異甘草素聯(lián)合順鉑抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖的效果研究

梅瑜 張松 蔣靜

乳腺癌是女性常見的癌癥之一，是全球第五大癌癥死亡原因[1-2]。在眾多乳腺癌亞型中，三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer,TNBC）由于癌細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，是目前最難治療的乳腺癌亞型[3]。盡管現(xiàn)在有以聚（ADP-核糖）聚合酶1（PARP1）抑制劑為典型代表的多種小分子抑制劑被證明治療TNBC效果顯著[4-5]，但小分子抑制劑普遍存在適應(yīng)證范圍狹窄、易產(chǎn)生耐藥的問題[5-6]，目前臨床上用于治療TNBC的藥物主要還是紫杉醇和順鉑（cisplatin,DDP）等化療藥物[7]。然而，TNBC患者容易對化療藥物產(chǎn)生耐藥性，表現(xiàn)為臨床預(yù)后差、易復(fù)發(fā)[7-8]。DDP主要通過引起DNA損傷來誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[9-10]。癌細(xì)胞長期暴露于DDP下可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)參與DNA損傷修復(fù)的一些基因的過度表達(dá)和活化，導(dǎo)致DNA修復(fù)功能增強(qiáng)而產(chǎn)生耐藥性[11-12]。

異甘草素（isoliquiritigenin,ISL）是從甘草中提取出來的，具有抗腫瘤活性成分，被證明可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞自噬、抑制癌組織血管生成等多種機(jī)制治療乳腺癌[13-14]。同時有研究表明，ISL可導(dǎo)致其下游骨髓細(xì)胞瘤癌基因（c-Myc）的過度表達(dá)[15]。而c-Myc的異常表達(dá)被證明可上調(diào)重組酶51（Rad51）、乳腺癌易感基因（BRCA）1/2的表達(dá)，繼而促進(jìn)DNA同源重組（HR）修復(fù)[16-17]。因此本研究旨在探究ISL聯(lián)合DDP抑制TNBC細(xì)胞增殖的效果，并初步探討兩者協(xié)同治療TNBC的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株 人野生型TNBC細(xì)胞株MDA-MB-231購自上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心。

1.2 主要試劑與儀器 c-Myc一抗（批號：18583S）、Rad51一抗（批號：8875S）、BRCA1 一抗（批號：14823S）、BRCA2 一抗（批號：10741S）、β-肌動蛋白（β-actin）一抗（批號：4970S）、鼠二抗（批號：14709S）和兔二抗（批號：14708S）均購自美國Cell Signaling Technology公司；DDP（批號：P4394，規(guī)格：25 mg）和 ISL（批號：I3766，規(guī)格：10 mg）均購自美國Sigma-Aldrich公司；MTT細(xì)胞生長活力檢測試劑盒（批號：KGA311）、Annexin VFITC和典化丙啶（PI）凋亡檢測試劑盒（批號：KGA105）、彗星實(shí)驗(yàn)測試試劑盒（批號：KGA240）、Leibovitz's L-15培養(yǎng)基（批號：KGM41300-500）和胰酶（批號：KGY001）均購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；RIPA細(xì)胞裂解緩沖液（批號：SY021-100）購自南京三翊生物科技有限公司；Cytation 5酶標(biāo)儀購自美國Biotek公司；FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；EVOS XL Core倒置熒光顯微鏡購自美國 ThermoFisher公司；Gel DocTMXR+凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-rad公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國ThermoFisher公司；蛋白電泳儀系統(tǒng)購自美國Bio-rad公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人野生型TNBC細(xì)胞株MDA-MB-231置于含10%FBS、100 mg/L鏈霉素、100 KU/L青霉素的Leibovitz's L-15培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)箱條件：CO2濃度為5%，溫度為37°C。

1.3.2 細(xì)胞分組及細(xì)胞活力測定 采用MTT法。將對數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞隨機(jī)分為4組：ISL/DDP 聯(lián)用組（同時經(jīng) 10 μmol/L ISL 和 10 μmol/L DDP共同處理MDA-MB-231細(xì)胞48 h）、DDP處理組（經(jīng)30 μmol/L DDP 處理 MDA-MB-231細(xì)胞 48 h）、ISL 處理組（經(jīng)25 μmol/L ISL處理 MDA-MB-231細(xì)胞48 h）和對照組（未施藥的MDA-MB-231細(xì)胞）。將各組細(xì)胞以5×104個/ml接種于96孔板，培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞貼壁之后，給各組細(xì)胞施藥48 h，隨后加入MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸除上清液，在每孔加入150 μl DMSO，震蕩 30 s之后，用酶標(biāo)儀測定570 nm處的吸光度值。細(xì)胞活力=實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對照組吸光度值×100%。半數(shù)抑制濃度（IC50）值為抑制細(xì)胞活力到50%的藥物濃度。

1.3.3 ISL/DDP聯(lián)用組協(xié)同指數(shù)（CI）測定 參考ISL處理組和DDP處理組對應(yīng)藥物的IC50值，ISL/DDP聯(lián)用組 ISL 與 DDP 聯(lián)用比例設(shè)置為 4∶1、2∶1、1∶1、1∶2 以及 1∶4。公式 CI=CA,X/ICX,A+CB,X/ICX,B[18]。其中 CA,X和 CB,X分別表示ISL和DDP聯(lián)合用藥達(dá)到X%生長抑制率的濃度。而ICX,A和ICX,B則表示ISL和DDP單獨(dú)使用達(dá)到相同生長抑制率時的濃度。當(dāng)CI＜1時表明兩者聯(lián)用具有協(xié)同效果，CI=1時表明兩者沒有協(xié)同作用僅僅是加和作用，當(dāng)CI＞1時表明兩者聯(lián)用具有拮抗作用。

1.3.4 4組細(xì)胞凋亡率檢測 采用Annexin V-FITC和PI雙染法。將對數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞以2×105個/ml接種在6孔板上。將4組處理后的細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化，PBS清洗兩遍，按照試劑盒說明書方法分別用Annexin V-FITC和PI對各組細(xì)胞染色。采用流式細(xì)胞儀測定各組細(xì)胞凋亡情況，以Annexin V陽性的凋亡細(xì)胞比例作為凋亡率進(jìn)行統(tǒng)計，細(xì)胞凋亡數(shù)據(jù)采用FlowJo 7.6軟件處理。

1.3.5 4組細(xì)胞DNA損傷程度檢測 采用彗星實(shí)驗(yàn)法[19]。將對數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞以2×105個/ml接種在6孔板上。將4組處理后的細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化，并用不含Ca2+的PBS清洗兩遍。取1×104個/ml的細(xì)胞與低熔點(diǎn)瓊脂糖以1∶10混合并鋪在載玻片上。隨后用試劑盒裂解緩沖液在4°C環(huán)境下裂解細(xì)胞2 h，后在室溫下用堿性解旋液解旋DNA 30 min。將解旋過DNA的細(xì)胞在21 V條件下電泳30 min，之后用PI染色，在倒置熒光顯微鏡下觀察。每個載玻片隨機(jī)選擇5個視野進(jìn)行觀察。

1.3.6 4 組細(xì)胞 c-Myc、Rad51、BRCA1、BRCA2 表達(dá)水平檢測 采用Western blot法。收集各組處理后的細(xì)胞，用RIPA細(xì)胞裂解緩沖液在冰上裂解細(xì)胞60 min。取各組25.0 μg全蛋白用SDS-PAGE凝膠電泳分離，并將分離得到的目標(biāo)蛋白通過濕法電轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。膜上的蛋白用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，之后用一抗4°C孵育過夜，二抗室溫孵育1 h。最后，PVDF膜上的蛋白用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液顯色，檢測系統(tǒng)檢測后，用Image J處理并比較各組蛋白表達(dá)水平的差異。本研究實(shí)驗(yàn)室部分工作委托南京三翊生物科技有限公司完成。

2 結(jié)果

2.1 DDP處理組和ISL處理組細(xì)胞活力的比較 DDP處理組中，隨著DDP濃度的增加，細(xì)胞活力顯著降低，對應(yīng)的 IC50值為（29.8±2.3）μmol/L；ISL 處理組中，隨著ISL濃度的增加，細(xì)胞活力逐漸降低，對應(yīng)的IC50值為（25.6±1.8）μmol/L。見圖 1。

圖1 順鉑（DDP）處理組和異甘草素（ISL）處理組細(xì)胞生長活力的比較

2.2 ISL/DDP聯(lián)用組不同濃度比例時的CI比較 ISL/DDP 聯(lián)用組內(nèi)，當(dāng) ISL/DDP 聯(lián)用濃度比例為 1∶2、1∶1 以及2∶1時，對應(yīng)的CI均＜1.0。當(dāng)ISL/DDP聯(lián)用濃度比例為1∶1時，兩者抑制細(xì)胞活力到50%的CI值為0.84，協(xié)同效果最好。見圖2。

圖2 異甘草素（ISL）/順鉑（DDP）聯(lián)用組不同濃度比例時的協(xié)同指數(shù)（CI）比較

2.3 4組細(xì)胞凋亡率比較 與對照組比較，DDP處理組和ISL處理組細(xì)胞凋亡率均明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；與DDP處理組比較，ISL/DDP聯(lián)用組細(xì)胞凋亡率明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖 3、表 1。

表1 4組細(xì)胞凋亡率比較（%）

圖3 4組細(xì)胞凋亡率比較（ISL為異甘草素；DDD為順鉑）

2.4 4組細(xì)胞DNA損傷程度比較 與對照組比較，DDP處理組和ISL處理組細(xì)胞內(nèi)均可見明顯的DNA拖尾，DNA損傷程度顯著；與ISL處理組比較，ISL/DDP聯(lián)用組DNA拖尾現(xiàn)象更加明顯；與DDP處理組比較，ISL/DDP聯(lián)用組DNA拖尾現(xiàn)象無明顯變化。見圖4。

圖4 4組細(xì)胞DNA損傷程度比較（DDD為順鉑；ISL為異甘草素）

2.5 4組細(xì)胞 c-Myc、Rad51、BRCA1及 BRCA2表達(dá)水平比較 與對照組比較，DDP處理組Rad51和BRCA1表達(dá)水平均明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），ISL處理組 c-Myc、Rad51、BRCA1以及 BRCA2表達(dá)水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。與DDP 處理組比較，ISL/DDP 聯(lián)用組 c-Myc、Rad51、BRCA1以及BRCA2表達(dá)水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。與ISL處理組比較，ISL/DDP聯(lián)用組c-Myc、Rad51及BRCA2表達(dá)水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見圖5、表2。

表2 4組細(xì)胞c-Myc、Rad51、BRCA1及BRCA2表達(dá)水平比較

圖5 4組細(xì)胞骨髓細(xì)胞瘤癌基因（c-Myc）、重組酶51（Rad51）、乳腺癌易感基因1（BRCA1）及乳腺癌易感基因2（BRCA2）表達(dá)的電泳圖（DDD為順鉑；ISL為異甘草素；β-actin為β-肌動蛋白）

3 討論

TNBC細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，無法通過內(nèi)分泌及抗人表皮生長因子受體-2分子進(jìn)行靶向治療，因此是致死率很高的乳腺癌亞型[1-3]。盡管有很多小分子抑制劑相繼研發(fā)用于靶向治療TNBC，但由于抑制劑本身適應(yīng)證范圍狹窄，目前DDP和紫衫醇依舊是治療TNBC的臨床主要用藥[4-7]。與紫杉醇治療機(jī)制不同，DDP主要是通過與癌細(xì)胞DNA作用致DNA損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[9-10]。與所有的化療藥物相同，腫瘤細(xì)胞對DDP會產(chǎn)生適應(yīng)性耐藥[11-12]。耐藥細(xì)胞對DDP不再敏感，這限制了藥物的臨床使用。目前，針對單一藥物耐藥性問題，臨床主要通過聯(lián)合用藥來提高腫瘤治療效果。

ISL作為甘草提取物，其主要的抗腫瘤成分被證明可通過多種途徑抑制乳腺癌細(xì)胞惡性增殖。本研究發(fā)現(xiàn)ISL和DDP都可以很好地抑制野生型TNBC細(xì)胞MDA-MB-231的惡性增殖。通過雙藥協(xié)同實(shí)驗(yàn)，本研究亦發(fā)現(xiàn)ISL和DDP聯(lián)用可以協(xié)同抑制細(xì)胞活力。隨后，本研究分析了兩者聯(lián)用抑制MDA-MB-231細(xì)胞惡性增殖的原因，發(fā)現(xiàn)ISL和DDP聯(lián)用不僅可以協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，還可以促進(jìn)DNA損傷。

細(xì)胞內(nèi)DNA活性氧物種或者化療藥物誘導(dǎo)損傷之后，細(xì)胞內(nèi)一些參與DNA單鏈損傷修復(fù)及DNA雙鏈損傷修復(fù)的因子便會被激活并募集到損傷DNA處進(jìn)行修復(fù)[20]。DDP主要通過誘導(dǎo)DNA損傷發(fā)揮抗癌功效[9-10]。但針對單一化療藥物，癌細(xì)胞可通過激活一些DNA損傷修復(fù)相關(guān)的因子來抵制藥物對本身的殺傷作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，DDP在抑制細(xì)胞惡性增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和DNA損傷的同時，可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)HR修復(fù)相關(guān)蛋白Rad51和BRCA1的過度表達(dá)。作為參與HR修復(fù)的主要蛋白，Rad51和BRCA1的過度表達(dá)將導(dǎo)致細(xì)胞HR修復(fù)功能增強(qiáng)[17]。這將導(dǎo)致細(xì)胞在長時間暴露于DDP之后，對其產(chǎn)生耐藥性。而ISL可以通過下調(diào)c-Myc的表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)其下游蛋白Rad51、BRCA1、BRCA2的表達(dá)來抑制HR修復(fù)。ISL和DDP聯(lián)用之后，細(xì)胞內(nèi)c-Myc、Rad51、BRCA1以及BRCA2的表達(dá)量明顯降低?；诖耍狙芯繄F(tuán)隊推斷ISL可通過阻遏損傷DNA的HR修復(fù)途徑，協(xié)同促進(jìn)DDP引起的細(xì)胞DNA損傷和細(xì)胞凋亡，繼而抑制細(xì)胞的惡性增殖。

綜上所述，聯(lián)合ISL和DDP可以有效抑制TNBC細(xì)胞的惡性增殖。DDP可直接誘導(dǎo)TNBC細(xì)胞DNA損傷，ISL則可以通過下調(diào)HR修復(fù)相關(guān)蛋白Rad51、BRCA1及BRCA2的表達(dá)來阻遏損傷DNA的修復(fù)。兩者聯(lián)用可協(xié)同促進(jìn)DNA損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。