基于HS-SPME-Arrow-GC-MS和化學計量學的小曲清香型原酒等級判別

樊杉杉,唐潔,樂細選,楊強,劉源才,陳雙,徐巖,范文來*,陳申習*

1(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122)2(釀造微生物與應用酶學實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122) 3(工業(yè)生物技術教育部重點實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122)4(勁牌有限公司,湖北 大冶,435100)5(勁牌有限公司 勁牌研究院,湖北 大冶,435100)

白酒是我國獨具民族特色的蒸餾酒,其釀造過程采用微生物混菌發(fā)酵、固態(tài)發(fā)酵、固態(tài)蒸餾的方式進行[1]。獨特的釀造過程一方面賦予了白酒復雜的風味特征；另一方面也造成釀造原酒風味質量的波動。為了科學管理原酒入庫,保障產(chǎn)品質量穩(wěn)定,白酒生產(chǎn)企業(yè)需對新釀造的原酒進行分級管理[2]。

目前生產(chǎn)上原酒的分級主要依靠感官品評或輔以總酸、總酯以及骨架成分含量進行判定[3]。感官品評具有快速準確的特點,但主觀性強,受個體差異和環(huán)境等影響,評價結果不穩(wěn)定,且評價結果多為文字性描述,難以對不同等級的差異進行量化。而白酒風味主要由除乙醇、水之外的微量成分決定[4],雖然目前骨架成分含量已納入原酒質量評價體系,但單獨依靠這些依舊無法準確區(qū)分原酒品質[5]。因此提高原酒質量等級評定的客觀性和有效性是中國白酒業(yè)一個亟待解決的技術問題。

全面解析食品組分化學信息是準確判定質量的基礎。近年來,國內(nèi)外逐漸采用儀器分析結合化學計量學的方式進行食品質量判定[6-8],常用的儀器分析技術包括色譜[4]、質譜[9]、光譜[10]、電子傳感技術[11]等。其中氣相色譜結合質譜法(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)具有較高的分離能力和對未知化合物的鑒定能力,目前被廣泛應用于酒類飲料的摻假識別[12]、年份酒鑒定[13]等。在酒類飲料分析中樣品前處理手段的選擇是決定GC-MS分析數(shù)據(jù)質量的重要因素[14]。頂空固相微萃取技術(head space-solid phase microextraction,HS-SPME)因其具有選擇性高、靈敏度高、無需溶劑、樣品量低及檢測快速的特點,是食品揮發(fā)性組分分析的最常用技術[15]。但近年來的應用實踐發(fā)現(xiàn),SPME萃取頭吸附容量不足很大程度上限制了對樣品中微量組分的分析效果[16]。針對這一問題,最近開發(fā)出的SPME Arrow萃取頭提高了萃取涂層的厚度[19],萃取體積比傳統(tǒng)SPME高24倍,更有利于樣品中微量組分的分離提取。利用HS-SPME-Arrow結合GC-MS可以較為全面地對白酒中的微量揮發(fā)性組分進行定性和定量分析。隨著分析方法的發(fā)展,我們可以獲得大量的分析數(shù)據(jù),化學計量學作為一種通過處理多元數(shù)據(jù)集并從中提取有用信息的方法，是一種處理數(shù)據(jù)的有效手段,目前已成功應用于食品分析研究[17-18]。將不同等級原酒中的微量組分含量進行適當?shù)幕瘜W計量學分析,預期可以提取出原酒等級區(qū)分的更多有效信息,進而構建準確判別模型。

本研究以不同等級的小曲清香型原酒為例,全面解析揮發(fā)性組分及含量,分析了不同等級原酒揮發(fā)性組分間的差異,利用其組分含量差異特征,構建了準確判別原酒等級的模型,以期為白酒品質等級評價標準化科學化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 儀器

GC 7890B-MSD 5975氣相色譜質譜聯(lián)用儀、CTC多功能自動進樣器、Millipore-Q超純水系統(tǒng)。

1.1.2 試劑

無水乙醇(色譜純),上海安譜科學儀器公司；C6～C30正構烷烴標準品、化合物定性及定量時所用標準品,均為色譜純,Sigma-Aldrich 公司；NaCl(分析純),上海國藥集團。實驗用水均為煮沸 5 min 后冷卻至室溫的超純水。

1.1.3 實驗材料

本研究所用68個不同等級小曲清香型白酒原酒樣品由勁牌有限公司提供,采用機械化新工藝生產(chǎn),酒精度為63%～65%(體積分數(shù)),生產(chǎn)時間為2020年。

1.2 試驗方法

1.2.1 小曲清香型原酒等級評定

組織7位具備國家二級品酒師以上資格的專業(yè)評酒員進行原酒樣品香氣品質的分級,每個品酒員保持相對獨立的條件下,對各個白酒樣品進行等級評價。

1.2.2 小曲清香型原酒揮發(fā)性組分解析

HS-SPME-Arrow提取樣品中揮發(fā)性組分：稱取1.5 g NaCl,準確量取5 mL使用超純水稀釋至10%(體積分數(shù))的酒樣于頂空瓶中,用帶PTFE/藍色硅膠隔墊的空心磁性金屬蓋密封。使用CTC公司多功能自動進樣系統(tǒng)(PAL)進行頂空固相微萃取。萃取過程如下：采用120 μm DVB/CAR/PDMS三相Arrow萃取頭,萃取溫度50 ℃,樣品平衡時間5 min,萃取時間50 min,乳化器轉速500 r/min。萃取結束后將萃取頭置于GC進樣口在250 ℃下解吸附5 min,進行GC-MS檢測分析。

GC條件：進樣口與檢測器溫度均為250 ℃,載氣為高純He,流速為1 mL/min,進樣模式為不分流進樣,色譜柱采用DB-FFAP(60 m×0.32 mm×0.25 μm)。升溫程序：起始溫度40 ℃,保持2 min后,以4 ℃/min的速度升溫至150 ℃,保持2 min,再以6 ℃/min的速度升溫至230 ℃,保持5 min。

MS條件：以EI電離源為離子源,電離能量70 eV,離子源溫度230 ℃,掃描范圍35.00～350.00 amu。

定性分析：通過將質譜、保留指數(shù)(retention index,RI)和純標準品進行比較,從而鑒定出揮發(fā)性化合物的結構式。RI是根據(jù)在相同色譜條件下正構烷烴(C6～C30)的線性保留時間計算的。

1.2.3 小曲清香型原酒揮發(fā)性組分定量解析

HS-SPME-Arrow-GC-MS定量揮發(fā)性組分：采用內(nèi)標標準曲線法對小曲清香型原酒中的揮發(fā)性組分進行全定量解析。構建標曲過程如下所示：吸取一定量的各組分標準品,加入到10%(體積分數(shù))的白酒模擬基質中制成混合標準母液(乙醇+乳酸,pH 4.0),并進行梯度稀釋(以2為梯度稀釋倍數(shù)),一共10個點,且各類標準品分開配制。在20 mL頂空瓶中加入5 mL標準品混合溶液或經(jīng)稀釋的酒樣,加入1.5 g NaCl,在每個梯度的標準樣品和酒樣瓶中分別加入40 μL 1 197.10 μg/L的叔戊酸內(nèi)標和其他混合內(nèi)標[2-辛醇(294.08 μg/L)、乙酸-2-苯乙酯-D3(146.34 μg/L)、正己醇-D13(322.66 μg/L)、2-甲氧基苯酚-D3(307.37 μg/L)]。在與1.2.2的相同的條件下進行HS-SPME-Arrow-GC-MS解析,利用Agilent 數(shù)據(jù)分析工作站,通過計算各組分與內(nèi)標峰面積和濃度的比值構建各揮發(fā)性組分的定量標準曲線,從而計算酒樣中各物質的含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用 SIMCA 14.0 進行偏最小二乘判別分析(partial least squares discrimination analysis,PLS-DA),利用SPSS 20.0進行單因素方差分析(one-way analysis of variance,ANOVA)。

2 結果與討論

2.1 小曲清香型原酒等級評定

綜合7位專業(yè)評酒員的等級評價結果,如表1所示,68個樣品中共有優(yōu)級酒20個,記為Y-1～Y-20；一級酒28個,記為I-1～I-28；二級酒20個,記為II-1～II-20。

2.2 不同等級小曲清香型原酒揮發(fā)性組分含量差異

小曲清香型原酒HS-SPME-Arrow-GC-MS分析的總離子流圖如圖1所示,共鑒定出66種揮發(fā)性組分(表2)。

圖1 小曲清香型原酒HS-SPME-Arrow-GC-MS分析總離子流圖

表2 不同等級小曲清香型原酒樣品揮發(fā)性成分含量范圍

包括酯類23種,醇類12種,醛酮類9種,酸類10種,酚類6種,含硫化合物3種,萜烯類化合物3種。其中大部分化合物是白酒中常見的化合物[19-21],在小曲清香型白酒中新發(fā)現(xiàn)了13種化合物,分別為己酸丙酯、1-庚醇、4-甲基戊酸、4-甲基苯酚、4-乙基苯酚、愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、甲硫醇、二甲基二硫、二甲基三硫、β-大馬酮、土味素和β-紫羅酮。這是首次從小曲清香型白酒中鑒定出含硫化合物和萜烯類這種白酒中較為關注的“量微香大”化合物[22]。

酯類物質是白酒中的主要呈香物質,也是白酒質量鑒定的重要指標,通過醇和酸的酯化反應形成[23],且優(yōu)級酒中的酯類物質含量稍高于一二級酒。醇類化合物為釀酒酵母通過分解代謝途徑和合成代謝途徑產(chǎn)生[24],高級醇的含量對白酒品質有很大的影響,醇類物質含量隨著等級的降低而升高,適宜質量濃度的高級醇可以賦予酒特殊的香氣,但含量過高,易產(chǎn)生異雜味。以乙醛和乙縮醛為代表的醛酮類化合物也大量存在于樣品中,但不同等級小曲清香型白酒中的醛酮類物質在含量上相差不大。酸類化合物主要由細菌產(chǎn)生,含量度較低時呈現(xiàn)一定的奶酪香氣,具有助香作用,而含量較高具有明顯的酸臭味,從表2可知,二級酒中的酸類物質稍高于優(yōu)級酒和一級酒。酚類物質是白酒芳香族物質中的主要成分,多在制曲過程中由微生物產(chǎn)生,也可由氨基酸或單寧等物質反應生成[25],不同等級小曲清香型原酒中的酚類物質在含量上相差不大。

從定量結果統(tǒng)計來看單一或者多種揮發(fā)性組分的含量差異無法直觀的實現(xiàn)對原酒等級的區(qū)分和鑒別,因此,需要借助化學計量學數(shù)據(jù)分析手段對定量結果進行挖掘以獲得更多的可用信息來得到更好的區(qū)分效果。

2.3 不同等級小曲清香型原酒判別模型構建

對目前企業(yè)原酒分級所依據(jù)的理化指標進行收集,包括乙醛、甲醇、正丙醇、乙酸乙酯、雜醇油,對數(shù)據(jù)進行有監(jiān)督的PLS-DA分析,發(fā)現(xiàn)僅依賴少數(shù)理化指標數(shù)據(jù)無法實現(xiàn)3種不同等級的酒樣的有效區(qū)分。

為了進一步提取對不同等級原酒區(qū)分有重大貢獻的揮發(fā)性組分,進行了PLS-DA的研究,如圖2-a所示,通過可靠的PLS-DA模型可以很好地區(qū)分3個等級樣品。該模型提取的3個主成分解釋了74.4%,說明這3個成分可反映樣品的總體情況。此外進行了200次的置換檢驗,通過檢驗圖(圖2-b)可以看出所有位于左邊的R2和Q2值均低于右邊R2和Q2值,且Q2回歸線的截距為負值,表明該模型未過擬合[26]。

Y-優(yōu)級；I-一級；II-二級

變量投影重要度(variable importance for the projection,VIP)表征了分類過程中各個變量的重要性,通常VIP值大于1的變量在不同樣本組之間的區(qū)分中起著重要作用。通過VIP值篩選出25個差異標記物,ANOVA分析進一步驗證了這些物質含量在不同等級之間具有顯著差異(P<0.05)(表3)。

表3 基于PLS-DA篩選不同等級小曲清香型原酒品質差異標記物

這些物質中除3-甲基丁醇、己酸、丁酸、戊酸、乳酸乙酯、乙酸異戊酯平均含量高于5 mg/L以外,其余物質均低于2 mg/L,說明微量化合物對于白酒品質區(qū)分具有重要意義。其中β-大馬酮、二甲基三硫、甲硫醇及土味素在白酒中的的閾值[22]分別為0.12、0.36、2.20和0.11 μg/L,在不同等級小曲清香型白酒中的OAV值分別高達57～138、83～213、20～49及19～122,對小曲清香型白酒風味特征具有重要貢獻。β-大馬酮呈現(xiàn)令人愉悅的蜂蜜,玫瑰香氣,其含量隨著等級的降低而降低,對于白酒品質鑒別具有關鍵作用。

二甲基三硫和甲硫醇在低質量濃度時為白酒中的重要香氣成分,其含量隨等級降低而降低。土味素是白酒中泥土氣味的主要來源,是重要的異嗅味物質,其含量隨等級降低而增加。

PLS-DA除了對樣本主要矩陣特征進行更深入分析外,在降維的同時結合了回歸模型,并利用一定的判別閾值對回歸結果進行判別分析[27]。為了建立一個快速準確的等級判別模型,以55個樣本為訓練集,以各個樣本的25個差異標記物的含量為變量,提供各個樣本的等級信息,使用SIMCA 14.0軟件自動擬合PLS-DA判別模型,該模型基于4個主成分的R2Y(cum)= 0.995、Q2Y(cum)= 0.924,模型的解釋變異度(R2Y)和預測能力(Q2Y)接近于1,表明該模型的適用性和可預測性較好[26]。模型構建好后,以13個樣本為測試集對模型進行驗證,圖3為模型對不同等級13個樣本進行判別分析的結果,從圖3-a中可以看出,驗證集中4個優(yōu)級酒的分類變量的預測值都接近于1,在0.5～1.5之內(nèi),而其他2個等級的分類變量的預測值基本為0,在-0.5～0.5之內(nèi),從圖3-b、圖3-c可以看出一級酒和二級酒的預測值亦是如此。根據(jù)PLS-DA法的判別準則可知,驗證集中的所有酒樣都被正確的識別,即識別率為100%。

a-優(yōu)級酒；b-一級酒；c-二級酒

3 結論

本研究采用HS-SPME-Arrow-GC-MS方法對68個原酒樣品的揮發(fā)性組分進行了全面解析,分析了不同等級小曲清香型原酒中66種揮發(fā)性組分的精確含量。利用66種揮發(fā)性組分在所有樣品中的含量對不同等級原酒進行了PLS-DA 分析,可以將68個不同等級的酒樣進行有效分離,并且通過VIP值篩選出25個等級差異標記物,其中大部分物質屬于白酒中“量微香大”類香氣化合物,對原酒品質具有重要影響。以這25個物質在55個校正集樣品中的含量構建了PLS-DA原酒等級判別模型,并選擇13個樣品為測試集進行驗證,在判定結果中測試樣本與訓練樣本的正確率均為100%。本研究建立的不同等級的小曲清香型原酒質量等級判別模型將進一步在企業(yè)進行推廣驗證,預期將為白酒原酒品質等級評價標準化提供一定的支撐。