（氣逆）、血（血瘀）六端，而虛、火、風(fēng)、痰、氣五端可導(dǎo)致氣機(jī)無(wú)力或逆亂，血行停滯或瘀阻，進(jìn)而形成病理產(chǎn)物之瘀血阻滯腦脈腦絡(luò)，可見(jiàn)瘀為最終形成缺血中風(fēng)的核心。腦絡(luò)瘀阻，則清陽(yáng)不升，腦髓失于充養(yǎng)，元神失司，則見(jiàn)猝然昏仆，不省人事等;脈中瘀阻，則肢體缺于濡養(yǎng)、半身不遂、口眼歪斜等癥可見(jiàn)。而又以陰虛、氣虛最為根本，陰虛則或血化無(wú)源，或血液黏滯，氣虛則血行無(wú)力，氣血失和。故血瘀是缺血中風(fēng)發(fā)病的關(guān)鍵因素，而又以氣虛血瘀、陰虛血瘀為臨床常見(jiàn)證型。腦梗死臨床治療多以中西醫(yī)結(jié)合治療為主，其原則在于中西醫(yī)相互補(bǔ)充，取二者之長(zhǎng)，如西醫(yī)改善腦循環(huán)的藥物有限，而中藥中大部分活血化瘀藥物均具有改善腦循環(huán)的作用[4]。作為改善腦梗死后腦循環(huán)的藥物，丁苯酞常與三七通舒聯(lián)用，且有研究表明三七通舒膠囊聯(lián)合丁苯酞可有效改善急性腦梗死患者神經(jīng)損傷程度，降低血液黏度，防止血栓形成等[13]。

本研究從GEO芯片數(shù)據(jù)出發(fā)，PPI網(wǎng)絡(luò)和富集分析結(jié)果表明，2種證型特異基因均可通過(guò)多組分、多方式、多途徑參與腦梗死的病理進(jìn)程。但氣虛血瘀證特異基因中MMP-9、EIF4A3等相互作用最為明顯，富集通路主要為T(mén)細(xì)胞受體信號(hào)通路等;陰虛血瘀特異基因則聚集在EGFR、STAT3等，主要通路為ErbB信號(hào)通路等，提示證型不同，作用靶點(diǎn)及途徑可能存在差異，為證型相關(guān)研究提供依據(jù)。

進(jìn)一步利用Pubchem、Swiss Target Prediction獲取274個(gè)三七通舒膠囊聯(lián)合丁苯酞的活性成分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，整合藥物活性成分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與腦梗死血瘀證共性基因，獲得32個(gè)三七通舒膠囊聯(lián)合丁苯酞治療腦梗死血瘀證的作用靶點(diǎn)。共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果表明藥物主要作用靶點(diǎn)為SRC、CASP3、NR3C1、PIK3CA、PIK3R1、PIK3CG等，GO富集及KEGG富集結(jié)果表明，三七通舒膠囊聯(lián)合丁苯酞主要在多細(xì)胞組分通過(guò)調(diào)節(jié)多種激酶如蛋白激酶、氨肽酶、磷脂酰肌醇-3-激酶的活性、激酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合等方式，參與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路、蛋白質(zhì)磷酸化、磷脂酰肌醇介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)等生物過(guò)程，通過(guò)趨化因子信號(hào)通路等發(fā)揮作用。相關(guān)拓?fù)浞治龊Y選出核心靶點(diǎn)SRC，行分子對(duì)接表明三七通舒膠囊聯(lián)合丁苯酞主要活性成分可與c-SRC活性位點(diǎn)以氫鍵、巰基疏水鍵、Pi/巰基疏水鍵、范德華力等方式結(jié)合并發(fā)揮調(diào)控作用。

研究表明，在腦梗死早期，血腦屏障完整性的破壞不僅是梗死的結(jié)果，更會(huì)導(dǎo)致中風(fēng)的進(jìn)一步發(fā)展。在創(chuàng)傷和缺血性損傷的病理情況下，星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì)如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、趨化因子和細(xì)胞因子等，這些因素直接或間接加劇了腦損傷和血腦屏障的破壞[14-16]。MMPs的激活是缺血性血腦屏障破壞的主要原因，而MMPs抑制劑通常被認(rèn)為是血腦屏障的保護(hù)劑[17]。抑制MMPs的活性是中藥如通竅活血湯等血腦屏障保護(hù)作用的關(guān)鍵[18]。SRC激酶家族是涉及多種細(xì)胞過(guò)程（包括血腦屏障調(diào)節(jié)）的信號(hào)蛋白，已有研究表明，SRC激酶可調(diào)節(jié)MMP，從而參與血腦屏障的調(diào)節(jié)[19]，而抑制SRC激酶的磷酸化可能誘發(fā)腦梗死血腦屏障損傷并減輕腦水腫和梗死[10]。此外腦梗死后SRC激酶可調(diào)節(jié)大腦中VEGF介導(dǎo)的血管通透性，抑制SRC活性可降低血管通透性，從而減輕腦損傷[11]。PI3K/AKT通路的激活可介導(dǎo)下游核因子κB途徑減輕炎癥反應(yīng)以減少血腦屏障的破壞[20]。而PI3K/AKT通路可作為SRC的下游發(fā)揮作用[21]。

而丁苯酞預(yù)處理可減輕MCAO模型的血腦屏障損傷和腦水腫[22-23]。其可通過(guò)上調(diào)緊密連接打敗下調(diào)小窩蛋白減輕腦缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的血管通透性惡化，從而改善神經(jīng)功能和腦血流量，但其上游機(jī)制尚未得到明確闡述[24]。人參皂苷Rg1可能通過(guò)下調(diào)蛋白酶激活受體1（PAR-1）來(lái)減輕大鼠局灶性腦缺血所致的神經(jīng)損傷、腦梗死體積和血腦屏障通透性[25]。冰片配伍黃芪甲苷與三七總皂苷能不同程度降低腦缺血/再灌注后血腦屏障（BBB）通透性的增加，減輕腦水腫，對(duì)抗腦組織損傷[26]。此外，三七皂苷R1可通過(guò)PI3K/AKT通路減輕腦缺血缺氧性損傷[27]。人參皂苷代謝產(chǎn)物可通過(guò)抑制c-SRC/EGFR的磷酸化，介導(dǎo)下游信號(hào)分子的失活[28]。

綜上所述，通過(guò)整合多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，分析腦梗死氣虛血瘀證、陰虛血瘀證證型相關(guān)特異基因，揭示了證型相關(guān)富集特點(diǎn)，為證型相關(guān)研究提供依據(jù)?！八幬?疾病-證型”共同靶點(diǎn)的分析結(jié)果揭示了三七通舒膠囊聯(lián)合丁苯酞治療腦梗死血瘀證可能的通用機(jī)制。預(yù)測(cè)其可能通過(guò)調(diào)節(jié)SRC磷酸化，介導(dǎo)下游PI3K相關(guān)信號(hào)通路調(diào)節(jié)腦梗死血瘀證早期血腦屏障的通透性以減輕腦水腫，發(fā)揮早期腦梗死保護(hù)作用，為早期使用三七通舒膠囊聯(lián)合丁苯酞治療腦梗死提供依據(jù)。

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（2020-07-15收稿 責(zé)任編輯：芮莉莉）